王國(guó)武，李超，胡嘯玲

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不同濃度七氟醚對(duì)人前列腺癌細(xì)胞增殖與侵襲能力的影響

王國(guó)武，李超，胡嘯玲

摘要：目的觀察不同濃度七氟醚對(duì)人前列腺癌PC3細(xì)胞增殖與侵襲的影響。方法將PC3細(xì)胞隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、Treat1組、Treat2組和Treat3組。對(duì)照組僅通入O2及CO2，Treat1～3組在此基礎(chǔ)上經(jīng)1.7%、3.4%、5.1%七氟醚分別作用2、4、6 h。MTT檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖能力；Transwell法檢測(cè)各組細(xì)胞的侵襲能力；Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與處理前相比，處理2、4和6 h后，人前列腺癌PC3細(xì)胞的增殖和侵襲能力均明顯增強(qiáng)（均P＜0.05），細(xì)胞中HIF-1α的蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)（P＜0.05），且Treat3組＞Treat2組＞Treat1組（P＜0.05）。結(jié)論七氟醚可增強(qiáng)人前列腺癌PC3細(xì)胞的增殖與侵襲能力，且隨著時(shí)間和濃度變化細(xì)胞的增殖與侵襲能力逐漸增強(qiáng)，其機(jī)制可能與上調(diào)HIF-1α的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：前列腺腫瘤；麻醉，吸入；醚類；細(xì)胞增殖；腫瘤侵潤(rùn)；七氟醚；缺氧誘導(dǎo)因子-1α

外科手術(shù)是目前治療惡性實(shí)體瘤的主要方法之一，然而術(shù)后出現(xiàn)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)仍是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的重要原因。因此，在圍手術(shù)期進(jìn)行干預(yù)對(duì)腫瘤患者的預(yù)后具有重要的意義[1]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)麻醉藥物和麻醉技術(shù)對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖具有重要的影響[2-4]。七氟醚是目前臨床上廣泛應(yīng)用的一種吸入麻醉藥物，其具有可控性強(qiáng)、麻醉效能高等特點(diǎn)。因此，七氟醚在全身麻醉中占據(jù)著重要地位。研究發(fā)現(xiàn)，七氟醚能抑制喉癌、結(jié)腸癌、乳腺癌以及肺癌細(xì)胞的增殖與侵襲[5-7]。缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1α在前列腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，通過調(diào)控其下游靶基因血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、促紅細(xì)胞生成素（EPO）、趨化因子受體4（CXCR4）的表達(dá)，從而促進(jìn)人前列腺癌PC3細(xì)胞的增殖與遷移，并抑制腫瘤細(xì)胞的調(diào)亡[8]。然而七氟醚與HIF-1α在前列腺癌中的關(guān)系尚少見報(bào)道。本研究擬通過采用噻唑蘭（MTT）、侵襲實(shí)驗(yàn)以及蛋白免疫印跡（Western blot）分析并探討兩者在前列腺癌中的作用及關(guān)系。

1　材料與方法

1.1材料人前列腺癌PC3細(xì)胞株由南華大學(xué)腫瘤研究所惠贈(zèng)。PRMI1640培養(yǎng)基與胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司。Datex AS/3麻醉氣體監(jiān)測(cè)儀購(gòu)自芬蘭Homeda公司。七氟醚揮發(fā)罐為SEVORANE?型，購(gòu)自美國(guó)Abott公司。倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司。Transwell小室購(gòu)自康寧公司。MTT粉與DMSO購(gòu)自Sigma公司。HIF-1α鼠單克隆抗體與相應(yīng)二抗以及βactin抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。蛋白濃度測(cè)定試劑盒與ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司。硝酸纖維素膜購(gòu)自英國(guó)Amersham Pharmacia公司。CO2培養(yǎng)箱型號(hào)為HF 212 UV，購(gòu)自美國(guó)SHEL-LAB公司。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組與七氟醚處理細(xì)胞根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]預(yù)先在培養(yǎng)板將人前列腺癌PC3細(xì)胞培養(yǎng)達(dá)80%匯合度，將培養(yǎng)板分次置于無菌密閉有機(jī)玻璃箱內(nèi)。玻璃箱兩個(gè)側(cè)壁分別安裝進(jìn)氣口和出氣口，其中進(jìn)氣口連接麻醉機(jī)，出氣口連接麻醉氣體監(jiān)測(cè)儀。將PC3細(xì)胞隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、Treat1組、Treat2組、Treat3組。對(duì)照組通入95%O2與5%CO2混合氣體6 L/min并維持6 h，不進(jìn)行七氟醚處理。Treat1～3組通入95%O2與5%CO2混合氣體6 L/min，并向容器內(nèi)分別輸送1.7%、3.4%和5.1%的七氟醚2、4、6 h。細(xì)胞處理完成后，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.2MTT實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞接種于96孔板中，接種濃度為5× 103/mL，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)至臨近飽和，每孔加滅菌MTT液（5 g/L）20μL，孵育4 h后取出，每孔中加入DMSO150μL，低速振蕩10 min，選擇波長(zhǎng)為570 nm，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔吸光度（A）值，記錄結(jié)果用來反映細(xì)胞增殖情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)在Transwell小室中鋪加適量基質(zhì)膠稀釋液（稀釋濃度1∶8），過夜以成膜。次日取100 μL即含1×105/mL的細(xì)胞稀釋液接種至Transwell小室的上室，下室加500 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后取出，用棉簽擦棄小室上層細(xì)胞，PBS液輕洗，4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶祡染色，PBS液清洗，倒置，晾干。光學(xué)顯微鏡下觀察并攝像，任意讀取4個(gè)高倍視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取平均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4Western blot將4組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后抽提細(xì)胞總蛋白，每組取等量樣本進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉1 h，加入HIF-1α抗體或β-actin抗體，4℃過夜，TBST洗膜，加二抗孵育1 h，洗膜，ECL發(fā)光，X線片曝光、顯影、定影。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以±s表示，組間、組內(nèi)比較采用方差分析，多重比較采用SNK-q法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1PC3細(xì)胞增殖能力的變化與處理前比較，Treat1～3組處理2、4和6 h后，人前列腺癌PC3細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)（P＜0.05），且Treat3組＞Treat2組＞Treat1組（P＜0.05），見表1。

Tab. 1 Comparison of PC3 cell proliferation ability treated with different concentrations of sevoflurane between four groups表1　不同七氟醚濃度組人前列腺癌PC3細(xì)胞增殖能力的比較?。╪=3，±s）

Tab. 1 Comparison of PC3 cell proliferation ability treated with different concentrations of sevoflurane between four groups表1　不同七氟醚濃度組人前列腺癌PC3細(xì)胞增殖能力的比較?。╪=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與同組處理前比較，b與同組處理2 h比較，c與同組處理4 h比較，d與對(duì)照組比較，e與Treat1組比較，f與Treat2組比較，P＜0.05；表2同

組別對(duì)照組Treat1組Treat2組Treat3組F處理前0.447±0.079 0.451±0.014 0.457±0.018 0.466±0.021 0.249處理2 h 0.449±0.015 0.554±0.025ad0.645±0.033ade0.753±0.021adef27.910＊＊組別對(duì)照組Treat1組Treat2組Treat3組F處理4 h 0.460±0.015 0.652±0.018ad0.746±0.033abde0.847±0.018abdef55.590＊＊處理6 h 0.468±0.016 0.746±0.026ad0.845±0.017abcde0.946±0.015abcdef116.375＊＊F 0.469 35.141＊＊39.721＊＊117.912＊＊

2.2PC3細(xì)胞侵襲能力的變化與處理前比較，七氟醚處理2、4和6 h后，人前列腺癌PC3細(xì)胞的侵襲能力明顯增強(qiáng)（P＜0.05），且Treat3組＞Treat2組＞Treat1組（P＜0.05），見表2。

Tab. 2 Comparison of PC3 cell invasion ability treated with different concentrations of sevoflurane between four groups表2　不同七氟醚濃度組人前列腺癌PC3細(xì)胞侵襲能力的比較?。╪=3，個(gè)，±s）

Tab. 2 Comparison of PC3 cell invasion ability treated with different concentrations of sevoflurane between four groups表2　不同七氟醚濃度組人前列腺癌PC3細(xì)胞侵襲能力的比較?。╪=3，個(gè)，±s）

組別對(duì)照組Treat1組Treat2組Treat3組F處理前132±12 135±15 139±10 143±8 0.150處理2 h 136±16 200±16ad264±12ade328±15adef30.951＊＊處理4 h 133±13 263±16ad335±11abde396±16abdef63.493＊＊處理6 h 134±8 324±23ad408±13abcde466±13abcdef90.952＊＊F 0.019 21.087＊＊99.557＊＊108.459＊＊

2.3PC3細(xì)胞HIF-1α表達(dá)的變化與處理前比較，七氟醚處理2、4和6 h后，人前列腺癌PC3細(xì)胞中HIF-1α蛋白的表達(dá)水平明顯上調(diào)，且Treat3組＞Treat2組＞Treat1組，見圖1。

Fig. 1 The expression of HIF-1α protein treated with different concentrations of sevoflurane in four groups圖1不同七氟醚濃度對(duì)HIF-1α蛋白表達(dá)的變化

3　討論

前列腺癌是常見的惡性腫瘤之一。目前臨床上治療前列腺癌以外科手術(shù)為主。在19世紀(jì)80年代，有研究者發(fā)現(xiàn)手術(shù)能促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。近年來，研究者認(rèn)識(shí)到麻醉藥物或麻醉方法對(duì)腫瘤患者預(yù)后以及轉(zhuǎn)歸具有一定影響。七氟醚廣泛應(yīng)用在癌癥手術(shù)中的麻醉維護(hù)或麻醉誘導(dǎo)。七氟醚能誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞、Jurkat T細(xì)胞和H4人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡[9-11]。Liang等[7]研究顯示七氟醚通過下調(diào)XIAP與凋亡抑制基因Survivin并激活caspase-3，從而抑制肺癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。然而，七氟醚在前列腺癌中的生物學(xué)作用以及機(jī)制目前尚未闡明。

本研究采用常用的七氟醚濃度和作用時(shí)間，即1.7%、3.4%、5.1%七氟醚作用人前列腺癌PC3細(xì)胞2、4、6 h，觀察其對(duì)PC3細(xì)胞增殖及侵襲的影響。MTT、侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，PC3細(xì)胞的增殖與侵襲能力隨著時(shí)間和濃度變化逐漸增強(qiáng)。與以前的研究七氟醚能抑制喉癌、結(jié)腸癌、乳腺癌以及肺癌細(xì)胞的增殖與侵襲不相符。本研究提示七氟醚在前列腺癌中可能具有增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與侵襲的作用。研究顯示，HIF-1α在前列腺癌LNCaP細(xì)胞中過表達(dá)可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力[12]。本研究通過Western blot發(fā)現(xiàn)，經(jīng)1.7%、3.4%、5.1%七氟醚分別處理人前列腺癌PC3細(xì)胞2、4、6 h后，與對(duì)照組比較，HIF-1α的蛋白表達(dá)水平隨著時(shí)間和濃度變化逐漸上調(diào)，表明不同濃度七氟醚均能上調(diào)HIF-1α的表達(dá)。

綜上所述，七氟醚通過上調(diào)HIF-1α的表達(dá)，從而促進(jìn)前列腺癌PC3細(xì)胞的增殖與侵襲。如果筆者的研究數(shù)據(jù)能外推到臨床應(yīng)用，七氟醚應(yīng)該避免應(yīng)用于前列腺癌患者的手術(shù)麻醉中。接下來的研究重點(diǎn)將放在構(gòu)建體內(nèi)模型上，以進(jìn)一步驗(yàn)證七氟醚對(duì)前列腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，為臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（2015-01-05收稿2015-07-28修回）

（本文編輯魏杰）

作者單位：衡陽(yáng)，南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科（郵編421001）

The effects of different concentrations of sevoflurane on proliferation and invasion in human prostate cancer cells

WANG Guowu, LI Chao, HU Xiaoling
Department of Anesthesiology, The First Affiliated Hospital, University of South China, Hengyang 421001, China

Abstract:Objective To investigate the effects of different concentrations of sevoflurane on proliferation and invasion in human prostate cancer PC3 cell line. Methods The cells were randomly divided into four groups：control group and three sevoflurane groups (exposed to 1.7%, 3.4% and 5.1% sevollurane for 2, 4 and 6 h respectively). The ability of prolifera?tion and invasion of PC3 cells were evaluated by MTT and Transwell invasion assays. Western blot analysis was performed to detect the protein expression of hypoxia inducing factor 1 alpha (HIF-1α) in PC3 cells. Results The ability of proliferation and invasion of PC3 cells was significantly increased after being exposed to sevollurane for 2, 4 and 6 h (P＜0.05), and the expression of HIF-1α protein in PC3 cells was significantly higher after being exposed to sevollurane for 2，4 and 6 h (P＜0.05), showing the Treat 3 group＞Treat 2 group＞Treat 1 group (P＜0.05). Conclusion Sevoflurane can promote prolifer?ation and invasion in PC3 cells, which are gradually increased with time and concentration of sevoflurane treatment. The mechanism may involve in the up-regulation of HIF-1α expression．

Key words:prostatic neoplasms; anesthesia, inhalation; ethers; cell proliferation; neoplasm invasiveness; sevoflurane; HIF-1α

中圖分類號(hào)：R697+.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI:10.11958/58038

基金項(xiàng)目：湖南省中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目（201250）；衡陽(yáng)市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012KJ46）

作者簡(jiǎn)介：王國(guó)武（1973），男，大學(xué)本科，主要從事臨床麻醉方面研究