高順利，王立忠，劉海英，劉丹莉

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miR-200a靶向調(diào)控AP-2γ表達抑制神經(jīng)母細胞瘤SK-N-AS細胞增殖

高順利，王立忠，劉海英，劉丹莉

摘要：目的明確miR-200a具有靶向調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白（AP）-2γ表達而抑制神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖的能力，進一步揭示miR-200a抗瘤的分子機制。方法通過雙熒光素酶報告基因分析檢測miR-200a對AP-2γ 3′UTR-熒光素酶活性的影響；將miR-200a模擬物轉(zhuǎn)染神經(jīng)母細胞瘤細胞，利用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和蛋白印跡（Western blot）方法檢測AP-2γ表達水平的改變；將AP-2γ shRNA轉(zhuǎn)染SK-N-AS細胞，MTS細胞增殖活性檢測分析干擾AP-2γ表達對神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖能力的影響；將AP-2γ重組質(zhì)粒與miR-200a模擬物共轉(zhuǎn)染神經(jīng)母細胞瘤細胞，通過MTS檢測細胞增殖能力。結(jié)果miR-200a處理組細胞活性(66.33±5.13)與對照組的(100±0)相比，細胞增殖受到明顯抑制（F=114，P＜0.05）。與未轉(zhuǎn)入的相對熒光素酶活性（0.982±0.119）相比，miR-200a轉(zhuǎn)染明顯抑制AP-2γ的3′UTR驅(qū)動的熒光素酶活性（0.624±0.051）。且miR-200a模擬物明顯降低神經(jīng)母細胞瘤細胞中AP-2γ的mRNA和蛋白表達水平；此外，與對照組相比，shRNA干擾AP-2γ表達能明顯抑制SK-N-AS細胞的增殖(62.5±2.4)，它能部分模擬miR-200a的抑制增殖能力。最后，發(fā)現(xiàn)過表達AP-2γ能部分逆轉(zhuǎn)miR-200a對SK-N-AS細胞的增殖抑制作用（92.4±1.4）。結(jié)論miR-200a通過靶向下調(diào)AP-2γ表達而抑制神經(jīng)母細胞瘤細胞的增殖。

關(guān)鍵詞：神經(jīng)母細胞瘤；微RNAs；細胞增殖；AP-2γ；miR-200a

微小RNA(miR)-200家族包括miR-141、miR-429、miR-200a、miR-200b和miR-200c，5個成員，它們具有高度的同源性[1]。在人類中miR-200a定位于1號染色體[2]，miR-200家族可以提高某些癌細胞的增殖能力[3]。小鼠乳腺腫瘤細胞中可以檢測到miR-200家族高表達，過表達miR-200a可使沒有侵襲能力的乳腺癌細胞獲得侵襲能力，然而miR-200a在神經(jīng)母細胞瘤中的功能和作用機制未知[4-5]。本研究采用生物信息學靶基因預(yù)測、逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和免疫印跡（Western blot）等分子生物學技術(shù)，旨在證實miR-200a通過直接靶向調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白（AP）-2γ的mRNA和蛋白質(zhì)表達而抑制神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖，從而揭示miR-200a在神經(jīng)母細胞瘤中的抗瘤功能和分子機制。

1　材料與方法

1.1主要材料RT-PCR試劑盒購自大連寶生物工程公司。miR-200a模擬物及對照模擬物購自Ambion公司。AP-2γ的shRNA購自Santa Cruz公司。AP-2γ的過表達質(zhì)粒、AP-2γ的3′UTR的各種報告基因（Mre vector，Wild-AP-2γ-3′UTR vector，Mut-AP-2γ-3′UTR vector）以及雙報告基因載體購自復能基因公司。雙熒光素酶活性檢測試劑盒購自Promega公司。AP-2γ抗體和β-actin抗體購自CST公司。Trizol和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國life公司。RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清為Gibco公司產(chǎn)品。MTS細胞增殖/毒性檢測試劑盒購自美國Sigma公司。

1.2MTS法檢測細胞增殖活性分別將miR-200a的模擬物和對照模擬物轉(zhuǎn)染至神經(jīng)母細胞瘤SK-N-AS細胞株，或者轉(zhuǎn)染miR-200a的模擬物后過表達AP-2γ的表達質(zhì)粒再轉(zhuǎn)染至神經(jīng)母細胞瘤SK-N-AS細胞株，實驗分為4組。不作任何轉(zhuǎn)染的為空對照組，轉(zhuǎn)染miR-200a模擬物和對照模擬物的分別為miR-200a處理組和對照組，而轉(zhuǎn)染miR-200a的模擬物后過表達AP-2γ的為過表達組。待細胞貼壁過夜后，消化細胞接種于96孔板中，每孔5 000個細胞，每組設(shè)6個復孔，放37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)72 h后，每孔加20 μL MTS檢測試劑，37℃孵育2 h，用酶標儀測定492 nm波長的光密度值(OD492)。增殖活性=（處理組OD492/對照組OD492）×100%。

1.3熒光素酶活性檢測將各種熒光素酶報告質(zhì)粒與miR-200a模擬物共轉(zhuǎn)染SK-N-AS細胞，轉(zhuǎn)染48 h后收獲細胞。按Promega公司雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書在檢測儀檢測細胞熒光素酶活性。其中，對照組轉(zhuǎn)染雙報告基因空白載體；Mre組為轉(zhuǎn)染單純的miR-200a反應(yīng)元件驅(qū)動的熒光素酶報告載體；野生型組和突變型組分別為轉(zhuǎn)染AP-2γ的3′UTR和Mre缺失突變的AP-2γ的3′UTR-熒光素酶報告載體。熒光素酶活性比值=螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。

1.4RT-PCR檢測以轉(zhuǎn)染對照模擬物為陰性對照（miRNC），不轉(zhuǎn)染任何載體的為空對照(Mock)，轉(zhuǎn)染miR-200a模擬物的為miR-200a處理組，而轉(zhuǎn)染AP-2γ-shRNA的為干擾組。細胞總RNA按Trizol試劑盒說明書常規(guī)提取。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按大連寶生物工程公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行，PCR按試劑盒說明書進行，擴增體系50μL。反應(yīng)條件：

95℃5min；95℃15 s；65℃20 s；72℃30 s；30個循環(huán)；72℃10 min。AP-2γ引物：上游5′-TGACCAAGAACCCTCT?GAACCT-3′；下游5′-CCAGGGACTGAGCAGAAGAC-3′，產(chǎn)物88 bp。GAPDH引物：上游5′-ACCCAGAAGACTGTG?GATGG-3′；下游5′-ACGCCTGCTTCACCACCTTC-3′，產(chǎn)物247 bp。

1.5Western blot實驗分為以轉(zhuǎn)染對照模擬物為陰性對照（miR-NC），不轉(zhuǎn)染任何載體的為空對照(Mock)，轉(zhuǎn)染miR-200a模擬物組（miR-200a處理組），或AP-2γ shRNA轉(zhuǎn)染組（干擾組）和AP-2γ過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（過表達組），分別在48 h后提取細胞總蛋白或96 h后采用MTT法分析細胞增殖活性，并用BCA法測定蛋白濃度。各組取等量樣本，進行SDS-PAGE凝膠電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5% BSA封閉，加入AP-2γ抗體或GAPDH抗體，4℃過夜。TBST洗膜30 min，加入二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜30 min，加入ECL發(fā)光劑，X線片曝光、顯影、定影。

1.6統(tǒng)計學方法采用Graphpad Prism 5.0軟件進行統(tǒng)計學分析。所有結(jié)果均以均數(shù)±標準差（x ±s）表示。組間比較采用方差分析，多重比較采用LSD-t法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1miR-200a抑制神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖3組間細胞增殖活性差異有統(tǒng)計學意義（F=114，P＜0.01），miR-200a處理組(66.33±5.13)與對照組的(100±0)相比，受到明顯抑制（P＜0.05），而空對照組的細胞增殖活性（101±2.00）與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2熒光素酶活性檢測結(jié)果人類AP-2γ的基因3′UTR上含有一個miR應(yīng)答元件，能夠與miR-200a相互作用，介導其轉(zhuǎn)錄調(diào)控，見圖1。轉(zhuǎn)染各種熒光素酶報告基因和miR-200a模擬物后，與對照組相比，野生型組和Mre組的熒光素酶活性比值顯著下降，而突變型組的熒光素酶活性比值沒有明顯變化，見表1。

Fig. 1 Schematics of the target genes of miR-200a and the luciferasereport constructs圖1　miR-200a作用的靶基因示意圖以及各種熒光素酶報告載體構(gòu)建示意圖

Tab. 1 miR-200a regulates luciferase activity driven by AP-2γ 3′UTR report constructs mediated by binding to the MRE element of promotor of AP-2γ表1　Mre元件介導了miR-200a對AP-2γ的3′UTR驅(qū)動的熒光酶活性調(diào)控

2.3miR-200a下調(diào)AP-2γ的mRNA和蛋白表達水平轉(zhuǎn)染miR-200a組的AP-2γ mRNA和蛋白表達水平較對照組明顯降低，并且其下調(diào)水平與AP-2γ干擾組的大致相當，見圖2、3。

Fig. 2 AP-2γ mRNA expression detected by RT-PCR圖2　RT-PCR檢測AP-2γ的mRNA表達

Fig. 3 AP-2γ protein expression detected by Western blot assay圖3　Western blot檢測AP-2γ的蛋白表達

2.4下調(diào)AP-2γ表達可抑制神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖轉(zhuǎn)染AP-2γ shRNA的SK-N-AS細胞AP-2γ蛋白的表達受到明顯抑制，見圖4。3組細胞增殖活性比較差異有統(tǒng)計學意義（F=282.0，P＜0.01），與對照組（100±0）相比，轉(zhuǎn)染AP-2γ shRNA的神經(jīng)母細胞增殖活性（62.5±2.4）受到明顯抑制（P＜0.05），而空對照組的（101.0±3.1）沒有明顯改變（P＞0.05）。

Fig. 4 Down-regulation of AP-2γ in neuroblastoma cells SK-N-AS by shRNA of AP-2γ transfection圖4　AP-2γ-shRNA轉(zhuǎn)染神經(jīng)母細胞SK-N-AS中下調(diào)AP-2γ的表達

2.5過表達AP-2γ逆轉(zhuǎn)miR-200a對神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖抑制miR-200a明顯抑制AP-2γ的表達，而AP-2γ過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染拮抗miR-200a對AP-2γ的表達抑制，見圖5。相對于空對照組的細胞活性（100±0），miR-200a處理組細胞增殖活性為81.2± 1.2，下降了近19%，而AP-2γ過表達組的增殖活性為92.4±1.4，逆轉(zhuǎn)了miR-200a的抑制效應(yīng)（F= 236.5，P＜0.01）。

Fig. 5 Over-expression of AP-2γ reversed down-regulation effects of miR-200a to AP-2γ expression in SK-N-AS cells圖5　過表達AP-2γ逆轉(zhuǎn)miR-200a對AP-2γ的下調(diào)

3　討論

miR在神經(jīng)母細胞瘤中的作用越來越引起了人們的重視。許多報道揭示miR作為一類新型基因調(diào)控分子，與神經(jīng)母細胞瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6]。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-200a和（或）下調(diào)AP-2γ表達能抑制神經(jīng)母細胞瘤細胞的增殖。而過表達AP-2γ能部分逆轉(zhuǎn)miR-200a對神經(jīng)母細胞瘤細胞的增殖抑制作用。說明miR-200a可通過靶向調(diào)控AP-2γ表達抑制神經(jīng)母細胞瘤增殖。同時也提示，除AP-2γ外，miR-200a還可能通過其他的靶基因來調(diào)控神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖。本研究揭示了miR-200a在神經(jīng)母細胞瘤中的抑瘤分子機制，與Yo?neyama等[7]的報道一致。也有研究報道m(xù)iR-200a可以通過直接靶向調(diào)控MACC1的轉(zhuǎn)錄進而影響肝癌的生長[8]。結(jié)合以上的結(jié)果可以認為，miR-200a可以通過直接靶向不同的靶基因表達影響不同腫瘤細胞的生長，那么miR-200a影響不同腫瘤的生長具有細胞株的特異性，其特異性產(chǎn)生的分子機制不明了，關(guān)于這方面的研究缺乏報道，值得今后去探討。

AP-2蛋白是一類非常重要的轉(zhuǎn)錄因子，其家族通過與其靶基因啟動子上的作用元件結(jié)合而控制許多靶基因的特異性表達,從而調(diào)控胚胎發(fā)育、細胞增殖、分化、遷移和凋亡等多種生物過程[9-11]。AP-2γ與腫瘤基因的不穩(wěn)定性和腫瘤細胞的增殖、抗凋亡、侵襲、藥物抵抗密切相關(guān)，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[12]。本研究也發(fā)現(xiàn)敲低AP-2γ的表達可以明顯抑制骨肉瘤細胞的生長和遷移，這與文獻[13]的報道類似。但是也有研究認為AP-2γ的低表達可以促進乳腺癌細胞的生長和遷移[11]。其具體的分子機制不清楚，筆者推測AP-2γ在不同腫瘤細胞中發(fā)揮了促癌和抑制癌細胞生長的作用，可能與其調(diào)控的靶基因有關(guān)，而在本研究中AP-2γ通過影響該靶基因的表達進而調(diào)控神經(jīng)母細胞瘤細胞的生長和遷移，有待下一步的研究去闡明。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-200a靶向下調(diào)AP-2γ的表達，進而抑制神經(jīng)母細胞瘤細胞的生長，而過表達AP-2γ能部分逆轉(zhuǎn)miR-200a對神經(jīng)母細胞瘤細胞的增殖抑制作用。提示miR-200a可部分通過靶向調(diào)控AP-2γ表達抑制神經(jīng)母細胞瘤增殖，在miR-200a影響神經(jīng)母細胞瘤生長的分子機制中，可能通過多個途徑實現(xiàn)。

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（2015-07-28收稿2015-11-02修回）

（本文編輯魏杰）

實驗研究

作者單位：湖南衡陽，南華大學附屬第一醫(yī)院兒科（郵編421001）

miR-200a inhibits cell proliferation by targeting AP-2γ expression in neuroblastoma cells SK-N-AS

GAO Shunli, WANG Lizhong, LIU Haiying, LIU Danli
Department of Pediatrics, the First Affiliated Hospital, University of South China, Hengyang, Hunan 421001, China

Abstract:Objective To investigate whether miR-200a suppresses cell proliferation by targeting AP-2γ expression, and reveal molecular mechanism that miR-200a functions as a tumor-suppressor in neuroblastoma cells. Methods Dualluciferase reporter gene assay was employed to examine the effect of miR-200a on AP-2γ promotor luciferase activity. Neu?roblastoma cells were transfected with miR-200a mimics, and the expressions of AP-2γ mRNA and protein were detected by RT-PCR and Western blot assay. The effects of AP-2γ down-regulation on cell proliferation were observed after AP-2γ shRNA was transfected into neuroblastoma cells. Neuroblastoma cell proliferation was detected by MTS assay after being cotransfected with miR-200a mimics and AP-2γ plasmid. Results Results showed that miR-200a could inhibit proliferation of neuroblastoma cells at cell viability (66.33±5.13) compared with that of control group (100±0), and also miR-200a can bind to the 3′untranslated region of AP -2γ promotor and inhibit its luciferase activity with an inhibit ratio at (0.624±0.051). AP-2γ mRNA and protein expressions were significantly down-regulated when miR-200a was over-expressed in neuroblas?toma cells. Furthermore, results showed that shRNA-mediated down-regulation of AP-2γ that suppressed the cell prolifera?tion of neuroblastoma at (62.5±2.4) by comparing with the control group (100±0). Moreover, restoring AP-2γ expression re?versed the effect of miR-200a with a cell viability suppression at (92.4±1.4). ConclusionmiR-200a suppresses cell prolif?eration by targeting AP-2γ expression in neuroblastoma cells.

Key words:neuroblastoma; microRNAs; cell proliferation; AP-2γ; miR-200a

中圖分類號：R748

文獻標志碼：A

DOI：10.11958/56744

基金項目：湖南省教育廳課題（13C802）

作者簡介：高順利（1976），女，兒科副主任醫(yī)師，碩士研究生，主要從事兒科腫瘤及呼吸系統(tǒng)疾病方面研究