麻曉鴿，王松濤，覃飛，貢文武24

（華南師范大學(xué) 體育科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510006）

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不同強度激光對遞增負(fù)荷運動大鼠心臟炎性損傷和CD8+T淋巴細(xì)胞表達(dá)的影響

麻曉鴿，王松濤，覃飛，貢文武24

（華南師范大學(xué) 體育科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510006）

摘 要：觀察遞增負(fù)荷運動大鼠心臟炎癥損傷和CD8+T淋巴細(xì)胞的改變及其關(guān)系，探討不同強度激光治療對大強度運動心臟的保護(hù)作用。8周齡雄性SD大鼠隨機分為對照組（C），54只；實驗組54只，分為低強度激光+運動組（LE）、高強度激光+運動組（HE）、運動組（E），每組18只。各組分別在2、4、6周末時取材，評定大鼠心臟系數(shù)、心臟整體形態(tài)、心肌病理積分、心肌CD8+T淋巴細(xì)胞及心肌細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果：與C組比較，E組大鼠6周末時心肌細(xì)胞呈現(xiàn)明顯炎性浸潤，心肌纖維扭曲、腫脹及斷裂，病理積分呈顯著性差異（P＜0.05）；大鼠血清TNF-α增加、心肌CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤、心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)增加呈非常顯著性差異（P＜0.01）。同時期（2、4、6周末）LE組與E組比較，心肌細(xì)胞炎性略輕。6周末時LE組CD8+T淋巴細(xì)胞及心肌細(xì)胞凋亡數(shù)較C組均上升，而較E組均非常顯著性下降（P＜0.01）。結(jié)果說明低激光治療可在一定程度上減輕心肌內(nèi)炎癥浸潤和致炎性因子，降低心肌病理程度，抑制心肌細(xì)胞的凋亡進(jìn)程。

關(guān) 鍵 詞：運動醫(yī)學(xué)；心肌炎性損傷；遞增負(fù)荷運動；低強度激光；CD8+T淋巴細(xì)胞；大鼠

科學(xué)合理的運動訓(xùn)練可使心臟產(chǎn)生良好的適應(yīng)，提高心肌功能，而不當(dāng)?shù)拇髲姸冗\動或訓(xùn)練則可對機體造成不同程度的損傷，尤其是心臟作為最敏感的動力泵血器官，易產(chǎn)生病理性心肌損傷。已有研究證實，重復(fù)性的大強度應(yīng)力刺激會導(dǎo)致心肌炎癥、心肌纖維化、心衰和室壁運動異常等［1］。心肌細(xì)胞凋亡及局部炎癥因子浸潤可能是導(dǎo)致大強度運動誘發(fā)心肌損傷和心功能障礙的重要機制之一［2］。有的研究也證實免疫系統(tǒng)和炎癥在多種代謝性疾病，如胰島素抵抗、2型糖尿病、動脈粥樣硬化、非酒精性脂肪肝等疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用［3］。因此，炎癥可能是心血管疾病和大強度運動所致心功能異常的重要啟動因素。T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫是機體致病的重要機制，其介導(dǎo)的細(xì)胞免疫形式主要是CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)及CD8+T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性反應(yīng)，而CD8+T淋巴細(xì)胞在多種免疫性及炎癥性疾病，如獲得性免疫缺陷綜合征、腫瘤等的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。但目前，CD8+T淋巴細(xì)胞在心肌細(xì)胞病變中的免疫調(diào)節(jié)作用仍然不清。因此，探討大強度遞增負(fù)荷運動導(dǎo)致的心肌損傷及其相關(guān)免疫調(diào)節(jié)機制，對于解決運動醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的相關(guān)疾病和健康問題均具有重要意義。激光醫(yī)學(xué)的發(fā)展促進(jìn)了運動醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)す獾闹匾?。激光束作用于生物組織時，不會造成生物組織不可逆的損傷，但可刺激機體產(chǎn)生一系列生理生化反應(yīng)，對組織或機體起到調(diào)節(jié)、增強或抑制作用。低強度激光（Low-level laser therapy，LLLT）在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、減緩疼痛、抑制深層組織損傷等方面療效已得到公認(rèn)［4-5］，而運動性心肌損傷的激光調(diào)節(jié)作用，目前尚缺乏研究。綜上所述，我們推測低強度激光可能會在調(diào)節(jié)大強度遞增負(fù)荷運動所致心臟結(jié)構(gòu)和功能性異常中發(fā)揮重要作用，其機制可能涉及CD8+T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥性免疫反應(yīng)。因此，本研究在大鼠遞增負(fù)荷運動模型基礎(chǔ)上，通過檢測炎癥因子TNF-α、心肌組織學(xué)改變、心肌CD8+T淋巴細(xì)胞表達(dá)和心肌細(xì)胞凋亡等情況，揭示大負(fù)荷運動所致的心肌炎癥性損傷，并探討CD8+T淋巴細(xì)胞在其中的調(diào)控機制。同時，采用兩種不同強度的激光（低強度和高強度）進(jìn)行干預(yù)治療，進(jìn)一步探索不同強度激光對遞增負(fù)荷大鼠心肌炎性改變和CD8+T淋巴細(xì)胞表達(dá)的影響，為運動性心臟損傷的保護(hù)提供相應(yīng)的干預(yù)靶點及實驗支持。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象及分組

108只SPF 8周齡雄性SD大鼠（廣東省中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，許可證號：SCXK（粵）2008-0020；NO:0043379，粵監(jiān)證字F2008A002，體重180～200 g）。分籠飼養(yǎng)，每籠4～5只，溫度（24±2） ℃，相對濕度45%～65%，自然光照，自由攝取食物和水。動物處置符合《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》（2006，科技部）。

大鼠隨機分為對照組（C，54只），正常喂養(yǎng)，不運動，用于判別大鼠生長對實驗指標(biāo)的影響。實驗組54只分為低強度激光+運動組（LE，18只）、高強度激光+運動組（HE，18只）、運動組（E，18只）3組，分別進(jìn)行遞增負(fù)荷運動和激光治療干預(yù)。各組在第2、4、6周末時隨機抽樣，取材測定相關(guān)指標(biāo)。

1.2 運動方案

運動組和激光治療組大鼠進(jìn)行逐級遞增負(fù)荷跑臺運動訓(xùn)練6周，坡度為0°，30 min/次，1次/d，6 d/周（周日休息）。第1周運動負(fù)荷為10 m/min，第2周負(fù)荷遞增至20 m/min，隨后每周遞增負(fù)荷量為5 m/min，至第6周，跑臺速度達(dá)到40 m/min最大負(fù)荷強度。

1.3 激光治療方案

激光治療采用He-Ne半導(dǎo)體激光治療儀，每天在大鼠運動后2 h，分別采用低強度（1 mW，6.79 J/cm2）和高強度（2 mW，13.58 J/cm2）激光，在大鼠鼻翼兩側(cè)照射2 min。

1.4 測試指標(biāo)及方法

主要試劑：R-TNF-α試劑盒（Multisciences，中國）；CD8+T細(xì)胞試劑盒（Abcam，UK）；TUNEL凋亡檢測試劑盒（Roche，USA）。

1）組織取材：大鼠末次運動后休息1 d，隔日晨質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%水合氯醛（3.5～4.5 mL/kg）腹腔注射麻醉，打開腹腔，腹主動脈取血，靜置后離心取血清，-80 ℃保存待測。立即取出心臟放入預(yù)冷的生理鹽水中，洗去血跡，去除結(jié)締組織，用濾紙吸干，分別記錄心臟質(zhì)量（Hw）與體質(zhì)量分?jǐn)?shù)（Bw）；后放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的中性甲醛內(nèi)固定，待HE及免疫組化分析。

2）大鼠心肌組織切片、HE染色及病理學(xué)檢測：心肌組織切片經(jīng)過常規(guī)HE染色，觀察心肌纖維變化及心臟組織炎癥細(xì)胞浸潤情況；參照Rezkalla［6］的方法計算心肌病理組織學(xué)積分，即每張切片隨機取5個400倍視野，計算每個視野中炎性細(xì)胞浸潤及壞死面積與整個面積的比值。無病變計0分、病變面積＜25%計1分、25%～50%計2分、50%～75%計3分、＞75%計4分，以此判定心肌炎癥的變化情況。

3）免疫組化法（SP法）檢測心肌組織中CD8+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)：常規(guī)脫蠟、水化，枸櫞酸修復(fù)液高壓抗原修復(fù)5～8 min。質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%H2O2室溫下孵育15 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶活性，PBS洗滌，滴加鼠抗兔CD8+T細(xì)胞（1∶100）單克隆抗體。4 ℃冰箱過夜，PBS洗滌，均勻滴加生物素標(biāo)記的抗鼠IgG抗體-HRP多聚體，37 ℃孵育20 min，PBS洗滌，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。陰性對照組采用PBS代替一抗，其他步驟相同。光鏡下觀察，每張片子隨機選取10個400倍視野，每個視野計算陽性細(xì)胞數(shù)目（陽性細(xì)胞為胞膜棕黃染色），并將CD8+T淋巴陽性細(xì)胞所占浸潤炎癥細(xì)胞數(shù)的平均百分比作為陽性細(xì)胞百分率。

4）TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡：切片脫蠟、水化，PBS沖洗后蛋白酶K消化，TDT酶/生物素-dUTP反應(yīng)液等處理，具體嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作。光鏡下正常細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色。結(jié)果判定：隨機選取10個400高倍視野的心肌細(xì)胞總數(shù)及陽性染色心肌細(xì)胞數(shù)目，按照Nsrula方法計算，公式：陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%計算心肌細(xì)胞凋亡百分率。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件處理，測試結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。正態(tài)性檢驗采用Kolmogorov-Smirnov Test法；方差齊性檢驗采用Homogeneity of Variances法。正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（one-way ANOVA），若方差齊性，以最小顯著差法（LSD法）進(jìn)行兩兩比較；若方差不齊，以Dennett’s T3法進(jìn)行兩兩比較。

2 研究結(jié)果及分析

2.1 六周遞增負(fù)荷運動大鼠心肌炎性改變

實驗中對照組（C）大鼠正常喂養(yǎng)，不運動，用于判別生長對大鼠實驗指標(biāo)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組各指標(biāo)（心肌組織病理檢測，細(xì)胞因子TNF-α、心肌CD8+T淋巴細(xì)胞和心肌凋亡指數(shù)）在各周之間無顯著性差異（P＞0.05），提示6周的自然生長周期對上述各指標(biāo)均無顯著影響。但與對照組（C）比較，6周遞增負(fù)荷運動（E）可導(dǎo)致大鼠心肌呈現(xiàn)顯著的炎性改變（見表1）

表1　遞增負(fù)荷運動所致心肌炎性改變（±s）

表1　遞增負(fù)荷運動所致心肌炎性改變（±s）

與C組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01

組別 　n/只 　　心肌病理積分 　Ρ（TNF-α）/（pg·mL-1）　CD8+T淋巴細(xì)胞百分率/% 心肌細(xì)胞凋亡率/% C 　6 　0 　11.18±5.53 　0.34±0.12 　0.88±0.23 E 　6 　2.93±0.561）　15.06±3.3 　22.88±5.072）　52.12±7.142）差值 　6 　2.93±0.56 　3.88±2.69 　22.53±5.02 　51.24±7.14

2.2 激光對6周遞增負(fù)荷運動大鼠心肌炎性損傷的影響

1）心臟重量及心臟系數(shù)。

研究結(jié)果顯示不同時間點（2、4、6周）的低強度激光治療組（LE）的心臟質(zhì)量、體質(zhì)量和心臟系數(shù)均低于同時間段的HE和E組，尤其是6周的E組大鼠心臟質(zhì)量、體質(zhì)量都較2周的HE組和6周的LE組高，差異非常顯著（P＜0.01）；其他組之間差異則不顯著（見表2）。

表2　激光對6周遞減運動負(fù)荷小鼠心臟質(zhì)量、體質(zhì)量和心臟系數(shù)的影響（±s）

表2　激光對6周遞減運動負(fù)荷小鼠心臟質(zhì)量、體質(zhì)量和心臟系數(shù)的影響（±s）

1）各組2周與4周比較，P＜0.05；2）4周與6周比較，P＜0.05；3）2周與6周比較，P＜0.05；4）2周與6周比較，P＜0.01；5） E組與LE組比較，P＜0.05；6）LE與HE比較，P＜0.01

心臟質(zhì)量/g 　 　　體質(zhì)量/g 　　心臟系數(shù)組別n/ 只 　2周 　4周 　6周 　2周 　4周 　6周 　2周 　4周 　6周E 　6 　1.012 4± 0.135 0 1.066 9± 0.122 7 1.116 1± 0.151 8 278± 17.81 288.83± 25.33 317.4± 16.473）0.003 64± 0.000 358 0.003 69± 0.000 214 0.003 52± 0.000 346 LE 　6 　0.968 1± 0.045 4 1.093 5± 0.064 4 0.940 0± 0.0516 12）5）273.17± 22.5 308.25± 18.151）307.17± 16.193）0.003 56± 0.000 202 0.003 55± 0.000 206 0.003 06± 0.000 195 HE 　6 　1.012 2± 0.084 7 1.123 7± 0.125 8 1.249 4± 0.207 94）6）274± 23.58 295± 28.71 327.4± 48.424）0.003 71± 0.000 377 0.003 84± 0.000 579 0.003 90± 0.000 9606）

2）心肌組織病理學(xué)。

心肌組織切片經(jīng)過HE染色，參照Rezkalla等［6］的方法計算心肌病理組織學(xué)積分。結(jié)果見圖1、表3。

研究發(fā)現(xiàn)正常（C）組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞橫紋清晰，胞漿嗜酸性染色，胞核完整，肌原纖維排列整齊，纖維互聯(lián)呈網(wǎng)狀，間質(zhì)細(xì)胞正常，無病理改變。

隨運動周期的增加，從第2周末開始，E組大鼠心肌開始呈現(xiàn)變形性壞死，肌原纖維扭曲，并呈現(xiàn)波浪狀樣改變。大鼠心肌炎癥程度和病理損傷程度隨運動負(fù)荷遞增不斷加深，6周末E組大鼠心肌細(xì)胞炎性浸潤表現(xiàn)最為明顯，心肌組織可見大量浸潤炎癥細(xì)胞，肌原纖維腫脹、扭曲變樣，并有散在性的局灶性壞死區(qū)，部分融合成片（黑色箭頭所示）。

而LE組大鼠心肌相較同時期的E組大鼠心肌細(xì)胞炎性表達(dá)相對較輕，但至6周末，心肌細(xì)胞內(nèi)仍然存在條索狀的細(xì)胞核聚集現(xiàn)象。HE組大鼠心肌細(xì)胞炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象與同期E組比，有輕微改善，但仍可見大量炎性細(xì)胞浸潤，心肌纖維斷裂，壞死病變廣泛。低、高強度的激光治療都可在一定程度上改善同時期大鼠心肌細(xì)胞損傷病變，但尚不能完全逆轉(zhuǎn)由遞增跑臺運動所致的炎性浸潤現(xiàn)象（見圖1）。

其病理程度評分見表3，運動組（E）心肌炎癥表達(dá)在2周末時較輕，但4周末時心肌的炎癥因子表達(dá)面積已超過25%，評分大于1，到了6周末心肌炎癥病變面積增加到50%左右，病理積分達(dá)2.93±0.56（P＜0.01），說明隨運動負(fù)荷和訓(xùn)練期限的增加，心肌炎性變化不斷累積。但是LE和HE組的心肌病變程度比同一階段（4周、6周）的E組輕（P＜0.01），且LE組心肌病理積分明顯低于HE組（P＜0.01）。

圖1　大鼠心肌組織病理切片（HE染色40×10）

表3　大鼠心肌病理積分（±s）

表3　大鼠心肌病理積分（±s）

時間點 　E組 　LE組 　HE組2周末 　0.52±0.22 　0.43±0.18 　0.48±0.13 4周末 　1.17±0.231）　1.01±0.271）　1.14±0.271）6周末 　2.93±0.562）3）　2.01±0.262）3）4）　2.45±0.412）3）5）6）

1）2周與4周比較，P＜0.01；2）4周與6周比較，P＜0.01；3）2周與6周比較，P＜0.01；4）E組與LE組比較，P＜0.01；5）LE與HE組比較，P＜0.01；6）E組與HE組比較， P＜0.01

3）細(xì)胞因子TNF-α。

從兩者的變化趨勢上看，隨著運動強度和訓(xùn)練期限的增加，E組的TNF-α表達(dá)量在4周末時上升至最高（P＜0.01），卻在6周末時稍微回落。不同時間段（2、4、6周）LE組的TNF-α表達(dá)量均低于E和HE組。但LE和HE組，隨著運動時間的延長，TNF-α的表達(dá)量在4周末時升至最高（P＜0.01），6周末時稍微降低，但仍與2周末時存在非常顯著性差異（P＜0.01）（見表4）。

表4　大鼠TNF-α的變化（±s）

表4　大鼠TNF-α的變化（±s）

1）2周與4周組比較， P＜0.05；2）2周與4周比較，P＜0.01；3）2周與6周組比較，P＜0.05，4）2周與6周比較，P＜0.01

時間點 　E組 　LE組 　HE組2周末 　9.23±7.72 　5.61±3.70 　7.39±3.20 4周末 18.12±5.062）15.32±2.002）15.99±4.431）6周末 15.06±3.303）14.54±1.994）　14.75±4.963）

4）心肌CD8+T細(xì)胞。

從圖2看出，E組大鼠心肌組織中可見棕黃色的CD8+T淋巴細(xì)胞，且多分布于變性壞死的心肌細(xì)胞周圍，6周末E組心肌組織中仍可見大量顏色較深的黃色顆粒呈團(tuán)簇狀分布（（22.81±5.07）%，P＜0.01），提示CD8+T細(xì)胞浸潤明顯增多，心臟損傷嚴(yán)重。

LE組大鼠心肌組織中CD8+T淋巴細(xì)胞陽性表達(dá)量從2周末開始逐漸增加，但較同時期的E組（2、4、6周）而言，陽性表達(dá)量明顯較低（P＜0.01）。而相對于HE組，同周期的CD8+T淋巴細(xì)胞的陽性表達(dá)量基本與LE組持平，卻又低于E組（P＜0.01），說明兩種強度的激光治療都可減緩心肌組織炎性表達(dá)（見表5）。

圖2　大鼠心肌CD8+T淋巴細(xì)胞免疫組化染色（40×10）

表5　大鼠CD8+ T淋巴細(xì)胞百分率（±s） %

表5　大鼠CD8+ T淋巴細(xì)胞百分率（±s） %

時間點 　E組 　LE組 　HE組2周末 5.43±1.08 　2.61±0.604）　3.15±0.47 4周末 13.03±2.031）　4.15±0.694）　6.55±1.401）5）7）6周末 22.81±5.072）3）　10.75±1.872）3）4）　15.32±2.012）3）4）6）7）

1）2周與4周組比較， P＜0.01；2）4周與6周組比較， P＜0.01；3）2周與6周組比較， P＜0.01；4）E組與LE組比較， P＜0.01；5）LE組與HE組比較，P＜0.05，6）LE組與HE組比較，P＜0.01；7）E組與HE組比較，P＜0.01

5）心肌細(xì)胞凋亡率。

運用TUNEL法進(jìn)行原位末端標(biāo)記與光鏡下觀察，同時參照Nsrula計算公式，計算出陽性細(xì)胞表達(dá)量（見表6）。結(jié)果顯示隨運動強度和期限增加，E組大鼠的心肌細(xì)胞凋亡率逐漸增加，尤其是到了6周末，表現(xiàn)最為嚴(yán)重（（52.12±7.14）%，P＜0.01），細(xì)胞排列雜亂無序，胞核破裂溢出，凋亡細(xì)胞出現(xiàn)明顯的核濃縮及破裂現(xiàn)象，呈現(xiàn)陽性深褐色著染。

LE組心肌細(xì)胞凋亡率相與同期的E組（4、6周末）比較，相對較?。≒＜0.01），但隨運動強度增加心肌凋亡率亦增大，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞排列相對松散，單陽性細(xì)胞著色相對于運動組較淺。HE組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率隨運動強度增加而逐漸增加，相對于E組輕，但高于LE組（6周末時，P＜0.01），提示兩種強度激光照射均可抑制心肌細(xì)胞凋亡，但HE組抑制心肌細(xì)胞凋亡的效果次于LE組。

表6　大鼠心肌細(xì)胞凋亡率（±s） %

表6　大鼠心肌細(xì)胞凋亡率（±s） %

1）2周與4周組比較，P＜0.01；2）4周與6周組比較，P＜0.01；3）2周與6周組比較，P＜0.01；4）E組與LE比較， P＜0.01；5）LE與HE組比較， P＜0.01

時間點 　E組 　LE組 　HE組2周末 　21.14±5.03 　15.72±4.27 　17.15±3.33 4周末 　42.04±6.221）　29.28±5.461）4）　38.12±7.281）6周末 　52.12±7.142）3）43.54±6.702）3）4）　48.65±7.312）3）5）

3 討論

研究指出，過度運動負(fù)荷或過度訓(xùn)練可使心肌細(xì)胞排列紊亂，甚至部分?jǐn)嗔眩瑢?dǎo)致收縮力下降［7］。動物實驗也表明，不同強度耐力訓(xùn)練的大鼠心肌細(xì)胞表現(xiàn)出不同程度的凋亡現(xiàn)象，尤其是持續(xù)的大強度運動訓(xùn)練可使心肌細(xì)胞產(chǎn)生不可逆的病理性改變［8］。本實驗發(fā)現(xiàn)，隨著運動負(fù)荷的逐漸增加和訓(xùn)練期限的延長，大鼠心肌纖維斷裂、腫脹，炎性因子TNF-α表達(dá)，及心肌細(xì)胞凋亡也逐漸增多，說明長期大負(fù)荷遞增運動可導(dǎo)致心肌炎性細(xì)胞浸潤，誘發(fā)炎癥性損傷。炎癥細(xì)胞可釋放各種細(xì)胞因子，通過不同的促炎及抗炎途徑調(diào)節(jié)心肌組織對各種應(yīng)激因素的應(yīng)答反應(yīng)。本研究觀察了CD8+T淋巴細(xì)胞以及細(xì)胞因子TNF-α在長期遞增負(fù)荷運動誘導(dǎo)的心肌損傷中的作用，分析運動性心肌損傷的免疫調(diào)節(jié)機制。

TNF-α是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵成分，過量的TNF-α可介導(dǎo)免疫損傷及一些嚴(yán)重的病理生理過程。TNF-α主要由心肌單核-巨噬細(xì)胞及心肌細(xì)胞產(chǎn)生，心臟既是TNF-α的產(chǎn)生場所，同時也是其作用的靶器官，可參與多種心臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程，且心肌產(chǎn)生的TNF-α足以造成嚴(yán)重的心肌疾病［9］。本研究發(fā)現(xiàn)6周遞增負(fù)荷運動過程中，TNF-α表達(dá)呈增加趨勢，4周時達(dá)最高。結(jié)合同時期的心肌病理學(xué)變化，提示TNF-α參與了遞增負(fù)荷運動過程中心肌的炎癥反應(yīng)，在其發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。6周遞增負(fù)荷運動，由于運動負(fù)荷的不斷增加導(dǎo)致大鼠心肌組織內(nèi)炎癥累積，進(jìn)而產(chǎn)生相應(yīng)的病理性改變。TNF-α作為一種炎癥前細(xì)胞因子，其升高可激活淋巴細(xì)胞增殖分裂，活化巨噬細(xì)胞、趨化各種炎性細(xì)胞，如調(diào)節(jié)IL-1 和IL-6等的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)中性粒細(xì)胞在心肌內(nèi)的黏附、聚集，并釋放可溶性介質(zhì)，導(dǎo)致心肌微血管的阻塞和心肌損傷不斷加重［10-11］。綜上所述，組織內(nèi)免疫細(xì)胞因子TNF-α的升高，不僅抑制心肌細(xì)胞正常的生理功能，還可導(dǎo)致心肌細(xì)胞出現(xiàn)自身損害加重、心臟重構(gòu)等病理性變化。

本研究采取激光照射作為大強度遞增負(fù)荷運動心肌炎性損傷的干預(yù)手段，選取鼻翼兩側(cè)激光照射的處理方式，因鼻腔內(nèi)血管相對豐富，鼻黏膜下層有多支血管構(gòu)成網(wǎng)狀血管層，且鼻黏膜和鼻腔內(nèi)的小血管壁都較薄弱，因此激光較易穿透組織而作用于血細(xì)胞，以達(dá)到治療的目的。既往研究均證實低強度激光（Low-level laser therapy，LLLT）在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、減緩疼痛、抑制深層組織損傷等方面都具有良好療效［12］，且運動后激光照射可以減輕運動所致的肌肉損傷及炎癥反應(yīng)［13］。結(jié)合本研究發(fā)現(xiàn)，激光照射組（LE和HE）大鼠血清中TNF-α相較同時期的E組減少，而此時心肌內(nèi)的炎癥細(xì)胞表達(dá)亦減少，心肌病理積分相對E組降低，說明心肌組織由壞死后炎癥反應(yīng)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樾募〗M織的修復(fù)，提示激光治療可在心肌損傷的緩解、修復(fù)和改善中發(fā)揮重要作用。本研究也與大部分臨床心血管疾病研究結(jié)果一致，證明低強度激光治療可減輕機體的炎癥反應(yīng)，減少炎癥細(xì)胞浸潤及炎癥因子的表達(dá)量，達(dá)到保護(hù)心肌的目的［14］，其機制可能是激光束發(fā)射的近紅外光子可增加ROS表達(dá)和NO釋放量，激活轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB信號通路，促進(jìn)細(xì)胞存活、增殖和遷移［15-16］；相反高強度激光卻具有一定的抑制效應(yīng)［17］。

Nishimura［18］研究發(fā)現(xiàn)，CD8+T細(xì)胞在組織炎癥發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，可通過分泌趨化因子，激活巨噬細(xì)胞引起炎癥，誘導(dǎo)MHC-I類分子表達(dá)，這可能是心肌成纖維細(xì)胞表型發(fā)生轉(zhuǎn)變的始動環(huán)節(jié)，激活免疫應(yīng)激反應(yīng)，最終誘導(dǎo)心肌朝著纖維化的方向發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)CD8+T淋巴細(xì)胞在正常大鼠心肌組織內(nèi)不表達(dá)或低表達(dá)狀態(tài)［19］，但隨運動負(fù)荷遞增，CD8+T淋巴細(xì)胞在心肌組織中表達(dá)量明顯升高。Khan［20］指出心肌炎癥的發(fā)展進(jìn)程及嚴(yán)重程度均取決于T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，TH細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要調(diào)控作用，即CD8+T細(xì)胞在心肌炎時浸潤增加，參與心肌細(xì)胞損傷過程并作用于心肌炎的發(fā)展。同時CD8+T淋巴細(xì)胞可通過TNF-α的過度表達(dá)，誘導(dǎo)膠原含量增加，干預(yù)心肌纖維化進(jìn)程，同時TNF-α也是細(xì)胞凋亡家族的重要成員［21］。結(jié)合本研究CD8+T淋巴細(xì)胞在各組的變化趨勢（見表6），我們認(rèn)為遞增負(fù)荷運動可刺激CD8+T淋巴細(xì)胞促進(jìn)心肌的巨噬細(xì)胞浸潤和活化，增強促炎性因子和趨炎性因子（如TNF-α）的表達(dá)，進(jìn)而加重心肌的炎癥進(jìn)程。與之相關(guān)的研究表明，6周遞增負(fù)荷運動，運動組大鼠胸腺的CD8+T淋巴細(xì)胞在2、4、6周中均明顯高于對照組［22］，推測可能是運動后抑制性T細(xì)胞被激活，以控制抗原暴露所致的自身免疫損傷；但抑制性T細(xì)胞過度激活卻又影響其他亞型T細(xì)胞功能，導(dǎo)致訓(xùn)練后免疫抑制；而過度訓(xùn)練也使抑制性巨噬細(xì)胞增多，提高抑制性T細(xì)胞功能，進(jìn)一步加劇訓(xùn)練后的免疫抑制［23］。結(jié)合本研究結(jié)果，推測遞增負(fù)荷運動致使心肌承受的應(yīng)力負(fù)荷增加，心肌內(nèi)炎癥反應(yīng)累積，在此基礎(chǔ)上激活了CD8+T淋巴細(xì)胞的效應(yīng)，炎性因子TNF-α的表達(dá)增加，心肌病理損傷加重。但低強度激光卻通過下調(diào)CD8+T淋巴細(xì)胞及TNF-α的炎性表達(dá)，延緩心肌內(nèi)的炎癥發(fā)展進(jìn)程，以達(dá)到改善心肌的目的。

作為生命過程的一種生理現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡和增殖都是生命的正?，F(xiàn)象，以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。Phaneuf等［24］研究認(rèn)為運動導(dǎo)致細(xì)胞凋亡屬于正常的機體調(diào)節(jié)過程，通過排斥部分無不良反應(yīng)的破壞細(xì)胞，以保證組織處在最佳的機能狀態(tài)。而研究運動對心肌和骨骼肌細(xì)胞凋亡的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，不管是短時間還是長時間的運動都會導(dǎo)致肌細(xì)胞損傷［25］。如常蕓［8］、張鈞［26］和金其貫［27］等，研究不同強度耐力訓(xùn)練、力竭運動或超負(fù)荷運動后大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)過度訓(xùn)練可導(dǎo)致大鼠心肌細(xì)胞凋亡增加，提示心肌細(xì)胞凋亡參與由超負(fù)荷運動所致的心臟病理性失代償?shù)霓D(zhuǎn)變過程，導(dǎo)致運動性心臟損傷。本研究結(jié)果顯示，6周遞增負(fù)荷運動過程中，隨運動負(fù)荷強度遞增，大鼠心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生率逐漸增加，而激光組心肌細(xì)胞凋亡明顯少于同時期運動組，提示低強度激光可作為對抗心肌細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控方式。DE等［28］研究指出，激光在對抗炎癥反應(yīng)過程中表現(xiàn)為雙刃劍的劑量依賴性關(guān)系，這就意味著中等強度激光在“治療窗”會激發(fā)照射部位產(chǎn)生生物學(xué)反應(yīng)；而超出此范圍則不能產(chǎn)生任何效應(yīng)。本研究中，LE組心肌細(xì)胞凋亡率明顯低于HE組也恰與此結(jié)論一致。

低強度激光具有安全、有效、易操作和可實施性強等特點。本研究在運動醫(yī)學(xué)領(lǐng)域及其他臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究均證實，低強度激光可作為抵抗心血管疾病的抗炎癥損傷、減輕疼痛、促進(jìn)細(xì)胞增殖的有效手段。

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Effects of laser of different intensities on the myocardial inflammatory injury and CD8+T lymphocyte expression of rats exercising with an incremental load

MA Xiao-ge，WANG Song-tao，QIN Fei，GONG Wen-wu
（School of Physical Education，South China Normal University，Guangzhou 510006，China）

Abstract:In order to observe the changing of and relationship between the myocardial inflammatory injury and CD8+T lymphocyte expression of rats exercising with an incremental load, and to probe into the function of laser therapy of different intensities on protecting a heat undergoing a high intensity exercise, the authors divided 8-week old male SD rats randomly into a control group （C） consisting of 54 rats, and an experiment group consisting of 54 rats, including a low intensity laser + exercise group （LE）, a high intensity laser + exercise group （HE）, and an exercise group （E）, each of which consisted of 18 rats, sampled the rats in the groups in weeks 2, 4 and 6 respectively, evaluated their heart coefficients, overall heart shapes, myocardial pathological scores, apoptosis of myocardial CD8+T lymphocytes and cardiocytes, and revealed the following findings: as compared with the rats in group C, the rats in group E in week 6 showed significant cardiocytes inflammatory infiltrating, myocardial fibers twisting, swelling and rupturing, a significantly different pathological score （P＜0.01）, increased serum TNF-α, myocardial CD8+T lymphocytes filtrating, and a very significantly increased cardiocyte apoptosis index; as compared with the rats in group E in the same period （week 2, 4 or 6）, the rats in group LE had slightly lighter myocardial inflammation; in week 6, the numbers of apoptosis of CD8+T lymphocytes and cardiocytes increased as compared with those of the rats in group C, yet decreased significantly as compared with those of the rats in group E （P＜0.01）. The saidbook=138,ebook=143findings indicate that laser therapy can, to a certain extent, alleviate myocardial inflammatory infiltration and inflammatory factors, reduce the degree of myocardial pathology, and restrain the process of apoptosis of cardiocytes.

Key words:sports medicine；myocardial inflammatory injury；exercising with an incremental load；low intensity laser；CD8+T lymphocyte；rats

作者簡介：麻曉鴿（1984-），女，博士研究生，研究方向：運動與心血管健康。E-mail：mxg84@163.com 通訊作者：王松濤教授。

基金項目：廣東省體育局2014年科研項目（GDSS2014181）；華南師范大學(xué)2014年研究生創(chuàng)新基金（2014bsxm03）。

收稿日期：2015-08-20

中圖分類號：G804.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1006-7116（2016）03-0137-08