陳　昭， 陳偉韜， 羅文匯， 畢曉黎，2 *

（1.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東廣州510095；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510405）

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HPCE法研究土鱉蟲鎮(zhèn)痛作用與其指紋圖譜的關(guān)系

陳昭1， 陳偉韜1， 羅文匯1， 畢曉黎1，2 *

（1.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東廣州510095；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510405）

摘要：目的 建立高效毛細(xì)管電泳（HPCE）法研究土鱉蟲EuPolyPhaga seu SteleoPhaga鎮(zhèn)痛作用與其指紋圖譜的關(guān)系。方法 分析采用熔融硅膠毛細(xì)管（75 μm，30 cm×21 cm）；10 mmol/L硼砂（pH=9.7）為緩沖液；進(jìn)樣電壓5 kV10 s；分離電壓15 kV；檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm。然后，通過醋酸致小鼠扭體實(shí)驗(yàn)來(lái)探索各組分對(duì)鎮(zhèn)痛作用的影響。結(jié)果 土鱉蟲指紋圖譜中有7個(gè)特征峰，其中有2個(gè)為尿囊素與氯氮卓。兩者的含有量與土鱉蟲的鎮(zhèn)痛作用成正比關(guān)系。結(jié)論 各批次土鱉蟲樣品間存在差異，其鎮(zhèn)痛作用可用于質(zhì)量評(píng)價(jià)。

關(guān)鍵詞：土鱉蟲；鎮(zhèn)痛作用；指紋圖譜；尿囊素；氯氮卓；HPCE

土鱉蟲為動(dòng)物藥，其所含成分多為蛋白、核酸、生物堿等，其中以蛋白、生物堿、核酸及其衍生物為主［8］。然而，限于目前技術(shù)條件及新藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究現(xiàn)狀，仍然難以對(duì)上述化合物進(jìn)行逐一鑒別和含有量測(cè)定，《中國(guó)藥典》2010年版“土鱉蟲”項(xiàng)下僅收載了性狀、顯微鑒別與薄層鑒別。同時(shí)，由于土鱉蟲中多數(shù)成分存在分子量大、極性高或結(jié)構(gòu)相似等特征，HPLC等傳統(tǒng)分析技術(shù)僅能檢測(cè)其中一小部分，不能準(zhǔn)確反映該藥材與功效相關(guān)的質(zhì)量信息［9］。

高效毛細(xì)管電泳（HPCE）技術(shù)是在高壓電場(chǎng)作用下，帶點(diǎn)組分隨著電場(chǎng)方向遷移的一種分離分析方法［10-11］，由于這種分離在狹小空間內(nèi)進(jìn)行（25～200 μm內(nèi)徑，30～70 cm總長(zhǎng)的毛細(xì)管），加之緩沖液的液流受電場(chǎng)推動(dòng)而呈平面型，故具有較高的柱效。此外，待測(cè)物在該模式下由于帶電量的不同，可導(dǎo)致遷移速率的差異，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)分離，而且受分子質(zhì)量與極性影響相對(duì)較小。因此，根據(jù)土鱉蟲中主要化合物的理化特性與結(jié)構(gòu)特征，采用HPCE法建立指紋譜所得的化合物信息更為全面與準(zhǔn)確。另外，基于HPCE法的土鱉蟲藥材指紋圖譜研究雖已見諸報(bào)道［12］，但對(duì)其中大量化合物信息及其與鎮(zhèn)痛療效之間的關(guān)系仍未涉及。

目前，市場(chǎng)上的土鱉蟲藥材不但功效活性存在差異，而且其藥材基原也存在較大區(qū)別，而藥典及現(xiàn)有的分析方法在藥材質(zhì)量控制、藥材基原研究及功效評(píng)價(jià)上仍存在較大局限性。因此，有必要尋找更為適宜的分析測(cè)定方法用于土鱉蟲藥材指紋圖譜的建立，并在此基礎(chǔ)上，更為客觀地評(píng)價(jià)不同產(chǎn)區(qū)、批次藥材的療效差異，同時(shí)探索導(dǎo)致這些差異的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 3DCE高效毛細(xì)管電泳儀，配備DAD檢測(cè)器及Chemstation工作站（美國(guó)Agilent公司）；Thermo TSQ Quantum液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Thermo Fisher公司）；XS205DU電子分析天平、pH計(jì)（瑞士Mettler-Toledo公司）；超聲儀（昆山科學(xué)儀器廠）；毛細(xì)管（河北永年瑞灃色譜器件有限公司）。

1.2 試劑和試藥 硼砂、磷酸二氫鈉（德國(guó)Sigma-Aldrich公司）。土鱉蟲樣品分別購(gòu)自廣東省各大醫(yī)藥公司，2個(gè)來(lái)源，共5批，經(jīng)廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院劉法錦研究員鑒定為鱉蠊科昆蟲地鱉EuPolyPhaga sinensis Walker、金邊土鱉OPisthoPlata orientalis Buron或冀地鱉StelePhaga Plancyi Boleny。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品和供試品溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 精密稱取土鱉蟲0.2 g，置于100 mL錐形瓶中，加入20％乙醇50 mL，超聲30 min，過濾，取濾液25 mL，即得。

2.1.2 供試品溶液 精密稱取土鱉蟲2.0 g，按“2.1.1”項(xiàng)下方法處理，即得。

2.2 毛細(xì)管電泳分析條件 熔融硅膠毛細(xì)管色譜柱（75 μm，30 cm×21 cm）；緩沖液10 mmol/L硼砂（以磷酸二氫鈉調(diào)節(jié)pH至9.7）；檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm；進(jìn)樣電壓5 kV10 s；分離電壓15 kV；柱溫25℃。

2.3 HPCE指紋圖譜測(cè)定 取6批藥材，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)行測(cè)定，選取其中響應(yīng)值較大、共同存在的色譜峰作為監(jiān)控指標(biāo)峰，用于建立指紋圖譜，見圖1和表1。與地鱉和冀地鱉進(jìn)行比對(duì)后，確定其中7個(gè)成分作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的候選指標(biāo)。

2.尿囊素 3.氯氮卓 1、4～7未知2.allantoin 3.chlordiazepoxide 1，4 -7 unknown圖1　土鱉蟲HPCE圖譜Fig.1 HPCE chromatograms of EuPolyPhaga seu SteleoPhaga

2.4 活性成分鑒別 根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果可知，在最優(yōu)HPCE條件下，土鱉蟲指紋圖譜中的7個(gè)特征峰與對(duì)照品和保留時(shí)間比對(duì)，確認(rèn)峰2為尿囊素。另外田君鵬［13］報(bào)道，土鱉蟲中含有生物堿類成分氯氮卓，經(jīng)與對(duì)照品比對(duì)后，確認(rèn)峰3為氯氮卓。

表1　不同來(lái)源土鱉蟲中指標(biāo)成分峰面積Tab.1 PeaK areas of index constituents in EuPolyPhaga seu SteleoPhaga from different sources

為進(jìn)一步對(duì)各特征峰進(jìn)行鑒定，本實(shí)驗(yàn)將藥材提取液進(jìn)行LC-MS分析。正、負(fù)離子模式下全掃描；電壓3 000 V（負(fù)離子模式下-2 500 V）；汽化溫度300℃；毛細(xì)管溫度300℃；鞘氣壓力207 kPa；輔氣壓力69 kPa。正離子模式下，以0.1％甲酸-乙腈（30∶70）為流動(dòng)相；負(fù)離子模式下，以10 mmol/L乙酸胺-乙腈（30∶70）為流動(dòng)相，觀察60 min內(nèi)出峰情況，然后與文獻(xiàn)進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果，僅正離子模式下m/z=299的峰可與文獻(xiàn)［11］報(bào)道的化合物信息一致，而其他化合物因未有對(duì)照品而無(wú)法用HPCE進(jìn)行確認(rèn)。由于目前僅能獲得峰2與峰3的對(duì)照品，故本實(shí)驗(yàn)選取兩者作為土鱉蟲藥材的指標(biāo)性成分。

2.5 土鱉蟲指標(biāo)性成分含有量測(cè)定

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性關(guān)系 精密稱取尿囊素與氯氮卓對(duì)照品各10.0 mg，置于10 mL量瓶中，甲醇定容，即得含兩者質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL的對(duì)照品溶液。精密量取適量，置于10 mL量瓶中，逐級(jí)稀釋，得質(zhì)量濃度為5、10、20、50、100、200 μg/mL的對(duì)照品溶液，在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)（y），質(zhì)量濃度為（x），計(jì)算尿囊素標(biāo)準(zhǔn)曲線為y= 2.045 6x+2.359 5（r=0.999 6），氯氮卓為y= 2.309 3x+6.666 3（r=0.999 4）。結(jié)果顯示，該方法線性關(guān)系良好，可在5～200 μg/mL范圍內(nèi)對(duì)兩者進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

2.5.2 精密度與回收率

2.5.2.1精密度的測(cè)定 精密吸取“2.5.1”項(xiàng)下50 μg/mL的混合對(duì)照品溶液1 μL，在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，連續(xù)測(cè)定6次。結(jié)果，2個(gè)指標(biāo)性成分的峰面積RSD分別為1.3％和1.7％，表明儀器精密度良好。

2.5.2.2 回收率的測(cè)定 精密稱取含有量已知的土鱉蟲藥材0.2 g，共9份，分為低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度組，每組3份。加入一定量1 mg/mL的混合對(duì)照品溶液（低、中、高質(zhì)量濃度分別取800、1 000、1 200 μL），按“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，尿囊素和氯氮卓質(zhì)量濃度均為36～44 μg/mL（以該批藥材制成供試品后，尿囊素質(zhì)量濃度約為20 μg/mL，氯氮卓質(zhì)量濃度約為19 μg/mL計(jì)）的溶液，在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)行測(cè)定，平行3次，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。由表可知，該方法回收率良好，能夠?qū)ν流M蟲藥材進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

表2　回收率與精密度測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab.2 Determ ination results of recoveries and precisions （n=3）

2.5.3 不同來(lái)源土鱉蟲藥材含有量測(cè)定 精密稱取不同來(lái)源的土鱉蟲藥材0.2 g，按“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)行測(cè)定，平行3次，記錄峰面積，并計(jì)算含有量，結(jié)果見表3。

2.6 藥理實(shí)驗(yàn) 采用醋酸致小鼠扭體實(shí)驗(yàn)，分為對(duì)照組、化藥（對(duì)乙酰氨基酚）組和土鱉蟲藥材組，其中土鱉蟲藥材組又根據(jù)藥材不同批次分為5組，每組5只，通過觀察扭體次數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)鎮(zhèn)痛效果，結(jié)果見圖2。由圖可知，金邊土鱉蟲組的鎮(zhèn)痛作用最為顯著，其中組分2與3的峰面積對(duì)其有顯著影響（p<0.05）。

表3　含有量測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab.3 Results of content determ ination（n=3）

圖2　藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Results of pharmacological experiments

3 討論與結(jié)論

3.1 提取方法優(yōu)化 由于土鱉蟲藥材中成分較多，而且結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)差異較大，故本實(shí)驗(yàn)考察了不同提取溶劑、比例及超聲時(shí)間下7個(gè)共有峰的總面積，同時(shí)規(guī)定，各條件下所得峰面積不得低于該峰平均數(shù)的20％，確定最優(yōu)提取條件。結(jié)果，采用20％乙醇，超聲提取30 min時(shí)提取效率最高。根據(jù)電泳條件可知，指紋圖譜中的共有峰很可能為生物堿類化合物，由于在該溶劑比例下，藥材中所含的化合物更易于溶出，故最終采用這一提取條件。3.2 譜效關(guān)系初步研究 將藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果與HPCE指紋圖譜中各特征峰的峰面積進(jìn)行綜合比對(duì)，可知土鱉蟲鎮(zhèn)痛作用與尿囊素和氯氮卓（峰2和峰3）的含有量成正比關(guān)系，可能是因?yàn)閮烧呔哂墟?zhèn)痛、促進(jìn)皮膚潰瘍面和傷口愈合以及生肌等生物活性。因此，在制定土鱉蟲質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，可考慮以尿囊素及氯氮卓為活性成分，并通過測(cè)定其含有量來(lái)評(píng)估藥材質(zhì)量的優(yōu)劣。

3.3 結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)采用HPCE法，結(jié)合藥效學(xué)試驗(yàn)，對(duì)土鱉蟲鎮(zhèn)痛作用的機(jī)理與物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了初步探索，同時(shí)根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研及實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定尿囊素和氯氮卓這2個(gè)化合物作為指標(biāo)性成分。該方法快速、準(zhǔn)確、高效，并且以療效為導(dǎo)向，可作為藥材標(biāo)準(zhǔn)的參考與補(bǔ)充，同時(shí)也為動(dòng)物藥的研究及質(zhì)量控制提供了借鑒。但是，由于該類藥物存在成分復(fù)雜、結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)特異、功效多樣等特點(diǎn)，故仍需要在后續(xù)研究中對(duì)所得特征峰作進(jìn)一步確認(rèn)。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：2010年版一部［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：18.

［2］ 劉 丹，李興暖，秦仲君，等.土鱉蟲多肽的制備及免疫調(diào)節(jié)作用研究［J］.中藥材，2012，35（9）：1382-1385.

［3］ 賀衛(wèi)和，成細(xì)華，徐愛良.土鱉蟲提取液對(duì)家兔抗凝血作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，23（2）：7-9.

［4］ 曹艷玲，李文蘭，伍水龍，等.土鱉蟲胰酶酶解物抗凝活性部位分離純化及組成分析［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（3）：52-55.

［5］ 楊紅蓮，劉 梅.土鱉蟲的化學(xué)成分及藥理研究［J］.陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，28（2）：48-50.

［6］ 張 微，鄒 璽，錢曉萍，等.土鱉蟲含藥血清對(duì)肝癌HepG-2細(xì)胞增殖的抑制作用［J］.中藥新藥與臨床藥理，2007，18（4）：257-259.

［7］ 黃鎮(zhèn)林，何亮穎，王宏濤，等.土鱉蟲活性組分F2-2體內(nèi)抗凝藥效實(shí)驗(yàn)［J］.世界科學(xué)技術(shù)：中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2014，16（6）：1359-1363.

［8］ 龍子江，盛炎炎，董宏超.土鱉蟲總生物堿對(duì)家兔心泵功能的影響［J］.安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1989，8（3）：84-86.

［9］ 景 晶，曹 紅.HPLC法測(cè)定土鱉蟲中尿嘧啶和尿囊素的含量［J］.藥學(xué)實(shí)踐雜志，2010，28（2）：134-136.

［10］ Kapnissi-Christodoulou C P，Zhu X，Warner IM.Analytical separations in open-tubular capillary electrochromatography［J］. ElectroPhoresis，2003，24（22-23）：3917-3934.

［11］ Eeltink S，Rozing G P，Kok W T.Recentapplications in capillary electrochromatography［J］.ElectroPhoresis，2003，24（22-23）：3935-3961.

［12］ 李 峰，王成芳，包永睿.土鱉蟲藥材高效毛細(xì)管電泳指紋圖譜鑒別研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2011，36（11）：1471-1473.

［13］ 田君鵬.地鱉蟲生物堿的提取分離、結(jié)構(gòu)鑒定及急性毒理研究［D］.武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

Relationship between the analgesia effect and fingerprint of EuPolyPhaga seu SteleoPhaga by HPCE

CHEN Zhao1， CHENWei-tao1， LUOWen-hui1， BIXiao-li1，2*
（1.Guangdong p rovincial Research Institute of Traditional ChineseMedicineManufacturing Technology，Guangzhou 510095，China；2.Guangzhou University of ChineseMedicine，Guangzhou 510405，China）

ABSTRACT：AIM To establish a high performance capillry electrophoresis（HPCE）method for investigating the relationship between the analgesia effect and fingerprint of EuPolyPhaga seu SteleoPhaga.METHODS The analysis was performed on fused silica capillary（75 μm，30 cm×21 cm），buffer was 10 mmol/L borax（pH= 9.7），inject voltage was 5 kV10 s，separation voltage was 15 kV，and detection wavelength was set at 214 nm. Then the influences of various constituents on analgesia effect were studied by frequency body torsion caused by acetic acid in mice.RESULTS There were seven characteristic peaks in the fingerprint of EuPolyPhaga seu SteleoPhaga，two ofwhich were allantoin and chlordiazepoxide.The contents of these two constituentswere proportional to the analgesia effect of EuPolyPhaga seu SteleoPhaga.CONCLUSION There are differences among various batches of EuPolyPhaga seu SteleoPhaga samples，whose analgesia effect can be used for the quality control.

KEY WORDS：EuPolyPhaga seu SteleoPhaga；analgesia effect；fingerprint；allantoin；chlordiazepoxide；HPCE

*通信作者：畢曉黎（1979—），女，博士，主任中藥師，碩士生導(dǎo)師，從事中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)研究。Tel：（020）83482098，E-mail：2335128654@qq.com

作者簡(jiǎn)介：陳 昭（1985—），男，博士，主管藥師，從事藥物活性成分的分析測(cè)定研究。Tel：（020）83482098，E-mail：cz20081331 @126.com

基金項(xiàng)目：廣東省中醫(yī)藥局科研課題（20141027）

收稿日期：2015-05-06

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.023

中圖分類號(hào)：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1528（2016）05-1074-04