張文靜

430100　湖北省武漢市蔡甸區(qū)中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科

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·論著·

乳腺癌中CDC25A和P57kip2蛋白表達(dá)與病理分級(jí)及臨床分期的關(guān)系

張文靜

430100湖北省武漢市蔡甸區(qū)中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科

【摘要】目的探討CDC25A和P57kip2蛋白在乳腺癌中的表達(dá)與病理分級(jí)、臨床分期的關(guān)系，并對(duì)CDC25A和P57kip2之間的相關(guān)性進(jìn)行研究。方法選擇免疫印跡方法對(duì)64例乳腺癌患者進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)CDC25A和P57kip2 蛋白在乳腺癌中的表達(dá)、病理特征以及臨床分期三者之間的聯(lián)系進(jìn)行確切的研究探討。結(jié)果乳腺癌以及癌細(xì)胞周?chē)恼＜?xì)胞中都能夠找CDC25A蛋白的表達(dá)，但在乳腺癌中則表現(xiàn)為高密度表達(dá)(P<0.05)；腫瘤的分化程度越低，CDC25A蛋白的表達(dá)逐漸提升(P<0.05)。CDC25A 蛋白表達(dá)在臨床Ⅰ期、Ⅱ期，是否伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。P57kip2蛋白在乳腺癌中呈低水平表達(dá)，在癌旁正常腺體中均呈高表達(dá)(P<0.05)，但在伴和不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論CDC25A的過(guò)度表達(dá)和P57kip2的低表達(dá)可能在乳腺癌的發(fā)生中起作用；乳腺癌發(fā)生機(jī)制中有涉及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)環(huán)路中的CDC25A、P57kip2基因的異常；CDC25A及P57kip2可能成為乳腺癌的診斷標(biāo)記，預(yù)后判斷。

【關(guān)鍵詞】乳腺癌；細(xì)胞分裂調(diào)控25磷酸酶A；P57kip2蛋白；免疫印跡

目前筆者尚未發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)有關(guān)CDC25A及P57kip2與乳腺癌之間關(guān)系的相關(guān)報(bào)道，但研究表明P57kip2阻止底物磷酸化，將細(xì)胞阻滯于G1期，抑制細(xì)胞增殖，而CDC25A能消除Thr-14和Tyr-15的抑制性磷酸化，促進(jìn)G1/S期的進(jìn)行，對(duì)細(xì)胞的運(yùn)轉(zhuǎn)起正性調(diào)控作用[1-3]。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)長(zhǎng)時(shí)間、多步驟、多階段并涉及多基因改變的逐步演進(jìn)的過(guò)程，其發(fā)生發(fā)展需多個(gè)基因的異常，而在此過(guò)程中是否存在CDC25A 及P57kip2的功能紊亂，其具體機(jī)制尚不明確[4,5]。為此，本研究采用免疫印跡法(westorn blot)為實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，檢測(cè)乳腺癌組織、癌旁正常乳腺腺體組織中CDC25A及P57kip2的表達(dá)情況，并分析它們與乳腺癌病理分級(jí)、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理因素之間的關(guān)系，探討其在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的影響以及它們之間的相互作用關(guān)系。

1資料與方法

1.1一般資料收集我院2011年9月至2012年6月64例乳腺癌(標(biāo)本經(jīng)病理證實(shí))患者的組織標(biāo)本，患者均為原發(fā)性腫瘤，術(shù)前均未接受過(guò)放化療。64例均為女性，年齡38～81 歲，平均年齡(51±5)歲。腫瘤組織按癌細(xì)胞的分化程度(WHO 病理分級(jí))分為Ⅰ級(jí)(n=7)、Ⅱ級(jí)(n=48)、Ⅲ級(jí)(n=9)3個(gè)試驗(yàn)組；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：無(wú)轉(zhuǎn)移29 例，有轉(zhuǎn)移35 例；按國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)分期：Ⅰ期11 例，Ⅱ期34 例，Ⅲ期19 例。對(duì)照組中屬于癌細(xì)胞旁的正常腺體組織，然后隨機(jī)選擇之后作為乳腺改良根治手術(shù)以后的病例標(biāo)本，大約距離腫瘤3 cm以上的乳腺腺體組織標(biāo)本10 例(經(jīng)病理證實(shí)為正常乳腺腺體)。取材后置入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試劑與儀器

1.2.1抗體：兔抗人CDC25A 多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；兔抗人P57kip2多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；兔抗人 β-actin (武漢博士德生物工程有限公司)；硝酸纖維素膜(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2.2儀器：蛋白電泳儀(DYCZ-24D 型)；核酸電泳儀(北京六一公司)；流式細(xì)胞儀(FCM，becton dickinson 公司)；凝膠電泳成像分析系統(tǒng)(alphainnotech chemi imager,美國(guó))；DYY-4OB 型轉(zhuǎn)印電泳槽(北京六一儀器廠)；可見(jiàn)-紫外分光光度計(jì)(U-2000，Hitachi 公司，Japan)；硝酸纖維素膜電轉(zhuǎn)系統(tǒng)(Bio-Rad 公司)。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1Western blot法：對(duì)64 例乳腺癌組織和10 例癌旁正常腺體，均選取50 mg組織，冰上將組織置于10 ml離心管中,用消毒過(guò)的剪刀將組織塊盡量剪碎。參照文獻(xiàn)[5]方法進(jìn)行操作用酶標(biāo)儀測(cè)定A562，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算樣品的蛋白濃度。

1.3.2SDS-PAGE電泳：參照文獻(xiàn)[5]方法進(jìn)行操作，然后利用顯影技術(shù)進(jìn)行定影處理，并對(duì)最終的結(jié)果進(jìn)行詳細(xì)的觀察研究，并利用圖像采集系統(tǒng)對(duì)圖像進(jìn)行收集。

2結(jié)果

2.1CDC25A 蛋白在各組中的表達(dá)及其與乳腺癌的關(guān)系對(duì)于全部的組織來(lái)說(shuō)，都具有CDC25A 蛋白的表達(dá)，但是在乳腺癌組織中則表現(xiàn)為高水平的表達(dá)，且在乳腺癌各病理分級(jí)，Ⅰ期、Ⅱ期，伴或不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在Ⅱ期，Ⅲ期分期間吸光度定量分析差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CDC25A蛋白在乳腺癌組織中各病理分級(jí)間的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且CDC25A在乳腺癌組織及癌旁正常腺體組織相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對(duì)于癌細(xì)胞旁的正常腺體組織以及乳腺癌組織中的CDC25A蛋白來(lái)說(shuō)，其Ⅰ期和Ⅱ期的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但在Ⅱ期、Ⅲ期分期間吸光度定量分析差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CDC25A蛋白在有或無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織和癌旁正常腺體組織的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1，圖1。

表1　CDC25A在乳腺癌組織各病理分級(jí)和對(duì)照組的表達(dá)　±s

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與Ⅰ級(jí)(期)比較，#P<0.05；與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較，△P<0.05

各病理分級(jí)間的表達(dá)

按UICC的TNM分期間的表達(dá)

伴或不伴腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的表達(dá)

圖1CDC25A 和β-actin 蛋白在癌旁正常腺體組織和乳腺癌中各病理分級(jí)間、UICC的TNM分期間、伴或不伴腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的表達(dá)

2.2P57kip2蛋白在各組中的表達(dá)和乳腺癌的關(guān)系P57kip2蛋白在癌旁正常乳腺組織中大量表達(dá)，在乳腺癌組織中呈低表達(dá)，且在乳腺癌各病理分級(jí)，分期的表達(dá)差異較明顯，在伴或不伴腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間吸光度定量分析差異不明顯。P57kip2蛋白在乳腺癌組織中各病理分級(jí)間的表達(dá)差異明顯，且P57kip2在癌細(xì)胞的正常腺體以及乳腺癌組織中相比較可以發(fā)現(xiàn)，兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；P57kip2蛋白乳腺癌組織中各臨床分期中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；P57kip2蛋白在有或無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織和癌旁正常腺體組織的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但在乳腺癌組織中有或無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間吸光度定量分析差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2，圖2。

表2　P57kip2在各組織中的表達(dá)及乳腺癌的關(guān)系　±s

注：與對(duì)照線比較，*P<0.05；與Ⅰ級(jí)(期)比較，#P<0.05

圖2P57kip2和β-actin 蛋白在癌旁正常腺體組織和乳腺癌中各病理分級(jí)間、UICC的TNM分期間、伴或不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的表達(dá)

3討論

本研究顯示，在乳腺癌中CDC25A的表達(dá)顯著高于癌旁正常腺體組織，CDC25A蛋白在癌旁正常腺體組織中和乳腺癌組織中各病理分級(jí)及臨床分期中Ⅰ期、Ⅱ期的表達(dá)存在正相關(guān)，CDC25A蛋白在癌旁正常腺體組織中，有或無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中同樣存在正相關(guān)，這都進(jìn)一步證實(shí)CDC25A的過(guò)表達(dá)與乳腺癌發(fā)生和早期的發(fā)展息息相關(guān)，并且過(guò)表達(dá)提示預(yù)后不良，或者是預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素之一，Ⅱ、Ⅲ期的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可能提示CDC25A只在乳腺癌發(fā)展的早期起作用，在中晚期的作用不明顯，也有可能還需要更多更大范圍的實(shí)驗(yàn)研究來(lái)進(jìn)一步證實(shí)[6-8]。

在本研究中顯示，在乳腺癌中P57kip2蛋白的表達(dá)顯著低于癌旁正常腺體組織，P57kip2蛋白乳腺癌組織中各臨床分級(jí)中及癌旁正常腺體組織中的表達(dá)存在負(fù)相關(guān)，P57kip2蛋白乳腺癌組織中各臨床分期中及癌旁正常腺體組織中的表達(dá)亦存在負(fù)相關(guān)，這些都進(jìn)一步證實(shí)P57kip2的缺失與乳腺癌發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，并且缺失提示預(yù)后不良或者是預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素之一，至于為什么在有或無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中相比較并無(wú)明顯差異，可能提示P57kip2只在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展的早期起作用，在進(jìn)一步浸潤(rùn)中的作用不明顯，或者到了部分晚期乳腺癌組織中P57kip2開(kāi)始扮演促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的作用，當(dāng)然也有可能還需要更多更大范圍的實(shí)驗(yàn)研究來(lái)進(jìn)一步證實(shí)乳腺癌發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移后P57kip2的作用。

總之，在本研究中可以看出乳腺癌發(fā)生機(jī)制中有涉及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)環(huán)路中的CDC25A、P57kip2基因的異常，而且兩者在整個(gè)乳腺癌發(fā)生發(fā)展中起著完全相反的作用，我們從中分析，可以大膽猜測(cè)CDC25A的過(guò)度表達(dá)可能和P57kip2的低表達(dá)在乳腺癌發(fā)生中起協(xié)同作用。當(dāng)然進(jìn)一步得證實(shí)還有賴(lài)于更多標(biāo)本的收集及更多實(shí)驗(yàn)的論證。

P57kip2蛋白的功能實(shí)現(xiàn)依靠?jī)煞N途徑，一是抑制CDK復(fù)合物，二是抑制PCNA即細(xì)胞核增生抗原[9,10]。本文結(jié)果表明CDC25A和P57kip2能夠一起組合成細(xì)胞調(diào)節(jié)通道，主要是在細(xì)胞周期中，這一通道的形成和乳腺癌的發(fā)生以及發(fā)展有重大聯(lián)系。

本文中的所有研究中能夠發(fā)現(xiàn)，CDC25A蛋白在所有檢測(cè)的組織中都有表達(dá)，使癌旁正常腺體和乳腺癌組織進(jìn)行比較，其在CDC25A的表達(dá)方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。尤其是在乳腺癌組織中，CDC25A高度表達(dá)，乳腺癌的病理分級(jí)程度不同表達(dá)也不同，腫瘤分化程度越高，CDC25A的表達(dá)越低，在Ⅰ級(jí)到Ⅲ級(jí)表達(dá)逐漸降低；CDC25A在乳腺癌組織中的表達(dá)比癌旁正常腺體中的表達(dá)明顯升高。從試驗(yàn)結(jié)果中可以看出，乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程離不開(kāi)CDC25A蛋白的作用，它可以導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖，還和腫瘤的病理分化程度有正相關(guān)關(guān)系，在臨床癌癥疾病的分期中與Ⅰ期、Ⅱ期也成正相關(guān)關(guān)系，同樣與其有正相關(guān)關(guān)系的還有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。如果檢測(cè)出CDC25A蛋白表達(dá)程度高，則表示預(yù)后效果不佳。在癌旁正常腺體的組織中能夠檢測(cè)到大量P57kip2蛋白，但是在乳腺癌組織中檢測(cè)出的P57kip2蛋白就比較低，在腫瘤的Ⅰ級(jí)到Ⅲ的分級(jí)中，腫瘤分化程度不斷降低的，P57kip2蛋白的表達(dá)也逐漸降低，并且與腫瘤的病理分化程度及臨床分期均呈負(fù)相關(guān)。提示P57kip2的缺失可能參與了乳腺癌的演變過(guò)程。由于CDC25A的過(guò)度表達(dá)、P57kip2的丟失均是通過(guò)共同的Rb途徑參與乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展。由此我們可以推斷：P57kip2蛋白能夠被當(dāng)作一種新抑癌基因，細(xì)胞惡性增殖可能會(huì)導(dǎo)致P57kip2蛋白表達(dá)缺失[11-13]。P57kip2蛋白在乳腺癌中呈低水平表達(dá)，在癌旁正常腺體中均呈高表達(dá)，P57kip2的低表達(dá)與乳腺癌的分化程度密切相關(guān)，腫瘤從Ⅰ級(jí)到Ⅲ級(jí)其分化程度逐漸降低，表達(dá)也逐漸降低，這和乳腺癌大小，臨床分期也密切相關(guān)，腫瘤越大，分期越晚，P57kip2表達(dá)就越低。P57kip2在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中可能還扮演著一個(gè)抑癌基因的角色，其表達(dá)的缺失可能參與了乳腺癌的演變過(guò)程[14,15]。

綜上所述，CDC25A的過(guò)度表達(dá)和P57kip2的低表達(dá)可能在乳腺癌的發(fā)生中起作用；乳腺癌發(fā)生機(jī)制中可能有涉及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)環(huán)路中的CDC25A、P57kip2基因的異常；CDC25A及P57kip2可能成為乳腺癌的診斷標(biāo)記，預(yù)后判斷。

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Correlation between expressions of P57kip2and CDC25A protein in breast cancer and pathological grading as well as clinical staging of breast cancer

ZHANGWenjing.

DepartmentofClinicalLaboratory,TCMHospitalofCaidianDistrict,Wuhan430100,China

【Abstract】ObjectiveTo investigatre the correlation between expressions of P57kip2 and CDC25A protein in breast cancer and pathological grading as well as clinical staging of breast cancer,and to explore the relationship between CDC25A and P57kip2.MethodsThe expression levels of CDC25A and P57kip2protein were detected by Western Blot in 64 cases of breast cancer,then the correlation between expressions of P57kip2and CDC25A protein in breast cancer and pathological grading as well as clinical staging of breast cancer was analyzed.ResultsThe expression of CDC25A protein counld be found in breast cancer cells and normal cells surrounding cancer cells,however,which was high-expressed in breast cancer (P<0.05),in addition to that,the lower differentiation degrees of tumor,the higher expression levels of CDC25A protein (P<0.05).There were significant differences in the expression levels of CDC25A protein among clinical stageⅠ,stage Ⅱ,with lymph node metastasis,without lymph node metastasis (P<0.05).The expression levels of P57kip2protein were decreased,however,which were increased in normal gland tissues beside cancer (P<0.05).ConclusionThe overexpression of CDC25A and low-expression of P57kip2may play an important role in the pathogenesis of breast cancer.The pathogenesis of breast cancer may be related with the gene abnormality of CDC25A,P57kip2,which may become markers in diagnosis and prognosis judgment of breast cancer.

【Key words】breast carcinoma;cell division control 25 phosphatases A; P57kip2 protein;Western Blot

(收稿日期：2015-10-17)

【中圖分類(lèi)號(hào)】R 737.9

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1002-7386(2016)10-1471-04

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.10.008

項(xiàng)目來(lái)源：湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：2014CDB06802)