胡敏敏，王 偉，畢洪鐘，潘 金，琚 堅(jiān)

昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院特需病房，云南 昆明 650101

威靈仙多糖對(duì)實(shí)驗(yàn)性非酒精性脂肪性肝炎大鼠血清RBP4水平和胰島素抵抗指數(shù)的干預(yù)作用

胡敏敏，王 偉，畢洪鐘，潘 金，琚 堅(jiān)

昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院特需病房，云南 昆明 650101

目的 研究威靈仙多糖對(duì)非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)大鼠胰島素抵抗的干預(yù)作用，及實(shí)驗(yàn)性NASH大鼠血清視黃醇結(jié)合蛋白4(retinol binding protein 4，RBP4)與胰島素抵抗的相關(guān)性。方法 建模階段：50只清潔級(jí)健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白組(n=14)和造模組(n=36)?？瞻捉M用普通飼料飼養(yǎng)；造模組用高脂飼料飼養(yǎng)，建立NASH大鼠模型。干預(yù)階段：將造模組大鼠(n=30)隨機(jī)分為模型組、易善復(fù)組和威靈仙多糖組，每組各10只；空白組大鼠(n=8)作為對(duì)照組，依次分別給予0.9% NS、易善復(fù)溶液、威靈仙多糖溶液、0.9% NS灌胃干預(yù)，8周后4組大鼠下腔靜脈取血檢測(cè)空腹血糖、空腹胰島素及RBP4的含量，統(tǒng)計(jì)分析各組上述指標(biāo)的差異及胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)與RBP4的相關(guān)性。結(jié)果 與模型組相比，威靈仙多糖組NASH大鼠HOMA-IR、血清RBP4水平較低(P<0.05)；NASH大鼠HOMA-IR與血清RBP4呈正相關(guān)(r=0.541，P=0.001)。結(jié)論 威靈仙多糖可有效治療NASH大鼠，其主要機(jī)制之一可能是通過(guò)降低NASH大鼠血清RBP4水平，改善NASH大鼠胰島素抵抗。

非酒精性脂肪性肝炎；視黃醇結(jié)合蛋白4；威靈仙多糖

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變性和脂肪貯積為特征，其病程包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纖維化，最終可能演變?yōu)楦斡不蚋伟1]。視黃醇結(jié)合蛋白4(retinol binding protein 4，RBP4)是視黃醇結(jié)合蛋白家族中的一員[2]，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)RBP4是一種新的脂肪因子[3]，血清RBP4分泌增加與肝脂肪變及肝臟損傷有關(guān)，RBP4可能是NAFLD的獨(dú)立相關(guān)因素[4]。

本研究旨在探討威靈仙多糖對(duì)非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)大鼠胰島素抵抗的干預(yù)作用，及NASH大鼠血清RBP4水平與胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級(jí)健康雄性SD大鼠50只，平均體質(zhì)量(70±10)g，購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；豬油購(gòu)自昆明市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；蛋黃粉、膽固醇、膽酸鈉購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；威靈仙多糖購(gòu)自安徽大學(xué)生命科學(xué)院；易善復(fù)(多烯磷脂酰膽堿)購(gòu)自賽諾菲(北京)制藥有限公司；戊巴比妥鈉購(gòu)自上海西塘生物科技有限公司；甲醛購(gòu)自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司。

1.2 試劑 大鼠RBP4 ELISA試劑盒購(gòu)自LSBio公司；大鼠胰島素ELISA試劑盒購(gòu)自ALPCO公司。

1.3 方法

1.3.1 造模階段實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：將50只清潔級(jí)健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白組(n=14)和造模組(n=36)。

1.3.2 NASH大鼠模型的建立：空白組予普通飼料喂養(yǎng)16周；造模組予高脂飼料(飼料配比：82.5%普通飼料+10%豬油+5%蛋黃粉+2%膽固醇+0.5%膽酸鈉)喂養(yǎng)16周。在造模期間第4周末隨機(jī)選擇空白組和模型組大鼠各1只、第8周末各1只、第12周末各2只、第16周末各2只，下腔靜脈取血測(cè)定空腹血糖、空腹胰島素值，根據(jù)血糖及空腹胰島素值計(jì)算HOMA-IR；于肝右葉中央部位取適量肝組織，行HE染色后在光鏡下觀察肝臟脂肪變、炎癥情況，統(tǒng)計(jì)分析空白組和模型組大鼠血清中空腹血糖、空腹胰島素含量的差異，最后根據(jù)檢測(cè)及觀察的相關(guān)指標(biāo)來(lái)判斷實(shí)驗(yàn)性NASH大鼠模型是否成功建立。

1.3.3 藥物干預(yù)階段實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：實(shí)驗(yàn)性NASH大鼠模型成功建立后，將余下的30只造模組大鼠隨機(jī)分為模型組、易善復(fù)組和威靈仙多糖組，每組各10只；余下的8只空白組大鼠作為對(duì)照組。

1.3.4 藥物干預(yù)：模型組、易善復(fù)組、威靈仙多糖組、對(duì)照組依次分別予0.9% NS、易善復(fù)[195.4 mg·kg-1·d-1]、威靈仙多糖[50 mg·kg-1·d-1]、0.9% NS配成3 ml溶液，灌胃干預(yù)8周。

1.3.5 大鼠血清采集：剖殺大鼠前禁食禁飲24 h，3%戊巴比妥鈉(0.1～0.15) ml/100 g行腹腔麻醉，然后下腔靜脈采血測(cè)定空腹胰島素、空腹血糖、血清RBP4水平。

1.3.6 大鼠血清指標(biāo)測(cè)定：空腹血糖采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)；空腹胰島素測(cè)定步驟嚴(yán)格按照大鼠胰島素ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作；血清RBP4測(cè)定步驟嚴(yán)格按照大鼠血清RBP4 ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。HOMA-IR=空腹血糖(mmol/L)×空腹胰島素(mIU/L)/22.5。

1.3.7 肝臟病理結(jié)果判定：肝組織病理診斷按照肝炎組織學(xué)分級(jí)(Grade，G)、NAFLD活動(dòng)度積分(NAFLD activity score，NAS)來(lái)評(píng)估。匯管區(qū)及周圍、小葉內(nèi)無(wú)炎癥為0級(jí)(G0)；匯管區(qū)及周圍炎癥，小葉內(nèi)變性及少數(shù)點(diǎn)狀壞死為1級(jí)(G1)；匯管區(qū)及周圍輕度碎屑?jí)乃?，小葉內(nèi)變性，點(diǎn)、灶狀壞死或嗜酸小體為2級(jí)(G2)；匯管區(qū)及周圍中度碎屑?jí)乃?，小葉內(nèi)融合壞死或見(jiàn)橋接壞死為3級(jí)(G3)；匯管區(qū)及周圍重度碎屑?jí)乃?，小葉內(nèi)橋接壞死廣泛，累及多個(gè)小葉(多小葉壞死)為4級(jí)(G4)。NAS積分(0～8分)：(1)肝細(xì)胞脂肪變：0分(<5%)；1分(5%～33%)；2分(34%～66%)；3分(>66%)。(2)小葉內(nèi)炎癥(20倍鏡計(jì)數(shù)壞死灶)：0分(無(wú))；1分(<2個(gè))；2分(2～4個(gè))；3分(>4個(gè))。(3)肝細(xì)胞氣球樣變：0分，無(wú)；1分，少見(jiàn)；2分，多見(jiàn)。NAS<3分可排除NASH，NAS>4分則可診斷NASH，介于兩者之間為NASH可能。規(guī)定不伴有小葉內(nèi)炎癥、氣球樣變和纖維化但肝脂肪變>33%者為非酒精性脂肪性肝，脂肪變達(dá)不到此程度者僅稱為肝細(xì)胞脂肪變。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀況觀察 造模階段：造模組大鼠逐漸出現(xiàn)皮毛光澤度變差，活動(dòng)量減少，食欲降低，大便質(zhì)軟、稀，飲水增多，而空白組大鼠普遍毛發(fā)光整，活動(dòng)力強(qiáng)，進(jìn)食飲水量無(wú)異常，大便性狀正常。干預(yù)階段：經(jīng)灌胃干預(yù)后，易善復(fù)組、威靈仙多糖組大鼠食欲欠佳，活動(dòng)力、皮毛不光整情況較模型組有所改善；但各組大鼠體質(zhì)量增加都相對(duì)緩慢；對(duì)照組大鼠進(jìn)食飲水量無(wú)異常、活動(dòng)力正常、毛發(fā)較為光整。模型組、易善復(fù)組、威靈仙多糖組大便性狀仍舊軟、稀，飲水仍較多，三組間無(wú)明顯差異,且與造模期間比較無(wú)明顯差異；對(duì)照組大便性狀正常。

2.2 各組大鼠胰島素抵抗情況 造模階段：隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)，造模組HOMA-IR逐漸升高，空白組HOMA-IR未見(jiàn)明顯升高，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表1)。干預(yù)階段：采用ELISA法檢測(cè)，實(shí)際測(cè)出血液樣品：對(duì)照組5份、模型組8份、威靈仙多糖組10份、易善復(fù)組9份。對(duì)照組HOMA-IR與模型組HOMA-IR間的差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；威靈仙多糖組與模型組間的差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；易善復(fù)組與模型組間的差異存在顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；對(duì)照組、威靈仙多糖組和易善復(fù)組兩兩比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)表2)。

表1 造模階段空白組和造模組的HOMA-IR比較Tab 1 Comparison of HOMA-IR between blank group and building model group in modeling stage

表2 干預(yù)階段各組的HOMA-IR比較Tab 2 Comparison of HOMA-IR among 4 groups in intervention stage

2.3 各組大鼠血清RBP4的含量 干預(yù)結(jié)束后，對(duì)照組與模型組RBP4差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；威靈仙多糖組與模型組間的差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；易善復(fù)組與模型組間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；對(duì)照組、威靈仙多糖組和易善復(fù)組兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)表3)。

2.4 光鏡下造模階段肝臟病理學(xué)變化 造模組4周末表現(xiàn)為：Ⅱ度肝細(xì)胞脂肪變(NAS積分2分)，肝細(xì)胞部分氣球樣變(NAS積分1分)，未見(jiàn)炎癥壞死(NAS積分0分)，NAS總積分3分；8周末表現(xiàn)為：Ⅳ度肝細(xì)胞脂肪變(NAS積分3分)，肝細(xì)胞較多氣球樣變(NAS積分2分)，部分門管區(qū)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及小葉內(nèi)多數(shù)灶狀壞死(NAS積分3分)，NAS總積分8分；12周末表現(xiàn)為：Ⅳ度肝細(xì)胞脂肪變(NAS積分3分)、肝細(xì)胞較多氣球樣變(NAS積分2分)，小葉內(nèi)少數(shù)點(diǎn)狀壞死(NAS積分2分)，NAS總積分7分；16周末表現(xiàn)為：Ⅳ度肝細(xì)胞脂肪變(NAS積分3分)，肝細(xì)胞較多氣球樣變(NAS積分2分)，部分門管區(qū)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及小葉內(nèi)多數(shù)灶狀壞死(NAS積分3分)，NAS總積分8分(見(jiàn)圖1)?？瞻捉M4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的情況類似，均未見(jiàn)明顯肝細(xì)胞脂肪變或氣球樣變或炎癥壞死，NAS總分為0(見(jiàn)圖2)。

表3 各組大鼠血清RBP4含量(ng/ml)Tab 3 Levels of RBP4 in each group (ng/ml)

2.5 大鼠血清RBP4與HOMA-IR的相關(guān)性 HOMA-IR與RBP4的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析，r=0.541(P=0.001)，二者呈正相關(guān)關(guān)系(見(jiàn)圖3)。

圖1 造模組肝臟病理學(xué)變化(200×) A:4周末; B:8周末; C:12周末; D:16周末Fig 1 Pathological changes of liver in building model group (200×) A: 4 weeks; B: 8 weeks; C: 12 weeks；D： 16 weeks

圖2 空白組肝臟病理學(xué)變化(200×) A:4周末; B:8周末; C:12周末; D:16周末Fig 2 Pathological changes of liver in the blank group (200×) A: 4 weeks; B: 8 weeks; C: 12 weeks；D： 16 weeks

圖3 RBP4與HOMA-IR的相關(guān)性分析Fig 3 Correlation analysis of RBP4 and HOMA-IR

3 討論

NAFLD的發(fā)病機(jī)制至今仍不明確，二次打擊學(xué)說(shuō)是被廣泛接受的一種學(xué)說(shuō)，其中首次打擊就是以胰島素抵抗為關(guān)鍵環(huán)節(jié)所致的肝臟脂肪變性和脂質(zhì)沉積[5]。由于發(fā)病機(jī)制尚不明確，因此缺乏明確有效的長(zhǎng)期治療藥物。威靈仙是一種常用的中藥，含有皂甙類、黃酮類、生物堿類化合物、糖類等多種成分[6]。研究[7]發(fā)現(xiàn)，植物多糖有抗炎、抗衰老等多樣的生物學(xué)功能，并參與了生物體免疫功能的調(diào)節(jié)。還有研究[8]發(fā)現(xiàn)，蟲(chóng)草多糖對(duì)免疫性肝損傷及化學(xué)性肝損傷有保護(hù)作用，黨參多糖能有效降低糖尿病小鼠升高的血糖、TC、TG水平，并抑制小鼠的糖異生，調(diào)節(jié)糖脂代謝，有效改善胰島素抵抗[9]。

RBP4是近年發(fā)現(xiàn)的一種新的脂肪因子，大部分RBP4是在肝臟中合成，其次為脂肪組織(占肝臟的20%～40%)，它廣泛分布在人的血液、腦脊液、尿液等體液中，但血液中含量最高[10]。RBP4能激活脂肪組織中巨噬細(xì)胞的JNK信號(hào)通路，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、TNF-α等促炎因子，激活脂肪組織中的炎性信號(hào)通路，阻礙正常的酪氨酸磷酸化，導(dǎo)致胰島素抵抗[11]。血清中高水平RBP4可通過(guò)Toll樣受體4激活巨噬細(xì)胞，產(chǎn)生一系列的炎癥、免疫反應(yīng)，激活I(lǐng)κB激酶(IκB kinase，IKK)，激活的IKK一方面抑制胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，另一方面上調(diào)炎性因子水平，進(jìn)一步通過(guò)JNK、IKK、細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3，SOCS-3)形成一種低度的炎性信號(hào)環(huán)境，加速胰島素抵抗的發(fā)展[12]。在本研究中，大鼠HOMA-IR在模型組與空白組存在差異，大鼠血清RBP4水平在模型組與空白組存在差異，HOMA-IR與RBP4呈正相關(guān)關(guān)系。說(shuō)明RBP4參與了NASH的發(fā)生發(fā)展，機(jī)制可能是通過(guò)激活不同的因子、酶及相關(guān)炎癥通路等，影響胰島素對(duì)物質(zhì)的代謝調(diào)節(jié)作用和胰島素正常的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終出現(xiàn)胰島素抵抗，并導(dǎo)致NASH的產(chǎn)生。

植物多糖具有降血糖、調(diào)節(jié)血脂、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤等多種多樣的藥理作用[13]。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)藥物干預(yù)后表明：威靈仙多糖組HOMA-IR較模型組有所下降，威靈仙多糖組血清RBP4較模型組有所下降，說(shuō)明威靈仙多糖可有效降低NASH大鼠的血清RBP4水平，進(jìn)而改善胰島素抵抗。本研究肯定了威靈仙多糖對(duì)NASH大鼠胰島素抵抗的改善作用。

[1]Yin J,Li WP. Research progress in the pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease [J]. Sichuan Journal of Physiological Sciences,2012,34(3): 126-130. 殷杰,李萬(wàn)平. 非酒精性脂肪肝的發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 四川生理科學(xué)雜志,2012,34(3): 126-130.

[2]Liu BS,Li Q. Research progress of new adipocytokines and cytokines in non-alcoholic fatty liver disease [J]. J Med Postgra,2013,26(11): 1211-1214. 劉濱菘,李強(qiáng). 脂肪及細(xì)胞因子與非酒精性脂肪性肝病關(guān)系的研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào),2013,26(11): 1211-1214.

[3]Yang Q,Graham TE,Mody N,et al. Serum retinol binding protein 4 contributes to insulin resistance in obesity and type 2 diabetes [J]. Nature,2005,436(7049): 356-362.

[4]Terra X,Auguet T,Broch M,et al. Retinol binding protein-4 circulating levels were higher in nonalcoholic fatty liver disease vs. histologically normal liver from morbidly obese women [J]. Obesity (Silver Spring),2013,21(1): 170-177.

[5]Zhou YM,Bao JF. Research progress in the relationship between non-alcoholic fatty liver disease and liver cancer [J]. Chinese J Exp Clin Virol,2014,28(2): 159-161. 周語(yǔ)媚,包劍鋒. 非酒精性脂肪肝與肝癌關(guān)系的研究進(jìn)展[J]. 中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志,2014,28(2): 159-161.

[6]Yang YG,Lv GF,Li H,et al. Research of chemical constituents and pharmacological effects of clematis [J]. Journal of Changchun University of Traditional Chinese Medicine,2011,27(5): 861,873. 楊永剛,律廣富,李輝,等. 鐵線蓮屬植物的化學(xué)成分及藥理作用研究[J]. 長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2011,27(5): 861,873.

[7]Liu ZJ. Overview of the biological activity of plant polysaccharides [J]. Strait Pharmaceutical Journal,2014,26(5): 13-15. 劉正君. 植物多糖生物活性概述[J]. 海峽藥學(xué),2014,26(5): 13-15.

[8]Yu ZC. Screening studies on chemical constituents of Dicliptera chinensis polysaccharide and its hepatoprotective effective parts [D]. Guangdong Pharmaceutical University,2011. 于治成. 狗肝菜的化學(xué)成分及其多糖保肝有效部位篩選研究[D]. 廣東藥學(xué)院,2011.

[9]Fu PP. Study on codonopsis polysaccharide hypoglycemic effect and mechanism [D]. Jilin University,2008. 傅盼盼. 黨參多糖降血糖作用及其機(jī)制的研究[D]. 吉林大學(xué),2008.

[10]Li DL,Zhang JY. Relationship between retinol binding protein 4 and diabetic vascular impairment (review) [J]. Chin J Rehabil Theory Pract,2015,21(1): 62-64. 李丹玲,張景義. 視黃醇結(jié)合蛋白4與糖尿病血管病變的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2015,21(1): 62-64.

[11]Norseen J,Hosooka T,Hammarstedt A,et al. Retinol-binding protein 4 inhibits insulin signaling in adipocytes by inducing proinflammatory cytokines in macrophages through a c-Jun N-terminal kinase- and toll-like receptor 4-dependent and retinol-independent mechanism [J]. Mol Cell Biol,2012,32(10): 2010-2019.

[12]Baker RG,Hayden MS,Ghosh S. NF-κB,inflammation,and metabolic disease [J]. Cell Metab,2011,13(1): 11-22.

[13]Liu J,Feng R,Zheng Y,et al. Advances in antitumor effect of medicine of polysaccharides containing [J]. China Pharmacy,2013,24(47): 4497-4500. 劉江,馮銳,鄭穎,等. 含多糖類中藥抗腫瘤作用的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)藥房,2013,24(47): 4497-4500.

(責(zé)任編輯：王全楚)

Intervention effect of polysaccharide of radix clematidis in RBP4 level and HOMA-IR of rats with non-alcoholic steatohepatitis

HU Minmin,WANG Wei,BI Hongzhong,PAN Jin,JU Jian

Department of Special Wards Branch,the Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University,Kunming 650101,China

Objective To study the intervention effect of polysaccharide of radix clematidis (PRC) in insulin resistance of rats with non-alcoholic steatohepatitis (NASH) and the correlation between homeostasis model assessment of insulin resistance (HOMA-IR) and serum retinol binding protein 4 (RBP4) of rats with NASH. Methods Modeling stage: 14 rats were selected randomly from 50 clean healthy male SD rats and assigned to the blank group,then the remaining 36 rats were used as building model group. Blank group was reared with normal diet. Building model group was reared with high fat diet to establish the rat model of NASH. Intervention stage: after the experimental rat model of NASH establishing successfully,the remaining 30 rats of building model group were divided into model group,the polyene phosphatidyl choline (PPC) group,PRC group,randomly,each group contained 10 rats. The remaining 8 rats of blank group were used as the control group. Four groups were respectively intervened with 0.9% NS,PPC,PRC,and 0.9% NS by gavage. After 8 weeks,the fasting glucose,fasting insulin and serum RBP4 in each group were detected and the correlation of HOMA-IR and serum RBP4 was analyzed by statistical methods. Results HOMA-IR and the level of serum RBP4 in PRC group were lower than those in the model group (P<0.05). The HOMA-IR was positively related with serum RBP4 in NASH rats (r=0.541,P=0.001). Conclusion PRC is effective in treating NASH rats. The main mechanism may be improved insulin resistance of rats with NASH by reducing serum RBP4 levels.

Non-alcoholic steatohepatitis; Retinol binding protein 4; Polysaccharide of radix clematidis

云南省衛(wèi)生科技廳計(jì)劃項(xiàng)目(內(nèi)設(shè)機(jī)構(gòu))(2012ws 0091)

胡敏敏，碩士，研究方向：消化系統(tǒng)疾病。E-mail: angiemin@sina.com

琚堅(jiān)，教授，主任醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合方法治療消化系統(tǒng)疾病。E-mail:jujianyn@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.04.007

R575.5

A

1006-5709(2016)04-0386-05

2015-09-15