李彩麗，徐倩倩，孫澤群，盧光新

湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市人民醫(yī)院食管腫瘤研究所，湖北 十堰 442000

論著·大腸癌

奧沙利鉑不同濃度和時間對誘導(dǎo)大腸癌細胞系SW480耐藥效果的影響

李彩麗，徐倩倩，孫澤群，盧光新

湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市人民醫(yī)院食管腫瘤研究所，湖北 十堰 442000

目的 采取兩種方式體外誘導(dǎo)大腸癌耐奧沙利鉑耐藥細胞系，比較其耐藥機制。方法 分別采用低濃度長時間誘導(dǎo)法和高濃度短時間誘導(dǎo)法誘導(dǎo)大腸癌細胞系SW480，建立大腸癌奧沙利鉑(Oxaliplatin,OXP)耐藥細胞系SW480/OXP1和SW480/OXP2。CCK8法檢測SW480、SW480/OXP1和SW480/OXP2耐藥指數(shù)，繪制細胞生長曲線，檢測細胞周期分布；羅丹明123檢測細胞膜泵功能，Western blotting檢測P-gp和E-cadherin水平。結(jié)果 SW480/OXP1對OXP、5-氟尿、順鉑耐藥指數(shù)分別為10.34±0.35、3.32±0.52、2.76±0.26，SW480/OXP2對OXP、5-氟尿、順鉑耐藥指數(shù)分別為7.89±0.62、2.78±0.37、2.1±0.23；SW480、SW480/OXP1和SW480/OXP2的群體倍增時間分別為30.50 h、36.64 h和35.87 h。SW480/OXP1和SW480/OXP2的G0/G1比率較親本細胞上升，而S期比率較親本細胞下降；正常SW480的羅丹明123排出明顯緩于SW480/OXP1和SW480/OXP2。SW480/OXP1和SW480/OXP2的P-gp表達較SW480升高，且SW480/OXP1高于SW480/OXP2。SW480/OXP1和SW480/OXP2的E-cadherin表達均低于SW480，且SW480/OXP2低于SW480/OXP1。結(jié)論 OXP低濃度長時間誘導(dǎo)法和高濃度短時間誘導(dǎo)法都可使SW480產(chǎn)生多藥耐藥性，但是它們的特性仍有部分差異，應(yīng)按照需要選擇合適的誘導(dǎo)方式。

大腸癌；耐藥；奧沙利鉑

大腸癌是目前主要的致死性腫瘤之一，化療是目前臨床治療大腸癌的重要手段，盡管逐漸有新型化療藥物問世，但是化療藥物耐藥是大腸癌化療中不可回避的問題，建立耐藥細胞系是研究耐藥的產(chǎn)生、預(yù)防和逆轉(zhuǎn)耐藥的重要研究模型。我們采取奧沙利鉑體外誘導(dǎo)的方法，分別采取奧沙利鉑(Oxaliplatin,OXP)低濃度長時間接觸和高濃度短時間接觸的方式，建立了2株大腸癌耐藥細胞，現(xiàn)將具體情況總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 OXP購于江蘇恒瑞藥業(yè)，CCK8試劑盒購于日本同仁化學(xué)研究所，碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)和羅丹明123購于美國Sigma公司，抗P-gp抗體購于德國Merck公司，抗E-cadherin抗體購于Bioworld Technology公司。

1.2 細胞系與細胞培養(yǎng) 人結(jié)直腸癌SW480細胞系保存于本研究所細胞中心。細胞在含10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中貼壁生長，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.3 耐藥細胞系的建立 按照公式計算OXP峰值血漿濃度(peak plasma concentration,PPC)為4.5 μg/ml [PPC(μg/ml)=50×D×2×103/500，其中D指的是臨床應(yīng)用劑量(mg·kg-1·d-1)][1]。分別采取低濃度長時間誘導(dǎo)方式和高濃度短時間誘導(dǎo)方式誘導(dǎo)SW480對OXP耐藥。

1.3.1 低濃度長時間誘導(dǎo)法：SW480細胞貼壁后，換用含0.1×PPC濃度OXP的完全培養(yǎng)基，使OXP與SW480細胞持續(xù)接觸24 h后，棄培養(yǎng)液，換用不含OXP的完全培養(yǎng)基，待其恢復(fù)生長后，再次換用含0.1×PPC濃度OXP的培養(yǎng)液，24 h后撤藥換用完全培養(yǎng)基，待其恢復(fù)生長后換用含有0.125×PPC的OXP培養(yǎng)基，并重復(fù)1次。如此反復(fù)換液、傳代，以1.25～1.5倍的梯度逐步提高OXP濃度，直至其能耐受1×PPC濃度的OXP，將其維持培養(yǎng)在含1 μg/ml OXP的培養(yǎng)基中，常規(guī)凍存，命名為SW480/OXP1。

1.3.2 高濃度短時間誘導(dǎo)法：SW480細胞貼壁后，在培養(yǎng)液中加入OXP，使其終濃度為1 PPC，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，換用無藥完全培養(yǎng)基，待存活克隆出現(xiàn)并恢復(fù)生長后，重復(fù)1次，使OXP終濃度為2 PPC，培養(yǎng)2 h，換用無藥完全培養(yǎng)基，并逐漸提高OXP終濃度為4 PPC、6 PPC、8 PPC及10 PPC，并在10 PPC的濃度重復(fù)誘導(dǎo)數(shù)次，直至10 PPC的OXP作用2 h后對其生長無明顯影響，將其維持培養(yǎng)在含1 μg/ml OXP的培養(yǎng)基中，常規(guī)凍存，命名為SW480/OXP2。

1.4 CCK8法檢測耐藥性 取對數(shù)生長期的SW480細胞及SW480/OXP1、SW480/OXP2細胞，常規(guī)消化，制成1×105/ml細胞懸液，在96孔板中接種90 μl的細胞懸液，培養(yǎng)過夜，配制含OXP、5-氟尿(5-FU)、順鉑(Cisplatin,CDDP) 的培養(yǎng)液，并按照各種藥物的PPC(OXP：4.5 μg/ml，5-FU：10 μg/ml，CDDP：3.0 μg/ml)稀釋成不同的濃度梯度(0.01 PPC、0.1 PPC、1 PPC、10 PPC、100 PPC)，用含藥的培養(yǎng)液置換孔中的培養(yǎng)液，使每種藥物的每種濃度有3個復(fù)孔，同時設(shè)立無細胞僅有培養(yǎng)基的調(diào)零組和未加藥物的空白組，培養(yǎng)24 h，棄去孔中培養(yǎng)基，加入含10% CCK-8溶液的培養(yǎng)基100 μl，37 ℃孵育2 h，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。細胞抑制率(%)=(OD空白孔-OD待測孔)/(OD空白孔-OD調(diào)零孔)×100%。實驗重復(fù)3次，SPSS軟件計算半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory oncentration，IC50)，耐藥指數(shù)(resistance index,RI)=IC50(耐藥細胞)/IC50(親本細胞)。復(fù)蘇凍存后8周的SW480/OXP1、SW480/OXP2細胞，常規(guī)培養(yǎng)傳代，傳至第三代時，用上述方法檢測其RI。

1.5 繪制細胞生長曲線 取生長狀態(tài)良好的3種細胞，制備單細胞懸液，每種細胞接種4塊6孔板(5×104個/孔)，常規(guī)培養(yǎng)。每日取3孔細胞進行計數(shù)，并取平均值，連續(xù)觀察7 d。以培養(yǎng)時間為橫軸，細胞數(shù)為縱軸繪制生長曲線，據(jù)Patterson公式計算細胞在對數(shù)生長期的倍增時間：Td=Tlg2/lg(Nt/N0)；Td：倍增時間(h)；T：細胞數(shù)由N0增至Nt所用時間；Nt：T時間后細胞數(shù)；N0：初始細胞數(shù)。

1.6 細胞周期測定 收集對數(shù)生長期的3種細胞，棄上清，用預(yù)冷PBS洗細胞2次。加入預(yù)冷70%乙醇，4 ℃固定過夜，離心，PBS洗滌，加入500 μl PI染液(含50 μg/ml PI，100 μg/ml RNase A，0.2% Triton X-100)，4 ℃避光孵育30 min，上流式機。

1.7 羅丹明123排出實驗 制備單細胞懸液，以1×106/ml的濃度接種24孔板，過夜貼壁后進行實驗，在孔中加入羅丹明123使其終濃度為200 ng/ml，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)孵育30 min，洗滌3次，換用正常培養(yǎng)基繼續(xù)孵育60 min，熒光顯微鏡下觀察。

1.8 Western blotting檢測P-gp和E-cadherin水平 收集對數(shù)生長期的3種細胞，冰PBS洗2次,加入含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃離心，取上清；蛋白上樣量20 μg，10%的SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，電流12～15 mA，濕轉(zhuǎn)120 min，電壓70 V；1% BSA室溫封閉1 h，加小鼠抗P-gp(1∶100)和兔抗E-cadherin(1∶1 000)，4 ℃過夜，分別以羊抗鼠和羊抗兔二抗(1∶5 000)反應(yīng)2 h，ECL顯色，BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)掃描、分析。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)及一般狀況 SW480/OXP1誘導(dǎo)成功耗時8個月，SW480/OXP2誘導(dǎo)成功耗時6個月。在誘導(dǎo)過程中，加入含有OXP的培養(yǎng)基以及撤藥后一段時間內(nèi)，大部分細胞死亡，存活的細胞出現(xiàn)細胞形態(tài)異常：如細胞變大或皺縮，胞內(nèi)空泡增多，形態(tài)不規(guī)則等，并且在撤藥后一段時間內(nèi)仍有細胞逐漸死亡，存活的細胞多成集落樣生長，并逐漸恢復(fù)正常梭狀形態(tài)。最終誘導(dǎo)成功的耐藥細胞與正常SW480細胞形態(tài)接近親本，但略細長。

2.2 耐藥性 2種方法誘導(dǎo)的耐藥細胞誘導(dǎo)成功后，與親本細胞同時行CCK8實驗，獲得其耐藥指數(shù)如表1所示。其中SW480/OXP1和SW480/OXP2對OXP的RI分別為10.34±0.35和7.89±0.62，SW480/OXP1的RI高于SW480/OXP2，經(jīng)過凍存后SW480/OXP1對OXP的耐藥指數(shù)略下降，而SW480/OXP2經(jīng)凍存后耐藥指數(shù)下降不明顯。同時SW480/OXP1和SW480/OXP2對5-FU和CDDP均產(chǎn)生2～3倍的耐藥性，且凍存后耐藥性較穩(wěn)定。

表1 3種細胞的耐藥性Tab 1 The resistance indexes of SW480,SW480/OXP1 and SW480/OXP2 ±s)

注：與凍存前同種細胞相比，*P>0.05；與SW480/OXP1相比，@P<0.05。

2.3 細胞生長曲線和細胞群體倍增時間 經(jīng)觀察得到3種細胞的每日細胞數(shù)后，以培養(yǎng)時間為橫軸，細胞數(shù)為縱軸繪制生長曲線如圖1 所示，經(jīng)公式計算SW480、SW480/OXP1和SW480/OXP2的群體倍增時間分別為30.50 h、36.64 h和35.87 h。

圖1 細胞生長曲線Fig 1 Cell growth curve

2.4 細胞周期變化 SW480/OXP1和SW480/OXP2的G0/G1比率較親本細胞上升，而S期比率較親本細胞下降(見表2)。

表2 細胞周期的變化Tab 2 The changes of cell cycle for SW480,SW480/OXP1 and SW480/OXP2 ±s,%)

注：與SW480相比,*P<0.05。

2.5 羅丹明123排出實驗 如圖2所示，羅丹明123可進入細胞，積聚在核膜和胞漿周圍，發(fā)出明亮的綠色熒光，孵育60 min后，SW480/OXP1和SW480/OXP2可觀察到明顯的熒光減弱，而正常SW480的熒光排出明顯緩于SW480/OXP1和SW480/OXP2。

2.6 P-gp和E-cadherin蛋白表達 SW480/OXP1和SW480/OXP2的P-gp表達較SW480升高，且SW480/OXP1高于SW480/OXP2。SW480/OXP1和SW480/OXP2的E-cadherin表達均低于SW480，且SW480/OXP2低于SW480/OXP1(見圖3)。

3 討論

耐藥細胞系是研究耐藥的產(chǎn)生，預(yù)防和逆轉(zhuǎn)耐藥的重要研究模型。目前OXP是大腸癌化療的一線藥物，為了獲得具有穩(wěn)定耐藥性的結(jié)腸癌細胞，我們使用具有一定天然耐藥性的SW480細胞系[1]為親本細胞，在此基礎(chǔ)上，采取體外誘導(dǎo)的方法進一步誘導(dǎo)其耐藥性的產(chǎn)生，并比較取OXP小劑量遞增和大劑量間歇給藥兩種不同的方式對于耐藥性產(chǎn)生的關(guān)系。最終獲得了SW480/OXP1和SW480/OXP2，且均具有一定的多藥耐藥性。2株耐藥細胞經(jīng)常規(guī)凍存后耐藥性均較穩(wěn)定，但SW480/OXP2穩(wěn)定性更佳。SW480/OXP1和SW480/OXP2的群體倍增時間均高于親本細胞。細胞的群體倍增時間可反映細胞的生長速度，也影響細胞的匯合，當細胞的自然生長超過群體倍增時間時，可導(dǎo)致細胞的凋亡和壞死，而腫瘤的倍增時間越長，對化療的敏感性就越差[1]。細胞倍增時間的改變也可能是導(dǎo)致耐藥的原因之一。2株耐藥細胞還出現(xiàn)了G0/G1期比率上升和S期比率下降的情況。而大部分細胞周期特異性化療藥均作用于S期或M期，OXP也對從S期到G2/M期的過程影響較大[2]，這種周期的改變或許有利于耐藥細胞逃避化療藥物毒性。

圖2 羅丹明123排出實驗(100×)Fig 2 Rhodamine 123 efflux of SW480,SW480/OXP1,and SW480/OXP2 (100×)

注：與SW480相比，*P<0.05；與SW480/OXP1相比，**P<0.05。圖3 P-gp和E-cadherin蛋白表達 A：相對表達水平；B：蛋白條帶Fig 3 Western blotting assay in P-gp and E-cadherin expression A: relative expression level; B: protein bands

P-糖蛋白(P-gp)是重要的膜泵蛋白，與多數(shù)腫瘤細胞耐藥有關(guān)，羅丹明123是P-gp的作用底物，通過羅丹明123在細胞內(nèi)殘留的情況，可反映細胞膜的泵功能。而誘導(dǎo)的2株耐藥細胞的羅丹明123的排出能力高于親本細胞，P-gp的表達也較親本細胞上升，其中SW480/OXP1的上升幅度高于SW480/OXP2。這說明所誘導(dǎo)的2株耐藥細胞的P-gp的表達及功能均較親本細胞升高。此外，所誘導(dǎo)的2株耐藥細胞的E-cadherin表達均較親本細胞明顯下降，且SW480/OXP2的下降幅度高于SW480/OXP2。E-cadherin下降是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的重要標志物[3]。即在采取兩種方法誘導(dǎo)SW480細胞耐藥的過程中均出現(xiàn)了EMT 現(xiàn)象，EMT與P-gp的表達有一定的聯(lián)系[4]，且這兩者的表達受一些多共同的信號通路調(diào)節(jié)[5]。但是，SW480/OXP1和 SW480/OXP2的P-gp和E-cadherin表達也存在一定的差異性。有研究顯示，只有長時間接觸化療藥物后才引起P-gp轉(zhuǎn)錄增加、蛋白表達[6]。SW480/OXP1為逐漸的小劑量化療藥物接觸，藥物接觸時間相對較長，利于P-gp的誘導(dǎo)，而相對于SW480/OXP2較短的峰值濃度接觸，高濃度的藥物作用，更容易篩選出腫瘤細胞群體中的干系克隆，而EMT現(xiàn)象與腫瘤干細胞的產(chǎn)生有關(guān)，故可能更容易出現(xiàn)E-cadherin的下降,但具體機制尚待進一步研究。

綜上，采取OXP低濃度長時間誘導(dǎo)法和高濃度短時間誘導(dǎo)，都可使SW480產(chǎn)生對OXP的耐藥，并對5-FU和DDP等均產(chǎn)生一定程度的耐藥，耐藥細胞均表現(xiàn)為倍增時間延長，G0/G1期延長，對羅丹明123排出加快，P-gp表達增加、E-cadherin表達下降，但是低濃度長時間誘導(dǎo)的細胞的耐藥指數(shù)和P-gp表達高于高濃度短時間誘導(dǎo)，而其E-cadherin表達減弱程度則低于高濃度短時間誘導(dǎo)。

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(責任編輯：馬 軍)

Effects of different concentrations and time of Oxaliplatin for induced colorectal cancer cell line SW480 resistance

LI Caili,XU Qianqian,SUN Zequn,LU Guangxin

Institute of Esophageal Tumor,Remin Hospital,Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,China

Objective To induce the Oxaliplatin (OXP) resistant colorectal cancer cell lines by two different methods,and compare their characteristics and analyze the mechanisms. Methods Two resistant cell lines were established: SW480/OXP1 and SW480/OXP2. They were induced from colorectal cancer cell line SW480 by exposing them to OXP with low concentration and long time or high concentration and short time respectively,and gradually increasing dose of OXP. The cell growth curve and the doubling time were determined by cell counting. The chemosensitivities of SW480,SW480/OXP1 and SW480/OXP2 to OXP,Cisplatin,and 5-fluorouracil were tested and IC50was measured by CCK8. The cell cycle was examined by flow cytometry. The function of P-gp was determined by Rhodamine 123,the expressions of P-gp and E-cadherin were determined by Western blotting. Results The resistance indexes to OXP,5-fluorouracil and Cisplatin of SW480/OXP1 were 10.34±0.35,3.32±0.52,2.76±0.26,respectively. The resistance indexes to OXP,5-fluorouracil and Cisplatin of SW480/OXP2 were 2 7.89±0.62,2.78±0.37,2.1±0.23,respectively. The population double time of SW480,SW480/OXP1 and SW480/OXP2 were 30.50 h,36.64 h and 35.87 h. The number of the SW480/OXP1 and SW480/OXP2 cells exhibiting G0/G1phase increased and the S phase decreased than SW480 cells. The fluorescence effluence of Rhodamine 123 for SW480/OXP1 and SW480/OXP2 was faster than SW480. The P-gp expression of SW480/OXP1 and SW480/OXP2 was higher than SW480,and the SW480/OXP1 was higher than SW480/OXP2. The E-cadherin expression of SW480/OXP1 and SW480/OXP2 was lower than SW480,and the SW480/OXP2 was lower than SW480/OXP1.Conclusion The two methods can induce multidrug-resistant colorectal cancer cell lines,but their characteristics are partially different.

Colorectal cancer; Drug-resistance; Oxaliplatin

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.02.005

湖北省教育廳科研計劃支持(B20122425)

李彩麗，副教授，碩士，研究方向：消化道疾病基礎(chǔ)。E-mail: licailili@163.com

孫澤群，主任醫(yī)師，博士，研究方向：消化道腫瘤。E-mail: wwwszq@163.com

R735.3+4

A

1006-5709(2016)02-0134-05

2015-05-27