劉 波, 李 超, 陶玉芬, 李昕潼, 劉建生, 和占龍, 劉紅旗

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所, 昆明650118)

猴源GII.17 型諾如病毒基因組 P 結(jié)構(gòu)域及其變體的原核表達(dá)、純化和抗原性鑒定

劉 波, 李 超*, 陶玉芬, 李昕潼, 劉建生, 和占龍, 劉紅旗

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所, 昆明650118)

目的 表達(dá)、純化和鑒定猴源GII.17型諾如病毒(NoV)基因組P結(jié)構(gòu)域及其變體蛋白。方法 基于本實(shí)驗(yàn)室獲得的猴源GII.17型NoV 基因組P結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列，按大腸桿菌密碼子使用的偏好性優(yōu)化P結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列，人工合成相應(yīng)的基因。以此基因?yàn)槟０?，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增得到P結(jié)構(gòu)域的變體基因。采用無(wú)縫連接的方法將P結(jié)構(gòu)域基因及其變體克隆到原核表達(dá)載體，進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)和純化。最后，通過(guò)免疫印跡法和ELISA法分析表達(dá)蛋白的抗原性。結(jié)果 測(cè)序結(jié)果表明，P結(jié)構(gòu)域及其變體成功地克隆至原核表達(dá)載體。SDS-PAGE分析顯示，P結(jié)構(gòu)域在原核細(xì)胞的超聲裂解上清和沉淀中都有表達(dá)，而其變體主要表達(dá)于上清。免疫印跡和ELISA結(jié)果顯示，表達(dá)純化得到的P結(jié)構(gòu)域及其變體蛋白具有很好的抗原性。表達(dá)的蛋白免疫小鼠制備的相應(yīng)抗體ELSIA效價(jià)可達(dá)到1∶32 000。結(jié)論 成功地表達(dá)了猴源GII.17 NoV基因組 P結(jié)構(gòu)域及其變體蛋白，并且通過(guò)免疫小鼠得到了相應(yīng)的抗體，為后期檢測(cè)試劑盒的研發(fā)、病毒鑒定和病毒受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

猴; 諾如病毒基因組; P結(jié)構(gòu)域; 蛋白表達(dá); 抗原性

諾如病毒(Norovirus, NoV)是導(dǎo)致非細(xì)菌性急性胃腸炎的主要病原體, 是近年來(lái)導(dǎo)致人類由腹瀉引起的發(fā)病率和死亡率增高的主要原因[1]。該病易在醫(yī)院、療養(yǎng)院、學(xué)校等人員密集、半封閉的環(huán)境中引起暴發(fā)性流行[2,3]。盡管所有年齡人群對(duì)該病毒均敏感，但該病毒對(duì)兒童和免疫缺陷人群健康的威脅最為嚴(yán)重[4,5]。人群中NoV自1990年代首次確認(rèn)到2014年, 世界范圍主要流行GII.4基因型。近年來(lái), GII.17型開(kāi)始出現(xiàn), 并且成為亞洲主要流行基因型[6-8]。有報(bào)道[9-11]人NoV也能感染豬和犬等動(dòng)物。

NoV屬于杯狀病毒科諾瓦克病毒屬，直徑為26～35 nm, 無(wú)包膜, 球形, 呈二十面體對(duì)稱，基因組為單股正鏈 RNA，全長(zhǎng)約為 7.5 kb, 包含三個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)。ORF1長(zhǎng)約5 kb，編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，經(jīng)翻譯后修飾成 6個(gè)功能蛋白。ORF2 長(zhǎng)約1.8 kb, 編碼541個(gè)左右氨基酸的衣殼蛋白(VP1)。VP1蛋白折疊成兩個(gè)區(qū)域: 殼區(qū)(S區(qū))和突出區(qū)(P區(qū))，其中S區(qū)為VP1的內(nèi)殼，P區(qū)位于VP1結(jié)構(gòu)的殼外, 包含P1和 P2兩個(gè)亞區(qū), P2亞區(qū)位于衣殼蛋白的最外層, 易發(fā)生變異。ORF3長(zhǎng)約 0.6 kb，編碼一個(gè)微小結(jié)構(gòu)蛋白(VP2)，VP2蛋白的具體功能還不是很清楚，它可能參與病毒衣殼的構(gòu)建，也可能有助于整個(gè)衣殼蛋白的穩(wěn)定。VP1蛋白的P區(qū)是病毒首先與受體結(jié)合的區(qū)域[12]，也是誘導(dǎo)中和抗體的主要抗原區(qū)[13]。因此，P區(qū)域不僅是研究病毒感染機(jī)制的靶點(diǎn)，也是疫苗研究的重點(diǎn)區(qū)域。

NoV的研究有兩大難點(diǎn)，一方面該病毒目前還不能在體外培養(yǎng)，另一方面還沒(méi)有人NoV感染的動(dòng)物模型，這兩方面給該病毒的致病機(jī)理研究和疫苗研發(fā)帶來(lái)極大的阻力[14,15]。近期，作者課題組從猴糞便樣品中獲得了GII.17型NoV基因組，本研究基于獲得的GII.17型病毒序列，根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好，對(duì)VP1的P結(jié)構(gòu)域核苷酸序列進(jìn)行了優(yōu)化，通過(guò)人工方法合成了P結(jié)構(gòu)域基因后，定向克隆到原核表達(dá)載體中，通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)和純化得到了P結(jié)構(gòu)域及其變體蛋白。ELISA和免疫印跡法確定目的蛋白具有良好的抗原性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)8周齡雄性BALB/c小鼠，由全國(guó)醫(yī)學(xué)靈長(zhǎng)類研究中心小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所)提供[SYXK(滇)2010-0007]。所有操作均按照醫(yī)學(xué)生物研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)要求進(jìn)行。

1.2 病毒、質(zhì)粒和菌株

猴源(獼猴)GII.17型NoV基因組和原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T1由本實(shí)驗(yàn)室保存。E.coli BL21(DE3)菌株和E.coli DH5α菌株購(gòu)自天根生物技術(shù)公司。

1.3 主要試劑

限制性內(nèi)切酶、無(wú)縫拼接試劑均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。PCR體系采用 GoTaq@G2 Green Master Mix購(gòu)自美國(guó) Promega 公司。ECL (Enhanced chemiluminescent method )底物顯色劑和BCA(二喹啉甲酸)蛋白定量分析試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。GST(Glutathione S-transferase)Trap FF 純化柱購(gòu)自德國(guó)GE公司?？笹ST單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司。佐劑購(gòu)自北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司。HRP標(biāo)記的抗鼠IgG抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.4 病毒基因及引物設(shè)計(jì)

基于研究組獲得的猴源GII.17NoV基因組的P結(jié)構(gòu)域核苷酸序列，根據(jù)大腸桿菌密碼子表達(dá)的偏好性對(duì)P結(jié)構(gòu)域核苷酸序列進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后的氨基酸序列沒(méi)有改變且對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)不造成影響。由北京唯尚立德生物科技有限公司技術(shù)人員進(jìn)行優(yōu)化并合成基因。

根據(jù)無(wú)縫拼接試劑盒的要求，設(shè)計(jì)P結(jié)構(gòu)域及其變體特異性引物(美國(guó)Invitrogen公司合成)。

P-RGD: 上游引物5′-T CTGGTTCCGCGTGGATCCTCTAAAACCAAACC-3′;

下游引物(1) 5′-GCAGAAGCAGTCACCACGGCAGTCGCACTGCGCACGACGG-3′;

(2) 5′-CAGTCAGTCACGATGCGGCCGCTTAGCAGAAGCAGTCACCAC-3′。

P ΔR: 上游引物5′-TCTGGTTCCGCGTGGATCCTCTAAAACCAAACC-3′;

下游引物5′-CAGTCAGTCACGATGCGGCCGCTTACCCATTCCCGGTGC-3′

1.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

為了便于后續(xù)的研究, 設(shè)計(jì)P結(jié)構(gòu)域引物時(shí), 加入了一段編碼RGD的核苷酸序列, 稱之為P-RGD。去掉P結(jié)構(gòu)域C端富含精氨酸的部分得到P結(jié)構(gòu)域變體, 稱之為PΔ R。用限制性內(nèi)切酶BamH I和Not I酶切表達(dá)載體pGEX-4T1。通過(guò)無(wú)縫拼接試劑盒分別將純化的PCR目的片段與線性化的載體進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5α。鑒定為陽(yáng)性的克隆經(jīng)測(cè)序確認(rèn)。測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，挑取含目的質(zhì)粒菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)或凍存保種。

1.6 P結(jié)構(gòu)域及其變體的誘導(dǎo)、表達(dá)和純化

過(guò)夜培養(yǎng)菌體以1∶50轉(zhuǎn)接入新鮮含抗生素的LB培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，待吸光值A(chǔ)600達(dá)到約0.5時(shí)，加入終濃度為0. 5 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，于22℃、220 r/min過(guò)夜誘導(dǎo)培養(yǎng)。次日，收集菌體，超聲破碎，通過(guò)考馬斯亮藍(lán)染色鑒定蛋白表達(dá)形式。采用GST親和柱純化目的蛋白，然后通過(guò)超濾濃縮的方法更換緩沖液。牛凝血蛋白酶切割GST標(biāo)簽，再用GST親和柱去除GST獲得不含標(biāo)簽的目的蛋白，BCA蛋白定量試劑盒和考馬斯亮藍(lán)染色分別檢測(cè)蛋白濃度和純度。1.7 表達(dá)蛋白的抗原性檢測(cè)

以40 μg蛋白輔以相等體積的佐劑免疫8周齡BABL/c小鼠。免疫完成后2周通過(guò)眼球采血獲得小鼠血清。用酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)做血清學(xué)效價(jià)分析，以樣品A450值與陰性對(duì)照A450值的比值(P/N)大于2判定樣品為陽(yáng)性。以免疫后小鼠血清(1∶1 000)作為一抗， 辣根過(guò)氧化酶(HRP)標(biāo)記的鼠抗IgG(1∶5 000)為二抗，進(jìn)行免疫印跡分析蛋白的抗原性。

2 結(jié)果

2.1 P結(jié)構(gòu)域及其變體原核表達(dá)載體的構(gòu)建

P結(jié)構(gòu)域(P-RGD)及P結(jié)構(gòu)域變體(PΔ R)結(jié)構(gòu)示意如圖1A所示。以合成的基因?yàn)槟０? 用P-RGD和PΔR特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。電泳結(jié)果表明,得到了預(yù)期大小約1 kb的目的片段(圖1B)。核苷酸測(cè)序結(jié)果表明, P-RGD基因片段大小為957 bp，PΔR為945 bp，與預(yù)期核苷酸序列一致。

2.2 P結(jié)構(gòu)域及其變體的原核表達(dá)

P結(jié)構(gòu)域及其變體的重組質(zhì)粒表達(dá)后經(jīng)SDSPAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色分析，結(jié)果表明，沒(méi)有進(jìn)行密碼子優(yōu)化的基因，幾乎檢測(cè)不到其對(duì)應(yīng)的蛋白表達(dá)(圖2A)。而根據(jù)大腸桿菌表達(dá)的密碼子偏好對(duì)其核苷酸序列進(jìn)行優(yōu)化后，與未進(jìn)行誘導(dǎo)的對(duì)照相比，在相對(duì)分子質(zhì)量為60 000Da的位置有明顯表達(dá)的蛋白條帶，與預(yù)期分子量相符。P-RGD以可溶性蛋白和包涵體兩種形式存在，而PΔR以可溶性蛋白為主(圖2B)。

2.3 P結(jié)構(gòu)域及其變體蛋白的純化和鑒定

P結(jié)構(gòu)域及其變體蛋白通過(guò)GST親和柱進(jìn)行純化后，SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色分析顯示，2個(gè)蛋白在預(yù)期60 000Da的位置都有比較單一的條帶(圖3A)。進(jìn)一步用抗GST單克隆抗體通過(guò)免疫印跡法進(jìn)行了分析，確認(rèn)純化得到的蛋白為GST融合蛋白(圖3B)。

圖1 P結(jié)構(gòu)域及其變體的PCR擴(kuò)增

圖2 P結(jié)構(gòu)域及其變體的原核表達(dá)

圖3 P結(jié)構(gòu)域及其變體蛋白的純化和鑒定

2.4 P結(jié)構(gòu)域及其變體蛋白的抗原性

純化得到的GST融合蛋白經(jīng)牛凝血蛋白酶切割后，再次經(jīng)GST親和柱除去GST標(biāo)簽得到不含GST的目的蛋白(圖4A)。用該蛋白免疫小鼠制備相應(yīng)的抗血清。經(jīng)免疫印跡分析顯示, 盡管P-RGD誘導(dǎo)的抗體還含有抗GST的成分，但是P-RGD和PΔR與免疫后血清有特異的反應(yīng)，說(shuō)明純化蛋白具有抗原性(圖4B)。ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，我們所獲得的血清效價(jià)均可達(dá)到1∶32 000(圖5)。

3 討論

盡管NoV性胃腸炎在大部分病人通常僅引起輕微癥狀，病程較短，且一般可自愈，但給生活帶來(lái)極大困擾，影響工作和軍人的戰(zhàn)斗力[16]，尤其是對(duì)于兒童和免疫力低下或缺陷的人群，嚴(yán)重時(shí)可以導(dǎo)致死亡[4,5]。NoV的檢測(cè)和疫苗免疫是目前防治該病的有效措施。本研究通過(guò)原核系統(tǒng)成功地表達(dá)和純化了猴源GII.17型NoV的P結(jié)構(gòu)域及其變體，并且證明了這兩個(gè)蛋白具有很好的抗原性。

圖4 P結(jié)構(gòu)域及其變體蛋白的抗原性分析

圖 5 抗P結(jié)構(gòu)域及其變體血清效價(jià)測(cè)定

由于NoV目前無(wú)法在體外進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)[17]，因此，對(duì)于NoV的致病機(jī)制和疫苗的研究都是通過(guò)表達(dá)病毒蛋白進(jìn)行細(xì)胞外實(shí)驗(yàn)研究。VP1是NoV的囊膜蛋白，在病毒與宿主的相互作用機(jī)制中起非常重要的作用，尤其是其突出區(qū)(P區(qū))。P區(qū)在整個(gè)病毒粒子的最外面，是病毒與宿主細(xì)胞首先接觸的部位，也是誘導(dǎo)中和抗體的關(guān)鍵區(qū)域。因此，通過(guò)表達(dá)P區(qū)蛋白用于病毒致病機(jī)制和疫苗免疫機(jī)理研究[12,18]。本研究的病毒基因組來(lái)自于獼猴，表達(dá)的P區(qū)蛋白為研究猴NoV感染以及將來(lái)建立和評(píng)價(jià)非靈長(zhǎng)類動(dòng)物人NoV感染模型打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。P區(qū)蛋白在原核系統(tǒng)表達(dá)后，有時(shí)可以自行形成24聚體的納米顆粒，顯著增強(qiáng)其免疫原性。研究表明，在P結(jié)構(gòu)域末端加一個(gè)RGD序列將有助于納米顆粒的形成[13]。另外，P結(jié)構(gòu)域C端的精氨酸聚集區(qū)對(duì)于其與受體結(jié)合起重要作用[18]。因此，本研究在P結(jié)構(gòu)域的C端加了一個(gè)RGD序列，并且還構(gòu)建和表達(dá)了不含精氨酸聚集區(qū)的P結(jié)構(gòu)域變體，為將來(lái)猴唾液酸結(jié)合實(shí)驗(yàn)和其它病毒機(jī)制研究以及納米顆粒疫苗研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

原核表達(dá)系統(tǒng)是一個(gè)廉價(jià)和便捷的表達(dá)系統(tǒng)。然而，與真核表達(dá)系統(tǒng)相比，蛋白質(zhì)的可溶性和翻譯后修飾是該系統(tǒng)的兩個(gè)不足之處[19]。本研究的P結(jié)構(gòu)域與其變體蛋白的區(qū)別在于變體蛋白沒(méi)有RGD和精氨酸聚集序列，這2個(gè)序列可能通過(guò)影響蛋白的P結(jié)構(gòu)域從而影響蛋白的可溶性。

總之，本研究獲得了具有較好抗原性的猴源GII.17型NoVP結(jié)構(gòu)域及其變體蛋白, 為將來(lái)GII.17型NoV檢測(cè)方法、唾液酸結(jié)合實(shí)驗(yàn)和疫苗等研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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Expression, Purification and Antigenicity of P Domain and Its Variant of Monkey GII.17 Norovirus Genome

LIU Bo, LI Chao, TAO Yu-fen, LI Xin-tong, LIU Jian-sheng, HE Zhan-long, LIU Hong-qi
(Institute of Medical Biology, Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College, Kunming 650118, China)

ObjectiveTo express P domain and its variant of monkey GII.17 norovirus genome, purify protein and analyze antigenicity.MethodsThe gene of P domain was synthesized, following designation based on the nucleotide sequence that was obtained from monkey GII.17 norovirus genome and bias of E. coli. PCR with these specific primers was performed to amplify P domain and make its variant, followed by cloning into prokaryotic expression vector via in-Fusion ligation. Protein expression was induced by IPTG, purified through GST affinity column and analyzed by Coomassie staining, immunoblot and ELISA assay.ResultsSequencing results showed that P domain and its variant were successfully cloned into the expression vector. Analysis of SDS-PAGE revealed that P domain was observed in both the supernatant and pellet, and its variant was mostly expressed in the supernatant. The expressed and purified proteins were further confirmed by immunoblot analysis via the anti-GST antibody. The results of immunoblot analysis and ELISA assay indicated the good antigenicity of the proteins. The ELISA titers of antibodies induced by these proteins were 1∶32000.ConclusionThe P domain and its variant of monkey GII.17 norovirus genome were successfully expressed. The antibodies were obtained after immunization of mice with these two proteins. The findings of this study pave the way for the development of viral detection kit, viral identification and assay of virus-receptor binding.

Monkey; Norovirus genome; P domain; Protein expression; Antigenicity

Q95-33

A

1674-5817(2016)05-0334-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.05.002

2016-06-20

云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2013FZ143); 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所重點(diǎn)項(xiàng)目(2014IMB03ZD); 云南省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(2015HC027)

劉 波(1990-), 女, 碩士研究生, 研究方向: 感染和免疫學(xué)。E-mail: LIUBO@imbcams.com.cn

*2014級(jí)碩士研究生

劉紅旗, 博士研究生, E-mail: lhq@Imbcams.com.cn