張濤，夏虹，尹慶水，李梅，張余，楊小明，藍國波

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鈣磷涂層鎂合金CaP-AZ31B對小鼠前成骨細胞生物學性能的影響

張濤，夏虹，尹慶水，李梅，張余，楊小明，藍國波

【摘要】目的研究鈣磷涂層鎂合金CaP-AZ31B對小鼠前成骨細胞MC3T3-E1生物學性能的影響。方法實驗分為鎂合金（AZ31B）組、鈦合金組和CaP-AZ31B組，觀察MC3T3-E1細胞在3組材料表面2、6、24 h的細胞黏附率；倒置顯微鏡觀察MC3T3-E1細胞與3組材料浸提液共培養(yǎng)1、3、5、7 d的細胞形態(tài)，同時采用CCK法和BCA法檢測其細胞增殖活力和細胞內(nèi)總蛋白。結(jié)果隨著培養(yǎng)時間的延長，3組材料的細胞黏附率、細胞增殖活力、細胞內(nèi)總蛋白量均顯著增加（P＜0.05）。其中CaP-AZ31B組2、6、24 h細胞黏附率＞鈦合金組＞AZ31B組（P＜0.05）；MC3T3-E1細胞在3組材料浸提液中貼壁均良好，大多呈長梭形；CaP-AZ31B組各時相點細胞增殖活力均優(yōu)于AZ31B組（P＜0.05）；細胞內(nèi)總蛋白量比較，CaP-AZ31B組＞鈦合金組＞AZ31B組（P＜0.05）。結(jié)論與鎂合金、鈦合金相比，鈣磷涂層鎂合金材料可明顯增強小鼠成骨細胞的黏附能力和增殖能力，促進細胞內(nèi)總蛋白的表達，具有良好的生物相容性。

【關(guān)鍵詞】鎂；合金；磷酸鈣類；涂層；生物相容性材料；小鼠；成骨細胞；細胞，培養(yǎng)的；黏附；增殖

作者單位：510010廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院骨科醫(yī)院全軍創(chuàng)傷骨科研究所全軍熱區(qū)創(chuàng)傷救治與組織修復(fù)重點實驗室（張濤，夏虹，尹慶水，李梅，張余，楊小明，藍國波）；510010廣州華博生物制藥研究所（張濤）

鈦合金是目前骨科常用的植入材料，但難以在人體內(nèi)降解，需行二次內(nèi)固定取出術(shù)，不但增加患者的痛苦，而且加重其經(jīng)濟負擔?？山到怄V合金能夠彌補鈦合金材料的上述缺陷，但降解速度較快，難以滿足臨床需要。運用表面改性技術(shù)對鎂合金進行鈣磷涂層可有效延緩鎂合金的降解速度，但目前尚不明確鈣磷涂層鎂合金對成骨細胞黏附、增殖等生物學性能的影響。本研究通過觀察小鼠前成骨細胞（MC3T3-E1細胞）在鈣磷涂層鎂合金表面的黏附性能，以及該合金浸提液對MC3T3-E1細胞增殖活性及細胞內(nèi)總蛋白量的影響，旨在進一步了解其生物相容性。

1　材料與方法

1.1主要儀器、材料和試劑

24孔、96孔培養(yǎng)板（Corning公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；TY-80s搖床（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠）；酶聯(lián)免疫檢測儀（鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司）。

鎂鋁合金（AZ31B）圓盤、鈣磷涂層鎂鋁合金（CaP-AZ31B）圓盤、鈦合金圓盤由中國科學院金屬所提供，直徑10 mm、厚3 mm。

α-MEM細胞培養(yǎng)液、優(yōu)等胎牛血清、胰蛋白酶（Hyclone公司，美國）；CCK-8試劑盒（同仁化學研究所，日本）；二甲基亞砜（DMSO，Sigma-A ldrich公司，美國）；BCA蛋白試劑盒（Pierce公司，美國）；Triton-X100（Sigma-Aldrich公司，美國）。

1.2浸提液制備

按材料表面積/浸提介質(zhì)為2.5 cm2/m L的比例［1］，分別向裝有CaP-AZ31B、AZ31B和鈦合金材料的容器中加入含10%胎牛血清的α-MEM細胞培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分別制備出CaP-AZ31B、AZ31B和鈦合金浸提液，4℃冷藏備用，24 h內(nèi)使用。

1.3細胞培養(yǎng)及分組

采用小鼠MC3T3-E1細胞作為實驗細胞，由中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫提供。加入含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，2～3 d換液1次，待細胞長至80%融合時進行傳代。實驗分為CaP-AZ31B組、AZ31B組和鈦合金組。

1.4早期細胞黏附率測定

將CaP-AZ31B、AZ31B和鈦合金試件分別置于3個24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每種試件18個。將MC3T3-E1細胞以1×105/孔分別接種于上述培養(yǎng)板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)2、6、24 h，每時相點取出1個培養(yǎng)板，每組取出6個試件。PBS漂洗3次，吸凈液體，0.25%胰蛋白酶1.0 mL消化1 min，用1.0 mL含血清培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min離心5 min，吹打制成細胞懸液，進行細胞計數(shù)，重復(fù)6次，取平均值，計算細胞黏附率。細胞黏附率=已貼壁細胞數(shù)/植入細胞總數(shù)×100%。

1.5細胞形態(tài)、增殖活力及總蛋白測定

將1×104/mL細胞懸液接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后更換為3種條件浸提液，2 d換液1次，分別培養(yǎng)1、3、5、7 d。

1.5.1細胞形態(tài)觀察使用倒置相差顯微鏡進行觀察。

1.5.2細胞增殖活力測定棄浸提液，PBS清洗后加入CCK-8試劑20 μL后繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶聯(lián)免疫檢測儀測定450 nm處光密度（optical density，OD）值。

1.5.3細胞內(nèi)總蛋白量測定PBS沖洗3遍，加入0.2%Triton-X100 200 μL裂解細胞，4℃冰箱過夜，分別吸取25 μL各組裂解液加入新的96孔板中，然后加入200 μL BCA蛋白試劑盒顯色劑，振動30 s。將細胞培養(yǎng)板置于37℃下孵育30 min，取出培養(yǎng)板，冷卻至室溫，酶標儀測定562 nm處OD值。根據(jù)蛋白濃度與OD值之間的函數(shù)關(guān)系計算各種樣品的吸附蛋白量，每組重復(fù)6次。

1.6統(tǒng)計學方法

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x-±s）表示，多組比較采用多因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1早期細胞黏附率

如表1所示，隨著時間的延長，3組材料細胞黏附率均顯著增加，不同時相點之間比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。CaP-AZ31B組2、6、24 h細胞黏附率＞鈦合金組＞AZ31B組，組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2細胞形態(tài)

如圖1所示。3組材料浸提液培養(yǎng)的細胞均貼壁良好，大多呈長梭形，未見明顯的細胞密度差異。其中CaP-AZ31B組MC3T3-E1細胞增殖良好，未見明顯細胞死亡，局部可見部分脫落的鈣磷涂層顆粒。

2.3細胞增殖活力

如表2所示，隨著培養(yǎng)時間的延長，3組細胞增殖活力均逐漸增加（P＜0.05）。其中CaP-AZ31B組培養(yǎng)1、3、5、7 d時細胞增殖活力均優(yōu)于AZ31B組（P＜0.05）；3、5 d時低于鈦合金組（P＜0.05），1、7 d時與鈦合金組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.4細胞內(nèi)總蛋白量

如表3所示，隨著培養(yǎng)時間的延長，3組細胞內(nèi)總蛋白量均逐漸增加（P＜0.05），且在每個時相點均表現(xiàn)為CaP-AZ31B組＞鈦合金組＞AZ31B組（P＜0.05）。

表1　不同時相點3組材料細胞黏附率比較結(jié)果（±s，n = 6，%）

表1　不同時相點3組材料細胞黏附率比較結(jié)果（±s，n = 6，%）

注：AZ31B：鎂合金；CaP-AZ31B：鈣磷涂層鎂合金；與鈦合金組比較，*P＜0.05；與AZ31B組比較，#P＜0.05

分組鈦合金組AZ31B組CaP-AZ31B組F值P值時相點2 h 27.6±2.1 24.0±2.3*34.2±1.5*#40.125 0.000 6 h 34.9±2.3 29.1±1.9*43.7±1.6*#86.006 0.000 24 h 50.2±2.1 37.3±1.5*62.8±2.0*#276.164 0.000 F值309.070 60.434 561.043 P值0.000 0.000 0.000

圖1　小鼠前成骨細胞與3組材料浸提液共培養(yǎng)5 d倒置顯微鏡形態(tài)（×100）1A鈦合金組1B鎂合金組1C鈣磷涂層鎂合金組可見部分脫落的鈣磷涂層顆粒

表2　不同時相點3組細胞增殖活力（OD值）比較結(jié)果（x-±sn = 6）

表2　不同時相點3組細胞增殖活力（OD值）比較結(jié)果（x-±sn = 6）

注：OD：光密度；AZ31B：鎂合金；CaP-AZ31B：鈣磷涂層鎂合金；與鈦合金組比較，*P＜0.05；與AZ31B組比較，#P＜0.05

分組鈦合金組AZ31B組CaP-AZ31B組F值P值時相點1 d 0.368±0.011 0.291±0.011*0.360±0.018#80.369 0.000 3 d 0.722±0.009 0.548±0.012*0.689±0.020*#220.544 0.000 5 d 0.973±0.021 0.731±0.019*0.918±0.020*#193.966 0.000 7 d 1.192±0.071 0.891±0.082*1.134±0.079#26.718 0.000 F值705.554 294.012 483.505 P值0.000 0.000 0.000

表3不同時相點3組細胞內(nèi)總蛋白量比較結(jié)果（x-±s，n = 6，μg/mL）

3　討論

鎂元素是構(gòu)成骨組織中無機成分的主要元素，可以促進骨組織的再生和骨基質(zhì)的分泌，在人體代謝過程中擔負十分重要的作用［2］。鎂合金是一種可降解的金屬材料，前期研究表明鎂合金具有良好的生物學效應(yīng)［3］；但降解速度較快，因此導致單純無涂層鎂合金降解周圍環(huán)境的pH值改變，具有一定的細胞毒性［4］。為了降低鎂合金的降解速度，減輕其所帶來的細胞毒性，學者們開始嘗試表面改性技術(shù)，如鈣磷涂層、氟涂層等［5-7］，有效延緩了鎂合金的降解。

鈣磷涂層是骨科植入材料最常用的涂層，研究表明，該涂層不但可以延緩鎂合金的降解，而且還能提高其生物相容性能［8-9］。但作為潛在的骨科植入材料，鈣磷涂層鎂合金對成骨細胞和成骨環(huán)境究竟有何影響，是值得我們深入研究的問題。考慮到目前骨科常用的植入材料為醫(yī)用鈦合金，因此我們設(shè)置鈦合金組及未涂層鎂合金組為對照組，對比研究鈣磷涂層鎂合金對成骨細胞生物學性能的影響。

3.1成骨細胞黏附性能

黏附是植入材料與成骨細胞接觸的第一步，它將直接影響成骨細胞在其表面的增殖及分化。影響?zhàn)じ降囊蛩匕ú牧媳砻娴男蚊?、粗糙度、表面元素成分及金相結(jié)構(gòu)等［10-11］，這些影響因素不是孤立存在的，而是通過共同作用來影響細胞在材料表面的黏附。

3.1.1鎂合金的細胞黏附性能左林等［12］進行鎂合金（含Zn 2%、Mn 0.8%、Ca 1.0%）大鼠成骨細胞黏附試驗，認為鎂合金不利于大鼠成骨細胞黏附。另有學者證實鎂合金植入生物體后，可在其表面形成磷酸鹽類物質(zhì)，進而周圍會產(chǎn)生大量成骨細胞，表明鎂具有良好的骨誘導能力［13］；Yang等［14］將AZ31鎂合金植入動物體內(nèi)，亦發(fā)現(xiàn)材料降解后表面有Ca-P物質(zhì)沉積，合金表面的生物活性有所增強。本試驗結(jié)果亦表明，鎂合金植入體內(nèi)后具有良好的生物活性，證實鎂合金的降解雖然改變了局部的酸堿性能，但機體存在的動態(tài)血液循環(huán)和強大的酸堿緩沖系統(tǒng)，在一定程度上消除了酸堿性能對其黏附增殖能力的影響。

3.1.2鈣磷涂層鎂合金的細胞黏附性能Park等［15］的研究結(jié)果證實鈣磷涂層鎂合金能刺激成骨細胞MC3T3-E1細胞分化，進而促進骨折快速愈合；Xu等［16］應(yīng)用磷酸鈣涂層鎂合金進行體外成纖維細胞培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞黏附和增殖良好；Iskandar等［17］以大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞為試驗細胞，采用直接接觸試驗研究，結(jié)果同樣表明磷酸鈣涂層對細胞具有較好的黏附性能。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，成骨細胞能夠順利在合金材料表面黏附；隨著黏附時間的延長，MC3T3-El細胞在鈣磷涂層鎂合金表面黏附率逐漸增加，且其黏附率明顯優(yōu)于未涂層鎂合金和鈦合金。其原因可能是鈣磷涂層不僅增加了鎂合金表面的粗糙度和表面積，而且還改變了材料表面的元素組成（從單純的鎂鋁鋅金屬元素到鈣磷元素），同時弱化了酸堿性能對細胞黏附能力的影響。

3.2成骨細胞增殖活力及細胞功能

如前所述，在鎂合金表面進行鈣磷涂層，可有效延緩鎂合金的降解速度，減少鎂合金周圍環(huán)境的pH值改變，降低細胞毒性，提高生物相容性。郭磊等［18］通過體外直接接觸細胞毒性試驗和MTT比色法試驗，證實鈣磷涂層鎂合金材料具有良好的生物相容性，其堿性磷酸酶活性顯著高于Ca-P/ Ti-6Al-4材料組和AZ31B材料組，對成骨細胞的增殖和分化功能具有正性調(diào)節(jié)作用；Lu等［19］的研究結(jié)果也表明，純鎂表面制備β-磷酸三鈣涂層可明顯提高其細胞相容性；亦有學者應(yīng)用β-TCP涂層鎂合金進行體外實驗，通過免疫印跡法檢測到骨形成蛋白-2水平的高表達［20］。

本研究的細胞增殖活力檢測結(jié)果顯示，鈣磷涂層鎂合金具有良好的生物學性能，對成骨細胞無細胞毒性，其細胞增殖活力顯著優(yōu)于無涂層鎂合金；進一步的倒置顯微鏡觀察顯示，MC3T3-E1細胞貼壁良好，形態(tài)大多呈長梭形，表明鈣磷涂層鎂合金浸提液對MC3T3-E1細胞生長增殖無不良影響。在此基礎(chǔ)上，我們針對鈣磷涂層鎂合金是否影響成骨細胞功能進行了相關(guān)研究，細胞內(nèi)總蛋白結(jié)果表明鈣磷涂層鎂合金浸提液培養(yǎng)的細胞其胞內(nèi)總蛋白量顯著高于鎂合金組及鈦合金組，提示鈣磷涂層對于成骨細胞功能具有一定的促進作用。

綜上所述，鈣磷涂層鎂合金可增強小鼠成骨細胞的黏附能力和增殖能力，促進細胞內(nèi)總蛋白的表達，具有良好的生物相容性。但本研究為體外實驗，其植入體內(nèi)后對成骨細胞增殖分化及成骨分化基因的表達有無影響，還有待進一步的研究。

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短篇論著

The influence of magnesium alloy w ith calcium phosphate coating（CaP-AZ31B）on the biological properties of m ouse osteoblasts

ZHANG Tao*，XIA Hong，YIN Qingshui，LI Mei，ZHANG Yu，YANG Xiaoming，LAN Guobo. *Hospital of Orthopaedics，Orthopaedic Trauma Institute of PLA，the Key Lab of Trauma & Tissue Repair of Tropical Area of PLA，Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command，Guangzhou，Guangdong 510010，China

【Abstract】Objective To study the influence of magnesium alloy w ith calcium phosphate coating （CaP-ZA31B）on the biological properties of mouse osteoblast precursor cells（MC3T3-E1）. Methods In this study，they were divided into CaP-ZA31B group and two control groups［magnesium alloy（AZ31B）group andbook=37,ebook=37titanium alloy group］. Adhesion rates of MC3T3-E1 cells on the surface of the materials in 3 groups 2，6，and 24 hours after co-culture were observed；Cell morphology of MC3T3-E1 1，3，5，7 days after co-culture w ith leach liquor of materials in 3 groups were determ ined by using inverted m icroscope，and w ith CCK assay and BCA assay，MC3T3-E1 proliferation activities were detected，at the same time，total protein of MC3T3-E1 was also calculated in each group. Results As time of co-culture went by，adhesion rate，proliferation viability as well as total protein of MC3T3-E1 in 3 groups all increased significantly（P＜0.05）. At different time-points，cell adhesion rate of MC3T3-El cell in CaP-AZ31B group＞titanium alloy group＞AZ31B group（P＜0.05）. MC3T3-E1 cell in leach liquor of material in each group showed good attachment to the wall，which most of cells presented fusiform. Cell proliferation viability in CaP-AZ31B groups was better than that in AZ31B group at different time-point（P＜0.05）；As for total protein of MC3T3-E1，CaP-AZ31B group＞titanium alloy group＞AZ31B group（P＜0.05）. Conclusion Compared to AZ31B or titanium alloy，CaP-AZ31B has better biocompatibility w ith mouse osteoblast precursor cells because the material could enhance cell adhesion and proliferation viability，and improve the expression level of intracellular total protein more significantly.

【Key words】Magnesium；Alloys；Calcium phosphates；Coating；Biocompatible materials；M ice；Osteoblasts；Cells，cultured；Adhesion；Proliferation

中圖分類號：R329.24，R336

文獻標識碼：A

文章編號：1674-666X（2016）02-098-06

DOI：10.3969/j.issn.1674-666X.2016.02.006

基金項目：國家自然科學基金項目（30872642）；廣東省科技計劃項目（2014A020215025）；廣東省自然科學基金項目（2015A030313607）；軍隊“十二五”計劃課題重點項目（BWS11C065）；廣東省藥學會研究基金（2015ZT06）

通信作者：夏虹，E-mail：gzxiahong2@126.com

Corresponding author：XIA Hong，E-mail：gzxiahong2@126.com

收稿日期：（2016-01-12；修回日期：2016-02-28）（本文編輯：白朝暉）