李　蓉　張金鈺　葉長文　吳銀華　陳　麗（. 浙江省慶元縣食用菌科學(xué)技術(shù)研究中心，浙江省麗水食用菌技術(shù)創(chuàng)新服務(wù)平臺，浙江省食用菌工程技術(shù)研究中心，浙江 慶元 33800；. 浙江省慶元縣委統(tǒng)戰(zhàn)部，浙江 麗水 33800）

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灰樹花液體搖瓶發(fā)酵的關(guān)鍵控制技術(shù)

李蓉1張金鈺2葉長文1吳銀華1陳麗1
（1. 浙江省慶元縣食用菌科學(xué)技術(shù)研究中心，浙江省麗水食用菌技術(shù)創(chuàng)新服務(wù)平臺，浙江省食用菌工程技術(shù)研究中心，浙江 慶元 323800；2. 浙江省慶元縣委統(tǒng)戰(zhàn)部，浙江 麗水 323800）

關(guān)鍵字灰樹花；液體發(fā)酵；控制技術(shù)

灰樹花具有增強機體免疫力，抑制腫瘤、病毒，降低血壓等功效。其子實體可通過固體栽培獲得，但生長周期長，產(chǎn)量有限，無法滿足灰樹花深加工產(chǎn)品的加工需求。而液體深層發(fā)酵因不受子實體栽培季節(jié)的影響，不消耗林木資源，且培養(yǎng)周期短，成本低，產(chǎn)量高，有效成分的含量易于控制，已受到廣泛關(guān)注。

從灰樹花深層發(fā)酵液和菌絲體中提取的多糖，與子實體中提取的多糖具有同樣的抑制腫瘤、提高機體免疫功能的作用。游明樂等研究表明，多種食用真菌液體發(fā)酵產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)、氨基酸、核苷類、多糖類及甘露醇等含量遠高于天然或人工栽培的大型真菌子實體或菌核[1]。研究液體發(fā)酵法制備灰樹花液體菌絲體對快速獲取有效成分[2]，加快灰樹花制種速度，提高菌種產(chǎn)量，對實現(xiàn)其工廠化生產(chǎn)，加快其在保健、醫(yī)藥等方面開發(fā)利用，促進農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥工業(yè)的發(fā)展，具有一定的現(xiàn)實意義。

本文對灰樹花搖瓶發(fā)酵中的兩個重要過程和關(guān)鍵控制因素進行探討，旨在為優(yōu)化其液體發(fā)酵提供依據(jù)。

1　液體發(fā)酵培養(yǎng)基制備過程的關(guān)鍵控制技術(shù)

方維明等采用搖瓶發(fā)酵法對灰樹花液態(tài)發(fā)酵的碳氮營養(yǎng)需求，及發(fā)酵條件對菌絲體的生物量和多糖產(chǎn)量的影響規(guī)律進行研究，發(fā)現(xiàn)灰樹花菌絲生長碳源以葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉最佳；酵母粉為發(fā)酵中的最佳氮源，其次為酵母膏、蛋白胨[3]。顧順明研究表明，無論是生物量還是多糖含量，玉米粉作為碳源時灰樹花的深層發(fā)酵效果最佳；豆餅粉作為氮源時菌絲體生物量最高，酵母粉次之；麩皮作為氮源時菌絲體粗多糖含量最高，蛋白胨、豆餅粉次之[4]。孫克研究了影響灰樹花菌絲體生長的各營養(yǎng)因素主次順序為蛋白胨、玉米漿、葡萄糖、磷酸二氫鉀，綜合考慮灰樹花所需營養(yǎng)的最佳組合為葡萄糖3%、蛋白胨0.5%、磷酸二氫鉀0.4%、玉米漿1.5%[5]。卜慶梅等經(jīng)過液體菌種制備試驗、栽培袋制備試驗、出菇試驗，確定灰樹花液體發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基為麥麩5%，玉米粉1%，葡萄糖2%，磷酸二氫鉀0.2%，硫酸鎂0.1%，維生素B10.002%[6]。

綜上所述，灰樹花搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的制備中碳源、氮源、礦質(zhì)元素的選擇及含量至關(guān)重要。碳作為構(gòu)成細胞物質(zhì)的主要元素、菌絲體生長所需的能量來源，建議選擇葡萄糖、玉米粉。氮作為細胞質(zhì)和細胞核中蛋白質(zhì)和核酸的主要元素，建議選擇蛋白胨或酵母浸出膏。礦質(zhì)磷元素一般在菌絲體生長、繁殖和代謝活動中起著重要的作用。

玉米粉、麥麩有利于灰樹花菌絲球的形成，一般在培養(yǎng)的第3天即有菌絲球形成，第5天菌絲球生物量達到最大值。但玉米粉、麥麩會使發(fā)酵后發(fā)酵液粘性增大，菌絲球無法過濾，對測定菌絲生物量、多糖和蛋白含量有較大影響，作者采用不同含量的玉米粒浸泡進行液體發(fā)酵。圖1為玉米粉含量對―慶灰151‖菌絲生物量的影響。

圖1　玉米粒含量對―慶灰151‖菌絲生物量的影響

2　發(fā)酵過程的關(guān)鍵控制技術(shù)

搖瓶發(fā)酵過程控制包括接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、搖瓶轉(zhuǎn)速、搖瓶裝液量、雜菌防控等因素。

2.1接種量

孫金旭等對灰樹花真菌發(fā)酵條件所做的優(yōu)化研究表明，小接種量不利于菌體的生長及多糖的產(chǎn)生，隨著接種量的增大，培養(yǎng)10天后的菌體及多糖產(chǎn)量逐漸增加；接種量10%時，菌體及多糖產(chǎn)量達到最大，之后，隨接種量增大而降低[7]。楊箐等研究表明，灰樹花最佳種子培養(yǎng)基為馬鈴薯-葡萄糖-蛋白胨培養(yǎng)基，在接種量為10%的條件下進行深層發(fā)酵，灰樹花菌絲體干重和胞外多糖的含量分別為5.325 g/L和0.53 g/L[8]。顧順明等以不同接種量對種子培養(yǎng)基菌絲生物量的影響進行研究，結(jié)果表明，100 mL種子培養(yǎng)基中，菌絲生物量隨著接種母種圓餅（6 mm直徑）數(shù)量增加呈增加趨勢，9個菌餅時達最高。表明灰樹花發(fā)酵時接種量愈大，菌絲體得率愈高。但從具體可操作性考慮，一般取5%～10%。[4]

2.2發(fā)酵時間

灰樹花發(fā)酵過程，前期是菌絲體生長，之后開始產(chǎn)生多糖，隨著培養(yǎng)時間延長，多糖產(chǎn)量下降。孫克等研究表明灰樹花發(fā)酵是一個pH不斷下降的過程，在一級種子接入搖瓶后的2天內(nèi)，pH變化持平，對應(yīng)菌體量的變化也較小。此后3天pH開始穩(wěn)步下降，菌體量也迅速增加。發(fā)酵4天后，菌體香氣濃郁；發(fā)酵5天時進入停滯期，這時發(fā)酵液的粘度較大，溶氧量下降很快，菌體生長基本停止，菌體干重達1.42 g/100mL[5]。雷德柱和于淑娟研究灰樹花菌絲球時發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵早期菌絲充滿活力，富有彈性，不容易被剪切、刮落，即使被刮落也能迅速恢復(fù)生長，因此核占菌絲球的體積比較?。话l(fā)酵中期，菌絲生長速度下降，并開始分化，菌絲容易被刮落，菌絲彈性和長度下降，核占菌絲球的體積比上升；發(fā)酵后期，菌絲高度液泡化，彈性迅速下降，菌絲球變得非常光滑，進而從動力學(xué)方面初步解釋菌絲球在不同時期變化的形態(tài)[9]。

2.3發(fā)酵溫度

不同的灰樹花品種菌絲生長的最適溫度不同，溫度梯度試驗研究表明，盡管在最適生長溫度下菌絲生長最快，但是菌絲相對較細，菌落稀疏；而低于菌絲生長最適溫度以下2～3 ℃時，菌絲長速雖稍慢，但菌絲粗壯，菌落致密。目前已認定的3個灰樹花品種，菌絲發(fā)酵最適溫度：慶灰151、慶灰152為25～31 ℃，小黑汀為22～31 ℃。

2.4搖瓶轉(zhuǎn)速

搖床轉(zhuǎn)速是發(fā)酵過程的重要參數(shù)，直接影響發(fā)酵基質(zhì)的傳遞速度和溶氧量。崔鳳杰等研究了攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量對灰樹花深層發(fā)酵培養(yǎng)的影響，表明低攪拌轉(zhuǎn)速（60 r/min和80 r/min）下菌球直徑較大，緊密；隨著轉(zhuǎn)速提高，菌球直徑下降并趨于松散，攪拌速度在一定范圍（60～100 r/min）內(nèi)與發(fā)酵液最終粘度呈正相關(guān)[10]。選取不同搖瓶轉(zhuǎn)速（50、100、150、200、250、300 r/min）進行發(fā)酵研究，接種后置于25 ℃、裝液量100 mL（500 mL三角瓶）條件下振蕩培養(yǎng)10天，測定灰樹花菌體及多糖的產(chǎn)量在轉(zhuǎn)速150 r/min下為高。

2.5搖瓶裝液量

搖瓶裝液量是影響發(fā)酵過程溶氧量的一個重要因素。孫金旭和顧順明的研究同時表明500 mL三角瓶中裝液100 mL為搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)灰樹花的適宜裝液量。

2.6雜菌控制

灰樹花發(fā)酵過程防控雜菌污染也是關(guān)鍵。要做到無菌接種。同時，在搖菌過程中在三角瓶塞上覆蓋一層軟質(zhì)紙后再用橡皮筋固定，可以大大減少雜菌污染幾率。

3　結(jié)　論

灰樹花液體發(fā)酵技術(shù)的應(yīng)用越來越受到人們的重視，科學(xué)配制發(fā)酵培養(yǎng)基，合理控制發(fā)酵過程中的接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、搖瓶轉(zhuǎn)速、搖瓶裝液量和防止雜菌污染等，是確?；覙浠ㄒ后w發(fā)酵成功的技術(shù)關(guān)鍵。

參考文獻

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“2016最具投資價值食用菌企業(yè)top10”頒獎儀式在四川金堂舉行

2016年3月11日，在四川金堂恒大酒店舉行的第三屆四川（金堂）食用菌博覽會期間，―2016最具投資價值的食用菌企業(yè)top10‖頒獎儀式在中國食品土畜進出口商會食用菌分會二屆三次會員擴大會議上舉行，來自國內(nèi)外100多人參加見證了此次活動。

中國綠寶集團有限公司、北京金珠滿江農(nóng)業(yè)有限公司、天水眾興菌業(yè)科技股份有限公司、福建萬辰生物科技股份有限公司、江蘇華綠生物科技股份有限公司、河南景翔生物科技股份有限公司、南通三盛鑫生物科技股份有限公司、湖北裕國菇業(yè)股份有限公司、安徽中祝農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司、廣東星河生物科技股份有限公司,共10家企業(yè)榮膺―2016最具投資價值的食用菌企業(yè)top10‖。九州證券有限公司執(zhí)行總經(jīng)理萬偉先生，中國食品土畜進出口商會食用菌分會秘書長、易菇網(wǎng)顧問劉自強先生，易菇網(wǎng)總裁張升明先生為獲獎單位頒發(fā)了獎牌和證書。

為加強食用菌企業(yè)對資本市場的了解，熟悉資本市場的運作，提升公眾對食用菌上市公司的關(guān)注，易菇網(wǎng)特發(fā)起舉辦此次活動，選取近幾年公開報道在主板市場、創(chuàng)業(yè)板市場、新三板上市食用菌企業(yè)作為評選對象，自2016年1月29日至2月18日期間進行公眾投票，歷時21天，此活動引起業(yè)內(nèi)人士的廣泛關(guān)注，票選信息在網(wǎng)絡(luò)和手機媒體中被廣泛傳播，參與投票人數(shù)達12 509人。

（摘編自2016.3.12《易菇網(wǎng)》http://www.emushroom.net/news/201603/12/25470.html）

中圖分類號：S646

文獻標識碼：B

文章編號：2095-0934（2016）02-115-03