李慧+郭志麗+顧軍

摘 要 目的：探討骨化三醇和中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑serpin B1對人角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞增殖的影響。方法：骨化三醇組在常規(guī)培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞中加入骨化三醇，對照組加入等量的無血清培養(yǎng)基，避光培養(yǎng)48 h后采用反復(fù)凍融法提取細(xì)胞全蛋白，采用固相pH梯度雙向凝膠電泳法進行分離，并用ImageMaster 2D Platinum 5.0軟件分析蛋白表達的差異，同時采用基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜儀進行蛋白鑒定。serpin B1的表達上調(diào)通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法和Western-blotting法予以驗證。通過RNA干擾實驗、噻唑藍(lán)實驗和流式細(xì)胞法分析serpin B1對HaCaT細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果：骨化三醇組的serpin B1表達上調(diào)。骨化三醇在1×10-9 ～ 1×10-6 mol/L濃度時能抑制HaCaT細(xì)胞增殖。干擾serpin B1可促進HaCaT細(xì)胞增殖，且使骨化三醇的抑制作用消失。結(jié)論：骨化三醇可上調(diào)HaCaT細(xì)胞中的serpin B1表達，這可能在骨化三醇抑制HaCaT細(xì)胞增殖的過程中起著重要作用。

關(guān)鍵詞 骨化三醇 角質(zhì)形成細(xì)胞 中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑 serpin B1 銀屑病

中圖分類號：R977.24； R758.63 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-1533（2016）09-0028-07

Calcitriol inhibits keratinocyte proliferation by upregulating the expression of leukocyte elastase inhibitor serpin B1

LI Hui1，2*， GUO Zhili2， GU Jun2**

（1. Department of Dermatology， General Hospital of Urumuqi Military Region， Urumuqi 830000， China；

2. Department of Dermatology， Changhai Hospital， Second Military Medical University， Shanghai 200433， China）

ABSTRACT Objective： To evaluate the role of calcitriol and serpin B1 in human keratinocyte cell line HaCaT proliferation. Methods： Calcitriol was added at 1×10-8 mol/L into the culture of HaCaT cell in a calcitriol group while only serum-free Dulbeccos modified Eagles medium instead in a control group. Whole proteins were extracted by freeze-thawing method after cells were incubated in the dark for 48 h and were separated by two-dimensional differential gel electrophoresis. The differences for protein expression were analyzed by ImageMaster 2D Platinum 5.0 and the identification of proteins was performed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry. The overexpression of serpin B1 was confirmed by reverse transcription polymerase chain reaction and Western-blotting assay. The effect of serpin B1 on HaCaT proliferation was analyzed by RNA interference experiments， methyl thiazole tetrazolium assay and flow cytometry. Results： The expression of serpin B1 was upregulated in the calcitriol group. Calcitriol could inhibit HaCaT proliferation at 1×10-9 ～ 1×10-6 mol/L. HaCaT proliferation could be promoted and its inhibitory effect could be offset by interfering serpin B1. Conclusion： The expression of serpin B1 can be upregulated when calcitriol is added into the culture of HaCaT cells， which may play an important role in the inhibition of calcitriol to the proliferation of HaCaT cells.

KEY WORDS calcitriol； keratinocytes； leukocyte elastase inhibitor； serpin B1； psoriasis

胞增殖和表皮內(nèi)的中性粒細(xì)胞浸潤[1-2]。骨化三醇及其類似物已被證實可有效治療輕、中度尋常型銀屑病[3-4]，其機制被認(rèn)為是骨化三醇能抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖并促進角質(zhì)形成細(xì)胞的分化[5]。

銀屑病患者的活動性皮損及外周血中的中性粒細(xì)胞數(shù)常增多，且隨之產(chǎn)生的氧化壓力與銀屑病的嚴(yán)重程度相關(guān)[2，6]。中性粒細(xì)胞顆粒蛋白酶雖能直接殺傷吞噬的病原體，但在慢性炎癥性疾病中，其之過度釋放也可導(dǎo)致組織損傷以及凋亡細(xì)胞的清除障礙[7-9]。蛋白激酶的調(diào)節(jié)在表皮的屏障功能及炎癥性皮膚病的發(fā)病過程中起著重要作用[10]。作為蛋白激酶家族成員，中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase， NE）是活化的中性粒細(xì)胞釋放的主要物質(zhì)，在銀屑病引起的組織破壞中起著重要作用。NE在銀屑病患者的組織和血清中表達過度并在銀屑病的發(fā)病中起著重要作用[11]。NE的水平與銀屑病的活動性相關(guān)，且被認(rèn)為是診斷銀屑病和隨訪其嚴(yán)重程度的一種很好的監(jiān)測指標(biāo)[12]。此外，既往研究顯示，NE在銀屑病皮損中高表達，且可刺激角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖[13]。NE也可促進人角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞的增殖及銀屑病器官培養(yǎng)模型的transwell遷移[14]。NE和內(nèi)源性蛋白酶抑制劑間的失衡已被公認(rèn)為是銀屑病的病因之一。一些NE的抑制劑、包括源自皮膚的抗白細(xì)胞蛋白酶[15]和α1-抗胰蛋白酶[16]都已被證實與銀屑病相關(guān)。蛋白水解失衡與銀屑病的進展相關(guān)[2]。

絲氨酸蛋白酶抑制劑是一類具有獨特的三級結(jié)構(gòu)并通過自殺式底物抑制機制中和靶蛋白酶的蛋白家族[17]，其成員serpin B1又被稱為多形核中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑和胞漿絲氨酸蛋白酶抑制劑[18]。serpin B1是中性粒細(xì)胞顆粒內(nèi)的一種以自殺式底物抑制機制作用的快反應(yīng)型NE、蛋白激酶3和組織蛋白酶G的抑制劑[10]。絲氨酸蛋白酶抑制劑已被認(rèn)為與銀屑病和其他常見的炎癥性皮膚病相關(guān)[13，19-20]，但serpin B1與銀屑病的相關(guān)性尚未見有報告。

本研究的目的是證實骨化三醇能上調(diào)HaCaT細(xì)胞中的serpin B1表達且其有抑制HaCaT細(xì)胞增殖的作用。

1 實驗方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

實驗組：將永生化的HaCaT細(xì)胞（上海生化和細(xì)胞生物研究所產(chǎn)品）用添加了10%胎牛血清（法國Biowest公司產(chǎn)品）的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基（Dulbeccos modified Eagles medium， DMEM）（法國Biowest公司產(chǎn)品）于5% CO2、37 ℃下常規(guī)培養(yǎng)。待80%的細(xì)胞融合后，再加入1×10-8 mol/L的骨化三醇（美國Sigma公司產(chǎn)品）。

陰性對照組：將HaCaT細(xì)胞于未添加胎牛血清的DMEM中培養(yǎng)。

1.2 雙向凝膠電泳（two-dimensional electrophoresis， 2DE）法和質(zhì)譜分析

采用反復(fù)凍融法提取骨化三醇組和陰性對照組中的HaCaT細(xì)胞全蛋白，用Bradford法測定蛋白濃度，然后通過2DE法分離蛋白?？偵蠘恿繛?00 μg，第一向固相等電聚焦電泳采用17 cm長的pH為3 ～ 10的非線性固相pH梯度凝集膠條、按程序化的電壓梯度進行電泳。主動水化50 V、14 h，溫度為17 ℃，依次經(jīng)250 V、30 min，500 V、1 h，1 000 V、1 h，升壓至10 000 V、5 h，聚焦10 000 V達總量60 000 Vh。聚焦結(jié)束后，膠條先后經(jīng)2%二硫蘇糖醇和2.5%碘乙酰胺平衡，然后進行第二向電泳，采用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE）法，10 mA、50 V、50 min，50 mA、250 V、至溴酚藍(lán)指示劑到底部邊緣。電泳結(jié)束后，采用快速銀染法染色蛋白點位。

銀染后的凝膠用UMAX PowerLook 2100XL掃描儀進行圖像掃描光密度分析。使用ImageMaster 2D Platinum 5.0軟件對2DE圖譜進行匹配分析，篩選出存在差異的蛋白質(zhì)點。切取符合質(zhì)譜分析法濃度要求的10個有差異的蛋白質(zhì)點并進行膠內(nèi)酶解，然后通過基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜儀對蛋白質(zhì)點進行氨基酸序列分析，依據(jù)酶解肽片斷的質(zhì)量，通過Mascot軟件查詢SWISS-PROT蛋白數(shù)據(jù)庫，經(jīng)軟件自動運算得出Mascot得分，進而確定被測蛋白的可能屬性及名稱。數(shù)據(jù)分析及蛋白鑒定由中科院上海生物研究所蛋白質(zhì)組學(xué)研究中心完成。

1.3 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction， RT-PCR）法

用Trizol試劑（美國Invitrogen公司產(chǎn)品）抽提預(yù)處理后的HaCaT細(xì)胞的總RNA，然后按照操作試劑盒（立陶宛MBI Fermentas公司產(chǎn)品）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。serpin B1引物的序列如下：前向引物，5′-AGGAACAGTTGACTTTGGAA-3′；反向引物，5′-AAAGAGATCCTGCACACCTA-3′。RT-PCR法采用標(biāo)準(zhǔn)的SYBR Green PCR試劑盒（日本TOYOBO公司產(chǎn)品）進行，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的特異性擴增在ABI 7300儀器（德國Applied Biosystem公司產(chǎn)品）中進行。serpin B1、磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase， GAPDH）的相對量采用2-ΔΔCt法計算。

1.4 Western-blotting法

提取的HaCaT細(xì)胞全蛋白經(jīng)SDS-PAGE法分離后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（德國Millipore公司產(chǎn)品）上，用serpin B1抗體（美國Santa Cruz公司產(chǎn)品）和GAPDH抗體（美國Bioworld公司產(chǎn)品）孵育，之后孵育羊抗兔二抗，最后用化學(xué)發(fā)光法（美國Pierce公司產(chǎn)品）顯影。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

設(shè)計并合成3對serpin B1的siRNA（委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司完成），序列分別為：serpin B1-homo-491 sense為5′-CGGGCAUGGUUGAUAACAUTT-3′，antisense為5′- A U G U U A U C A A C C A U G C C C G T T- 3′；s e r p i n B 1 - h o m o - 9 3 s e n s e為5′-GGCGUUGAGUGAGAACAAUTT-3′，antisense為5′- A U U G U U C U C A C U C A A C G C C T T- 3′；s e r p i n B 1 - h o m o - 8 1 3 s e n s e為5′-GUGGACUAAACCUGAGAAUTT-3′，antisense為5′-AUUCUCAGGUUUAGUCCACTT-3′。采用Lipofectamin 2000（美國Gibco公司產(chǎn)品）轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞，陰性對照siRNA作為空白對照。以RTPCR法驗證轉(zhuǎn)染及干擾效率。

1.6 噻唑藍(lán)實驗分析細(xì)胞增殖

鋪96孔板，使HaCaT細(xì)胞在24 h內(nèi)融合達70%左右，然后分為3組，分別加入骨化三醇、NE和無胎牛血清的DMEM，培養(yǎng)48 h后，再每孔加5 mg/ml噻唑藍(lán)20μl，37 ℃、5% CO2下孵育4 h。吸棄每孔內(nèi)培養(yǎng)基上清液，再每孔中加入二甲基亞砜150 μl，振蕩10 min。用酶聯(lián)免疫檢測儀測定550 nm下的各孔光吸收值。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期

用6孔板培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞，然后分別用陰性對照siRNA、空白對照、serpin B1 siRNA、陰性對照聯(lián)合骨化三醇（1×10-8 mol/L）和空白對照聯(lián)合骨化三醇（1×10-8 mol/L）處理細(xì)胞。48 h后收集細(xì)胞，加入70%乙醇，30 min后再用冰磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution， PBS）清洗。在冰上加入含RNase（1∶100）的PBS重懸細(xì)胞，然后用碘化丙啶染色，用流式細(xì)胞儀（美國BD Biosciences公司產(chǎn)品）進行分析。

1.8 統(tǒng)計分析方法

本研究計量資料以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表述。兩組樣本間的均數(shù)比較用兩樣本均數(shù)的t檢驗。P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)顯著差異。統(tǒng)計分析采用SPSS 18.0軟件。

2 結(jié)果

2.1 骨化三醇上調(diào)serpin B1表達

建立了HaCaT細(xì)胞全蛋白的2DE圖譜，發(fā)現(xiàn)重復(fù)性好，并共檢測出3 000余個蛋白位點，見圖1A。與對照組相比，骨化三醇組共有22種蛋白出現(xiàn)表達差異，其中一些蛋白的位點已在圖1A中用圈和數(shù)字標(biāo)示。22種蛋白中有5種表達下調(diào)，17種表達上調(diào)。共鑒定出4種有表達差異的蛋白，分別為serpin B1、fascin同系物-1、干擾素調(diào)控因子-4和gi 158256364。在圖1A中用箭頭標(biāo)示的即是serpin B1，其在骨化三醇組表達上調(diào)。圖1B、1C和1D展示了serpin B1的鑒定過程。

如圖2A所示，RT-PCR法結(jié)果顯示，與對照組相比，骨化三醇組在4、8、12、24和48 h時間點，serpin B1的表達分別上調(diào)了1.99、2.41、3.28、3.46和3.31倍（均P<0.05）。如圖 2B所示，Western-blotting法結(jié)果顯示，與對照組相比，骨化三醇組在24和48 h時間點，serpin B1的表達均上調(diào)（均P<0.05），且24和48 h時間點的表達有顯著差異（P<0.05）。

2.2 serpin B1抑制HaCaT細(xì)胞增殖

如圖3所示，骨化三醇在1×10-9 ～ 1×10-6 mol/L濃度時能抑制HaCaT細(xì)胞的增殖。為明確serpin B1對HaCaT細(xì)胞增殖的影響，對HaCaT細(xì)胞轉(zhuǎn)染serpin B1 siRNA并設(shè)陰性對照。用RT-PCR法驗證serpin B1的干擾效率，發(fā)現(xiàn)如圖4A所示，serpin B1-homo-93可顯著降低serpin B1的表達，抑制率達83%；如圖4B所示，serpin B1 siRNA可較陰性對照和空白對照顯著促進HaCaT細(xì)胞的增殖（均P<0.05），且serpin B1 siRNA聯(lián)合骨化三醇組與陰性對照聯(lián)合骨化三醇組間比較的結(jié)果亦相同（P<0.05）。這些結(jié)果提示，serpin B1可抑制HaCaT細(xì)胞增殖。

此外，如圖4B所示，與陰性對照組相比，陰性對照聯(lián)合骨化三醇組的HaCaT細(xì)胞增殖受到抑制，提示骨化三醇可抑制HaCaT細(xì)胞增殖。而當(dāng)干擾serpin B1后，骨化三醇對HaCaT細(xì)胞增殖的抑制作用消失，提示serpin B1在骨化三醇抑制HaCaT細(xì)胞增殖過程中起著至關(guān)重要的作用。

如圖5A、5C和5F所示，對細(xì)胞周期的研究結(jié)果也證實了serpin B1 siRNA的細(xì)胞增殖促進作用：serpin B1 siRNA組和陰性對照組的G1期細(xì)胞占比分別為（40.36±3.07）%和（47.04±2.15）%、S期細(xì)胞占比分別為（50.41±4.33）%和（35.49±4.30）%（均P<0.05），提示serpin B1 siRNA可促進細(xì)胞周期由G1期向S期轉(zhuǎn)化。如圖5A、5E和5F所示，骨化三醇的細(xì)胞增殖抑制作用也已為細(xì)胞周期研究結(jié)果所證實：陰性對照聯(lián)合骨化三醇組的G1和S期細(xì)胞占比分別為（61.32±5.59）%和（18.85±2.90）%，提示骨化三醇可使細(xì)胞周期阻滯在G1期。此外，分析處于各細(xì)胞周期的細(xì)胞比例，如圖5A、5B和5F所示，陰性對照組和空白對照組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義；如圖5C、5D和5F所示，serpin B1 siRNA組和serpin B1 siRNA聯(lián)合骨化三醇組間的差異也無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

骨化三醇及其類似物已被證實可有效治療輕、中度尋常型銀屑病，其作用機制也已被證實是骨化三醇可抑制角質(zhì)形成細(xì)胞增殖并促進其分化[3-4]。然而，骨化三醇促使角質(zhì)形成細(xì)胞分化正?；姆肿訖C制尚未被完全闡明。一項研究采用基因表達組學(xué)方法研究了1， 25-二羥維生素D3對角質(zhì)形成細(xì)胞基因表達的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞serpin B1的表達[21]。同時，該研究還展示了一個包括維生素D受體配體在內(nèi)的維生素D相關(guān)的細(xì)胞分化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本研究通過蛋白組學(xué)方法研究發(fā)現(xiàn)，骨化三醇可改變包括serpin B1在內(nèi)的HaCaT細(xì)胞的多種蛋白表達。尤其是serpin B1，其表達的改變已為進一步的實驗所證實，且其抑制HaCaT細(xì)胞增殖的作用也得到了進一步的研究。本研究揭示，骨化三醇可改變HaCaT細(xì)胞中的一些蛋白表達，這為銀屑病治療提供了新的作用靶點。本研究還顯示，serpin B1在角質(zhì)形成細(xì)胞中有表達，且其表達會在骨化三醇存在時上調(diào)。

serpin B1在中性粒細(xì)胞胞漿中高表達[22]。近來發(fā)現(xiàn)，除中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞外，serpin B1在支氣管和腺上皮細(xì)胞中也有表達[23]。serpin B1調(diào)控初始免疫，可在慢性炎癥中通過中和蛋白激酶而減少組織損傷。在小鼠細(xì)菌感染模型中，serpin B1也與中性粒細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)定相關(guān)[24-26]。有研究顯示，在小鼠慢性銅綠假單胞菌感染模型中，serpin B1可降低細(xì)菌數(shù)和減少炎性細(xì)胞的浸潤[27]。對多種感染模型的研究還顯示，serpin B1與病原菌清除及維持免疫功能所必需的正常中性粒細(xì)胞的儲備有關(guān)[28-29]。因此，serpin B1被認(rèn)為是最有效的NE抑制劑之一[29-31]。通過抑制NE，serpin B1可能在銀屑病、慢性阻塞性肺疾病、纖維囊性病和潰瘍性結(jié)腸炎等慢性炎癥性疾病以及感染性疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

本研究也發(fā)現(xiàn)，serpin B1和骨化三醇均可抑制HaCaT細(xì)胞的增殖。serpin B1 siRNA可促進細(xì)胞周期由G1期向S期轉(zhuǎn)化，而骨化三醇則抑制由G1期向S期轉(zhuǎn)化。如果骨化三醇誘導(dǎo)的serpin B1對其產(chǎn)生細(xì)胞增殖抑制作用至關(guān)重要，那么干擾serpin B1將使骨化三醇對細(xì)胞增殖的影響消失。為驗證該假設(shè)，對陰性對照聯(lián)合骨化三醇組和serpin B1 siRNA聯(lián)合骨化三醇組進行了比較研究，發(fā)現(xiàn)在serpin B1被干擾后，骨化三醇也不能產(chǎn)生細(xì)胞增殖抑制作用了。即：骨化三醇是通過上調(diào)serpin B1的表達而產(chǎn)生抑制HaCaT細(xì)胞增殖作用的。serpin B1可能是骨化三醇治療銀屑病的有效作用靶點。

本研究仍存在不足，尚需進一步研究serpin B1對HaCaT細(xì)胞分化和凋亡的影響。此外，需進行serpin B1與銀屑病相關(guān)性的體內(nèi)研究。

總之，本研究顯示，serpin B1在角質(zhì)形成細(xì)胞中有表達，且其表達會在骨化三醇存在時上調(diào)。serpin B1可抑制角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，在骨化三醇治療尋常型銀屑病中起著重要作用。

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