李秀婷，劉炳新，胡谷平，汪玉梅，張翠仙

( 1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006;2. 中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，廣東 廣州 510275)

南海珊瑚共附生真菌NG-15-3中蒽醌和含氮類次生代謝產(chǎn)物研究*

李秀婷1，劉炳新1，胡谷平2，汪玉梅1，張翠仙1

( 1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006;2. 中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，廣東 廣州 510275)

為了研究南海珊瑚共附生真菌NG-15-3次生代謝產(chǎn)物，采用硅膠柱層析和HPLC等分離手段從乙酸乙酯提取部位分離得到單體化合物，結(jié)合現(xiàn)代波譜技術(shù)、物理常數(shù)對(duì)照對(duì)單體化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。從其分離得到4個(gè)蒽醌類：emodin (2)、1-O-methylemodin(3)、physcion(4)、carviolin(5)和6個(gè)含氮類次生代謝產(chǎn)物：preechinulin(1)、cyclo-(Phe-Gly) (6)、cyclo-(Gly-Pro)(7)、3H-imidazole-4-carboxylicacid(8)、2-methyl-3H-imidazole-4-carboxylicacid(9)和1H-pyrrole-2-carboxylicacid(10)。所有化合物均為首次從該真菌中分離得到，且化合物1為單去氫2,5-二酮哌嗪類化合物的前體物質(zhì)，具有豐富的生理活性。

珊瑚共附生真菌；NG-15-3；蒽醌；含氮類化合物；結(jié)構(gòu)鑒定

由于海洋具有高壓、高鹽、低光照等特殊的物理化學(xué)環(huán)境，使得生存其中的微生物有異于陸生微生物的獨(dú)特生物合成代謝途徑[1]，并產(chǎn)生結(jié)構(gòu)豐富、活性多樣的次生代謝產(chǎn)物，是創(chuàng)新藥物及其先導(dǎo)結(jié)構(gòu)的重要來(lái)源[2-3]。前期實(shí)驗(yàn)研究表明，OSMAC策略對(duì)南海珊瑚共附生真菌NG-15-3次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生明顯影響，并采用TLC及HPLC方法對(duì)其建立指紋圖譜，篩選出最佳培養(yǎng)條件。本文對(duì)真菌NG-15-3在最佳GPY培養(yǎng)基(發(fā)酵液和菌絲體)乙酸乙酯提取部位進(jìn)行次生代謝產(chǎn)物研究，通過(guò)柱層析(硅膠、ODS和Sephadex LH-20等)及HPLC分離純化，共分離得到10個(gè)單體化合物，經(jīng)過(guò)NMR和MS及物理常數(shù)對(duì)照確定結(jié)構(gòu)為preechinulin (1)、emodin (2)、1-O-methylemodin(3)、physcion(4)、carviolin(5)、cyclo- (Phe-Gly) (6)、cyclo-(Gly-Pro)(7)、3H-imidazole-4-carboxylicacid(8)、2-methyl-3H-imidazole-4-carboxylicacid(9) 和1H-pyrrole-2-carboxylicacid(10)。所有化合物均為首次從該真菌中分離得到。

圖1 南海珊瑚共附生真菌NG-15-3中蒽醌(2，3，4，5)和含氮類化合物(1,6，7，8，9，10)Fig.1 Compounds 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10 from the coral-derived symbiotic fungi NG-15-3 of South China Sea

文獻(xiàn)調(diào)研表明：葉立德類化合物大多來(lái)自真菌，主要有抗氧化、抗菌和免疫調(diào)節(jié)活性[4]。朱偉明研究小組[5]研究了該類化合物的抗腫瘤與抗氧化活性，結(jié)果表明C-10/C-11雙鍵的存在可以大大加強(qiáng)此類化合物的抗氧化活性?；衔?為單去氫2,5-二酮哌嗪類化合物的前體物質(zhì)，這類化合物有多種官能團(tuán)，是進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾或改造的較好的前體物質(zhì)，可以通過(guò)化學(xué)方法或生物轉(zhuǎn)化的方法提高該類化合物的活性，得到能夠成藥高活性的先導(dǎo)化合物。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器：(單人)超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)；LX-B75L型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器(合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司)；HYG-A全溫?fù)u瓶柜(常州市三盛儀器制造有限公司)；RE-2010恒溫水油浴鍋(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；ER-120A電子天平(日本A&D公司)；VANCEAV400超導(dǎo)核磁共振儀(瑞士Bruker公司)；VGZABHS質(zhì)譜儀(美國(guó)Finnigan公司)；LCQDE-CAXP高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Finnigan公司)；QuikSep高效液相色譜儀(北京慧德易科技有限責(zé)任公司)。

試劑：蛋白胨、酵母膏(生物試劑，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；葡萄糖(AR，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；海鹽(微生物養(yǎng)殖用)；馬鈴薯(市場(chǎng)購(gòu)買)；石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇、甲醇(AR，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；SephadexLH-20葡聚糖凝膠(GE醫(yī)療集團(tuán))，GF254薄層層析硅膠板(青島海洋化工廠)，柱層析硅膠(200～300目，青島海洋化工廠)。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g/L、葡萄糖w=2.0%、土豆汁用陳海水作溶劑配制，pH自然。

GPY培養(yǎng)基(w)：葡萄糖1.0%、海鹽0.25%、酵母膏0.2%、蛋白胨0.1%，pH=7.0～7.5。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用菌株NG-15-3于2012年采自中國(guó)南海東鑼?shí)u附近海域珊瑚的共附生真菌，種屬未鑒定，菌種(No.NG-15-3)保存在廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院海洋天然藥物實(shí)驗(yàn)室。

1.3 共附生真菌NG15-3活化與發(fā)酵

1.3.1 活化 用接種環(huán)從NG-15-3菌種保存管中取適量的種子，接種到裝有40 mL PDA培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，在28 ℃的搖床中165 r/min培養(yǎng)2 d，獲得NG-15-3的種子培養(yǎng)液。

1.3.2 發(fā)酵 吸取該種子液5 mL加入裝有500 mL GPY培養(yǎng)基的1 L三角燒瓶中，在28 ℃下靜置培養(yǎng)60 d，與空白培養(yǎng)基對(duì)比觀察是否有明顯的菌株生長(zhǎng)，成長(zhǎng)完便停止發(fā)酵(共發(fā)酵菌液208 L)。

1.4 提取與分離

菌液用紗布過(guò)濾，收集菌絲體和發(fā)酵液。培養(yǎng)液在75 ℃水浴條件下濃縮至10 L，所得濃縮液依次用等體積的乙酸乙酯(EtOAc)、正丁醇(n-BuOH)進(jìn)行分配萃取3～5次，分別減壓回收溶劑后得到發(fā)酵液的EtOAc浸膏44 g及n-BuOH浸膏76 g。菌絲體用甲醇浸泡提取3次(1次/d)，所得提取液減壓濃縮共得到甲醇浸膏56.5 g，該浸膏用水涅溶，依次用等量的EtOAc和n-BuOH進(jìn)行分配萃取，分別萃取3次，得到菌絲體的EtOAc浸膏0.5 g和n-BuOH部位浸膏5 g。經(jīng)TLC追蹤顯示，發(fā)酵液與菌絲體的EtOAc相成分相似，故合并二者EtOAc相(共44.5 g)。

取EtOAc部位浸膏(44.5 g)經(jīng)硅膠柱分離，以PE/EtOAc體系梯度洗脫，TLC薄層跟蹤并合并流份得到10個(gè)不同極性的組分(標(biāo)記為Fr1-10)。從Fr1流份中抽濾并重結(jié)晶得到化合物4 (9 mg)。Fr2流份經(jīng)硅膠柱層析(PE/EtOAc洗脫)得到9個(gè)不同極性組分(Fr2-1～2-9)，F(xiàn)r2-5經(jīng)HPLC純化(φ=35% MeOH-H2O)得到化合物2 (5 mg)。Fr4流份經(jīng)硅膠柱層析(PE/EtOAc洗脫)得到8個(gè)不同極性組分(Fr4-1～4-8)，F(xiàn)r4-3經(jīng)HPLC純化(φ=75% MeOH-H2O)得到化合物3 (15 mg)。Fr5流份經(jīng)經(jīng)硅膠柱層析(PE/EtOAc洗脫)得到6個(gè)不同極性組分(Fr5-1～5-5)，F(xiàn)r5-2經(jīng)HPLC純化(φ=25% MeOH-H2O)得到化合物10 (8 mg)。從Fr6流份中抽濾并重結(jié)晶得到化合物5 (90 mg)。Fr7流份經(jīng)硅膠柱層析,經(jīng)PE/EtOAc洗脫,得到化合物8 (30 mg)和化合物9 (10 mg)。Fr8流份經(jīng)硅膠柱層析(PE/ EtOAc洗脫)并經(jīng)HPLC純化(φ=25% MeOH-H2O)得到化合物1 (14 mg)。Fr9流份經(jīng)硅膠柱層析(PE/EtOAc洗脫)得到化合物6 (5 mg)。從Fr10流份中重結(jié)晶得到化合物7 (5 mg)。

1.5 物理常數(shù)與波譜數(shù)據(jù)

化合物1，分子式為C19H23N3O2，白色固體(甲醇)，θmp為210～214 ℃，碘蒸氣顯色。ESI-MSm/z: 324[M-H]-。1H NMR(500 MHz,Pyr-d5)δH: 11.30(1H,s),9.38(1H,s), 7.98(1H,dd, 6.0,3.0 Hz), 7.43～7.34(1H,m),7.23(2H,m),6.34(1H,dd,17.4,10.5 Hz), 5.20(1H,dd,17.4,1.1 Hz),5.14(1H,dd,10.5,1.2 Hz),4.81～4.76(1H,m),4.39(1H,dd,7.0,2.5 Hz),4.10(1H,dd,14.4, 3.1 Hz),3.65(1H,dd,14.4,11.1 Hz),1.75(3H,d,7.1 Hz),1.63(6H,d,15.5 Hz);13C NMR(100 MHz,Pyr-d5)δC: 168.3(C),168.1(C),146.5(CH), 142.1(C),135.3(C),129.5(C),121.0(CH), 118.9(CH),118.4(CH),111.0(C),110.9(CH),105.6(CH2),56.4(CH),51.2(CH),39.1(C),31.9(CH2), 28.1(CH3),28.0(CH3),21.2(CH3)。

化合物2,分子式為C15H10O5，橙紅色針狀結(jié)晶(甲醇)，θmp為262～265 ℃，紫外燈365 nm下呈紅色熒光。ESI-MSm/z: 269[M-1]-。1H NMR(400 MHz,Pyr-d5)δH: 12.43(2H,s),7.71(1H,s), 7.70(1H,d,4,0 Hz),7.13(1H,s),7.0(1H,d,4.0 Hz);13C NMR (100 MHz,Pyr-d5)δC: 190.17(C), 181.67(C),166.96(C),165.40(C),162.12(C),147.85(C),133.25(C),124.03(CH),120.59(CH), 113.68(C),109.61(CH),109.17(C),108.34(CH),29.44(C),21.18 (CH3)。

化合物3，分子式為C16H12O5，磚紅色片狀結(jié)晶(甲醇)，θmp為265～267 ℃，紫外燈365 nm下呈紅色熒光。ESI-MSm/z: 283[M-1]-。1H NMR(400 MHz,Pyr-d5)δH: 13.9(1H,s), 7.80(1H,d,2.3 Hz),7.67(1H,d,1.1 Hz),7.14(1H,s),7.06(1H,d,2.3 Hz),3.90(3H,s),2.22(3H,s);13C NMR(100 MHz,Pyr-d5)δC: 186.9(C),182.7(C),165.5(C),163.7(C),162.4(C), 146.1(C),137.5(C), 132.5(C),124.1(CH),119.2(CH),114.9(C),113.3(C),107.5(CH),105.1(CH),55.8(OCH3),21.1(CH3)。

化合物4，分子式為C16H12O5，橙黃色針狀結(jié)晶(甲醇)，θmp為203～207 ℃，紫外燈365 nm下呈紅色熒光。ESI-MSm/z: 283[M-1]-。1H NMR(400 MHz,Pyr-d5)δH: 13.00(1H,s), 12.29(1H,s),7.69(1H,s),7.50(1H,s),7.13(1H,s),6.90(1H,s),3.78(3H,s),2.25(3H,s);13C NMR(100 MHz,Pyr-d5)δC: 190.4(C),181.3(C),166.4(C),165.04(C),162.17(C),148.2(C),135.0(C),133.1(C), 124.1(CH),120.8(CH),113.6(C),110.1(C),108.0(CH),106.4(CH),55.6 (OCH3),21.2 (CH3)。

化合物5，分子式為C16H12O6，橙黃色針狀結(jié)晶(甲醇)，θmp為284～286 ℃，紫外燈365 nm下呈紅色熒光。ESI-MSm/z: 299[M-1]-。1H NMR(400 MHz,Pyr-d5)δH: 13.99(1H,s), 8.11(1H,s),7.80(1H,d,2.2 Hz),7.67(1H,s),7.06(1H,d,2.2 Hz),4.98(2H,s), 3.91 (3H,s);13C NMR(100 MHz,Pyr-d5)δC: 187.0(C),182.7(C),165.6(C),163.8(C),162.8(C),151.6(C),137.6(C), 132.8(C),121.1(C),116.0(CH),115.7(CH),113.4(C),107.5(CH),105.2(CH),62.8(CH2OH), 55.8(OCH3)。

化合物6，分子式為C11H12N2O2，白色粉末(甲醇)，θmp為266～268 ℃，碘蒸氣顯色。ESI-MSm/z: 203[M-H]-。1H NMR(400 MHz，Pyr-d5)δH: 9.29(1H,s), 9.01(1H,s), 7.24～7.45(2H,m), 7.26～7.19(3H,m),4.59(1H,m),3.96(1H,dd,17.2,3.2 Hz),3.50(1H,d,17.2 Hz), 3.45(1H,dd, 13.2,5.6 Hz),3.29(1H,dd,13.2,4.4 Hz)；13C NMR(100 MHz,Pyr-d5)δC: 168.4(C), 166.7(C), 136.9(C),130.7(2CH),128.7(CH),127.2(2CH),57.3(CH),45.0(CH2),40.8(CH2)。

化合物7，分子式為C7H10N2O2，無(wú)色透明固體(甲醇)，θmp為220～223 ℃，紫外燈254 nm下有暗斑。ESI-MSm/z: 153[M-H]-。1H NMR(400 MHz,MeOD-d4)δH: 4.26～4.15(1H,m), 4.09(1H,ddd,16.8,2.0,1.0 Hz),3.73(1H,d,16.8 Hz),3.53(2H,ddd,17.3,11.9,6.0 Hz), 2.39～2.24(1H,m),2.06～1.86 (3H,m)；13C NMR(100 MHz,MeOD-d4)δC: 171.31(C),165.64(C), 60.18 (CH), 48.24 (CH2),46.58 (CH2),30.09 (CH2),23.89 (CH2)。

化合物8，分子式為C4H4N2O2，白色粉末(甲醇)，θmp為212～214 ℃，碘蒸氣顯色，紫外燈254 nm下有深暗斑。ESI-MSm/z: 111[M-H]-。1H NMR(400 MHz,Pyr-d5)δH:7.52(1H,s), 5.82(1H,d,7.6 Hz);13C NMR(100 MHz,Pyr-d5)δC: 167.0(C),154.5(C),143.3(CH),102.5(CH)。

化合物9，分子式為C5H6N2O2，白色粉末(甲醇)，θmp為248～252 ℃，碘蒸氣顯色，紫外燈254 nm下有深暗斑。ESI-MSm/z: 125[M-H]-。1H NMR(400 MHz,Pyr-d5)δH:7.26(1H,s), 1.92(3H,s);13C NMR(100 MHz,Pyr-d5)δC:170.3(C),166.2(C),153.2(C),137.9(CH), 19.2(CH3)。

化合物10，分子式為C5H5NO2，棕色柱狀固體(甲醇)，θmp為204～208 ℃，硫酸/香草醛顯磚紅色，ESI-MSm/z: 110[M-H]-。1H NMR(400 MHz,Pyr-d5)δH:13.05(1H,s), 7.42(1H,ddd, 3.7,2.3,1.6 Hz), 7.32(1H,td,2.7,1.6 Hz),6.48(1H,dt,3.6,2.4 Hz);13C NMR(100 MHz,Pyr-d5)δC:163.8(COOH),125.1(C),123.3(C),115.3(C),109.9(C)。

2 結(jié)果分析與討論

化合物1，白色固體(甲醇)，碘蒸氣顯色，ESI-MSm/z: 324[M-H]-結(jié)合NMR推斷其分子式為C19H23N3O2，不飽和度為10。1H NMR (400 MHz,Pyr-d5)δH11.30 (1H,s),9.38(1H,s)提示有氮上活潑氫的存在，δH7.98(1H,dd,6.0,3.0 Hz),7.43～7.34(1H,m),7.23(2H,m)則顯示化合物1的芳香區(qū)有1,2-二取代的苯環(huán)上4個(gè)芳?xì)?，氫譜上還出現(xiàn)了一個(gè)反異戊烯基信號(hào)δH6.34(1H,dd,17.4,10.5 Hz),5.20(1H,dd,17.4,1.1 Hz),5.14(1H dd,10.5,1.2 Hz), 1.63(6H,d,15.5 Hz)和丙氨酸信號(hào)δH3.65(1H,dd,14.4,11.1 Hz),1.75(3H,d,7.1 Hz)，一個(gè)亞甲基δH4.39(1H,dd,7.0,2.5 Hz),4.10(1H,dd,14.4,3.1 Hz)和一個(gè)次甲基信號(hào)4.81～4.76(1H,m)。結(jié)合氫譜和碳譜中顯示的亞甲基、脂肪族仲碳和叔碳信號(hào)，這些結(jié)果說(shuō)明1中通過(guò)亞甲基將吲哚環(huán)和二酮哌嗪連接起來(lái)。將1的NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)preechinulin[6]數(shù)據(jù)對(duì)照，基本一致。故確定1為preechinulin。

2007年Kimoto等[7]從一株真菌EurotiumrubrumHiji025代謝產(chǎn)物中分離得到一新的echinulin類化合物neoechinulin A，由于結(jié)構(gòu)中存在C-10/C-11雙鍵，該化合物具有保護(hù)來(lái)源于SIN-1的過(guò)氧亞硝酸引發(fā)的神經(jīng)元細(xì)胞PC12死亡的作用以及抗氧化和抗硝化活性。C-10/C-11為雙鍵時(shí)，一個(gè)完整二酮哌嗪基團(tuán)的是反硝化活性必不可少的，但反氧化劑或細(xì)胞保護(hù)活性不需要[4]，但Preechinulin的C-10/C-11位只存在單鍵，所以其抗氧化活性比較弱。Preechinulin這類化合物有多種官能團(tuán)，是進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾或改造的較好的前體物質(zhì)，可以通過(guò)化學(xué)方法或生物轉(zhuǎn)化的方法提高該類化合物的活性，得到能夠成藥高活性的先導(dǎo)化合物。

化合物2，橙紅色針狀結(jié)晶(甲醇)，紫外燈365 nm下呈紅色熒光，KOH顯色呈粉紅色，提示為蒽醌類物質(zhì)。ESI-MSm/z: 269[M-1]-，結(jié)合NMR推斷其分子式為C15H10O5，不飽和度為11。13C NMR中δC190.17(C)和181.67(C)出現(xiàn)兩個(gè)羰基信號(hào)；同時(shí)1H NMR譜中顯示在δH12.43(2H,s)出現(xiàn)2個(gè)與羰基形成分子內(nèi)氫鍵的酚羥基信號(hào)；在7.71(1H,s),7.70(1H,d,4,0 Hz),7.13(1H,s),7.0(1H,d,4.0 Hz)出現(xiàn)了苯環(huán)上的4個(gè)取代的氫信號(hào)；另外還有1個(gè)與芳香環(huán)相連的甲基信號(hào)2.24(3H,s)。將2的NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)emodin[8]數(shù)據(jù)對(duì)照，基本一致。故確定2為emodin。

化合物3，磚紅色片狀結(jié)晶(甲醇)，KOH顯色呈紅色，提示為蒽醌類物質(zhì)，紫外燈365 nm下呈紅色熒光。ESI-MSm/z:283[M-1]-，結(jié)合NMR推斷其分子式為C16H12O5，不飽和度為11。δC186.9(C)和182.7(C)出現(xiàn)兩個(gè)羰基信號(hào)，δH13.90(1H,s)為分子內(nèi)氫鍵的酚羥基信號(hào)，同時(shí)δH7.80(1H,d,2.3 Hz)和7.06(1H,d,2.3 Hz),7.67(1H,d,1.1 Hz),7.14(1H,s)又可推斷有4個(gè)芳香氫取代并且間位耦合，3.90(3H,s)和 2.22(3H,s)分別顯示有甲氧基和甲基基團(tuán)。將3的NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)1-O-methylemodin[8-9]數(shù)據(jù)對(duì)照，基本一致。故確定3為1-O-methylemodin。

化合物4，橙黃色針狀結(jié)晶(甲醇)，紫外燈365nm下呈紅色熒光，KOH顯色呈紅色，提示為蒽醌類物質(zhì)。ESI-MSm/z:283[M-1]-，結(jié)合NMR推斷其分子式為C16H12O5，不飽和度為11。1H NMR譜中顯示在δH13.00(1H,s),12.29(1H,s)出現(xiàn)2個(gè)與羰基形成分子內(nèi)氫鍵的酚羥基信號(hào)，在δH7.69(1H,s),7.50(1H,s),7.13(1H,s),6.90(1H,s)出現(xiàn)了苯環(huán)上的4個(gè)取代的氫信號(hào)，另外還有2個(gè)單峰甲基信號(hào)δH3.78(3H,s)和2.25(3H,s)。將4的NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)physcion[8]數(shù)據(jù)對(duì)照，基本一致。故確定4為physcion。

化合物5，橙黃色針狀結(jié)晶(甲醇)，紫外燈365 nm下呈紅色熒光，KOH顯色呈紅色，提示為蒽醌類物質(zhì)。ESI-MSm/z: 299[M-1]-，結(jié)合NMR推斷其分子式為C16H12O6，不飽和度為11。δC186.9(C)，182.7(C)出現(xiàn)兩個(gè)羰基信號(hào)，δH13.99 (1H,s)為分子內(nèi)氫鍵的酚羥基信號(hào)，同時(shí)δH8.11(1H,s)和7.67(1H,s)、7.80(1H,d,2.2 Hz)和7.06(1H,d,2.2 Hz)又可推斷有4個(gè)芳香氫取代并且間位耦合，4.98 (2H,s)顯示有亞甲基存在，3.91(3H,s)則是甲氧基信號(hào)。將5的NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)carviolin[9]數(shù)據(jù)對(duì)照，基本一致。故確定5為carviolin。

化合物6，白色粉末(甲醇)，碘蒸氣顯色。ESI-MSm/z: 203[M-H]-，結(jié)合其NMR數(shù)據(jù)確定分子式為C11H12N2O2，不飽和度為7。1H NMR(400 MHz,Pyr-d5)譜中δH9.29(1H,s)和9.01(1H,s)為2個(gè)氮上的氫信號(hào)，13C NMR(100 MHz,Pyr-d5)譜中δC168.4(C),166.7(s)為兩個(gè)酰胺羰基碳信號(hào)，說(shuō)明該化合物可能是一環(huán)二肽類化合物。7.24～7.45(2H,m),7.26～7.19(3H,m)為典型單取代芳環(huán)上的質(zhì)子信號(hào)，同時(shí)δC168.4(C),136.9(C),130.7(2CH),128.7(2CH),127.2(CH)碳信號(hào)與苯丙氨酸片段的碳信號(hào)接近，δH3.45(1H,dd,13.2,5.6 Hz)及3.29(1H,dd,13.2,4.4 Hz)為1個(gè)亞甲基上的2個(gè)質(zhì)子信號(hào)且化學(xué)環(huán)境不同，結(jié)合δH4.6(1H,m)及δC57.3(CH),40.8(CH2)可推斷化合物含苯丙氨酸片段；δH3.96(1H,dd,17.2,3.2 Hz), 3.50(1H,d,17.2 Hz)和δC166.7(C),45.0(CH2)，提示該化合物含甘氨酸片段。將6的NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)cyclo-(Phe-Gly)[10-12]數(shù)據(jù)對(duì)照，基本一致。故確定6為cyclo-(Phe-Gly)。

化合物7，無(wú)色透明固體(甲醇)，紫外燈254 nm下有暗斑。ESI-MSm/z: 153[M-H]-，結(jié)合NMR推斷其分子式為C7H10N2O2，不飽和度為4。1H NMR(400 MHz,MeOD-d4)δH4.26～4.15(1H,m),3.53(2H,ddd,17.3,11.9,6.0 Hz),2.39～2.24(1H,m),2.06～1.86(3H,m)推斷結(jié)構(gòu)中含有脯氨酸片段，δH4.09(1H,ddd,16.8,2.0,1.0 Hz),3.73(1H,d,16.8 Hz)的耦合信息提示含有甘氨酸片段。將7的NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13-15]數(shù)據(jù)對(duì)照基本一致。故確定7為cyclo-(Gly-Pro)。

化合物8，白色固體(甲醇)，紫外燈254 nm下有深暗斑。ESI-MSm/z:111 [M-H]-。結(jié)合NMR數(shù)據(jù)推測(cè)分子中可能含偶數(shù)個(gè)N，進(jìn)而推斷分子式是C4H4N2O2，不飽和度為4。1H NMR(400 MHz,Pyr-d5)譜中僅顯示兩組信號(hào)峰：δH7.52(1H,d,8.0 Hz)和5.82(1H,d,7.6 Hz)，均為N雜環(huán)中的H信息。且13C NMR(400 MHz,Pyr-d5) 顯示出四個(gè)C信號(hào)：δC167.0(C)為羰基C；δC154.5(C)和143.3(CH)推測(cè)出為一個(gè)烯丙基；另δC102.5(CH)提示可能結(jié)構(gòu)中還有一個(gè)雙鍵。除上述不飽和度信息外，并無(wú)其他任何不飽和官能團(tuán)，因而推測(cè)該化合物具有一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)。將8的NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)3H-imidazole-4-carboxylic acid[16]數(shù)據(jù)基本一致。故確定8為3H-imidazole-4-carboxylic acid。

化合物9，為白色固體(甲醇)，紫外燈254 nm下有深暗斑。ESI-MSm/z:125[M-H]-。結(jié)合NMR數(shù)據(jù)推測(cè)分子中可能含偶數(shù)個(gè)N，進(jìn)而推斷分子式是C5H6N2O2，不飽和度為4。1H NMR(400 MHz,Pyr-d5)譜中δH7.26 (1H,s),1.92 (3H,s)只有兩組峰，且13C NMR(400 MHz，Pyr-d5)δC170.3(C),166.2 (C),153.2 (C),137.9 (CH),19.2 (CH3)四個(gè)碳推測(cè)可能含有一環(huán)狀結(jié)構(gòu)。根據(jù)NMR數(shù)據(jù)顯示發(fā)現(xiàn)其母核信息與化合物8一致，推測(cè)9也是一咪唑類化合物；與8結(jié)構(gòu)對(duì)比，咪唑環(huán)上多出一甲基取代。將9的NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)2-methyl-3H-imidazole- 4-carboxylic acid[16]數(shù)據(jù)對(duì)照，基本一致。故確定9為2-methyl-3H-imidazole- 4-carboxylic acid。

化合物10，褐色結(jié)晶(甲醇)，硫酸/香草醛顯磚紅色。ESI-MSm/z: 110[M-H]-，結(jié)合其NMR數(shù)據(jù)確定分子式為C5H5NO2，不飽和度為4。其1H NMR(400 MHz,Pyr-d5)δH13.05(1H,s)顯示羧基氫信號(hào)，11.51 (1H,s)為氮?dú)湫盘?hào)，δH7.42(1H,m)、7.34(1H,dd)、6.47(1H,dd)顯示了芳香氫的特征。13C NMR(400 MHz,Pyr-d5)上顯示有5個(gè)碳信號(hào)，δC164.20(s)為羧基碳，推測(cè)母核為吡咯類化合物。將10的NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)1H-pyrrole-2-carboxylic acid[17]數(shù)據(jù)對(duì)照，基本一致。故確定10為1H-pyrrole-2-carboxylic acid。

致謝：感謝2015年廣東省攀登計(jì)劃專項(xiàng)資金申報(bào)平臺(tái)基金資助及小組成員戴黎蓉、黃素超、胡紫微、陳美慧、卓丹倫的實(shí)驗(yàn)付出；同時(shí)感謝中山大學(xué)分析測(cè)試中心陳曉紅、關(guān)山越、李瑋、姚俊華、馮小龍老師等在結(jié)構(gòu)鑒定中給予的支持。

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Anthraquinones and nitrogen secondary metabolites from the coral-derived symbiotic fungi NG-15-3 of South China Sea

LIXiuting1,LIUBingxin1,HUGuping2,WANGYumei1,ZHANGCuixian1

(1. School of Chinese Material Medica,Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510006,China;2.School of Chemistry and Chemical Engineering,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510275,China)

In order to study the secondary metabolites from the coral-derived symbiotic fungi NG-15-3 of South China Sea, the compounds were isolated by silica gel column chromatography and HPLC. Their structures were identified on the basis of spectral data and physical constant comparison. Four anthraquinones and six nitrogen compounds were isolated as preechinulin (1),emodin (2),1-O-methylemodin(3),physcion(4),carviolin(5),cyclo-(Phe-Gly) (6),cyclo-(Gly-Pro) (7),3H-imidazole-4-carboxylicacid(8),2-methyl-3H-imidazole-4-carboxylicacid(9)and1H-pyrrole-2-carboxylicacid(10).Allthesecondarymetaboliteswerefirstlyacquiredfromthecoral-derivedsymbioticfungiNG-15-3ofSouthChinaSeaandcompound1wasaprecursorsofthemonodehydro-2,5-diketopiperazines,whichshowedvariedbiologicalactivity.

coral-derived symbiotic fungi; NG-15-3; anthraquinones; nitrogen compounds; structural identification

10.13471/j.cnki.acta.snus.2016.01.017

2015-09-05

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014A030313411)；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81001370)；廣東省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(2015A020216017)；中國(guó)科學(xué)院海洋生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合基金資助項(xiàng)目(LMB101002)；2015年廣東省大學(xué)生科技創(chuàng)新培育專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(粵財(cái)教[2015]219號(hào))

李秀婷(1993年生)，女；研究方向：天然藥物化學(xué)；通訊作者: 張翠仙；E-mail:zhangcuixian@aliyun.com

O629.7;R

A

0529-6579(2016)01-0096-06