萬平新，萬順梅，楊麗紅，郭艷芳，張紅云

1.甘肅省靖遠(yuǎn)縣中醫(yī)院康復(fù)科，甘肅 靖遠(yuǎn) 730600； 2.中國人民解放軍第一醫(yī)院 消化內(nèi)科； 3.蘭州軍區(qū)蘭州武都路干休所

高原低氧對大鼠肝臟氧化應(yīng)激損傷的研究

萬平新1，萬順梅2，楊麗紅3，郭艷芳3，張紅云2

1.甘肅省靖遠(yuǎn)縣中醫(yī)院康復(fù)科，甘肅 靖遠(yuǎn) 730600； 2.中國人民解放軍第一醫(yī)院 消化內(nèi)科； 3.蘭州軍區(qū)蘭州武都路干休所

目的 模擬高原低壓、低氧環(huán)境建立大鼠缺氧模型，探討不同缺氧時間對大鼠缺氧肝損傷程度的影響。方法 采用國產(chǎn)低壓低氧動物實驗艙模擬海拔 6 000 m 高原缺氧環(huán)境，觀察1 d、3 d、5 d、7 d 不同缺氧時間大鼠組織病理學(xué)變化情況，并測定血漿丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)的變化及丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性的變化。結(jié)果 ALT、AST、ALP、 MDA隨缺氧時間的延長而升高，尤其以5 d、7 d缺氧組升高明顯(P<0.05)，SOD活性明顯下降(P<0.05)，并可見組織形態(tài)發(fā)生明顯改變。結(jié)論 高原低壓低氧環(huán)境能引起大鼠肝臟發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)而導(dǎo)致肝損傷，其損傷程度隨時間延長而加重，該模型為下一步研究高原脂肪肝的發(fā)病機制及防治提供基礎(chǔ)。

高原；缺氧；肝損傷；低壓氧艙

缺氧性肝損傷是指由于各種急性或慢性缺氧對肝細(xì)胞的損害，其病理表現(xiàn)常為肝細(xì)胞腫脹及脂肪變性，嚴(yán)重者甚至發(fā)生肝大鼠葉中央?yún)^(qū)細(xì)胞壞死。隨著進(jìn)入高原地區(qū)人群的增多，可能出現(xiàn)急性缺氧，也可能因長期生活在高原環(huán)境中存在慢性缺氧，最終可能造成缺氧性肝損傷。既往的高原病研究主要集中在高原肺損傷、高原腦損傷及高原性心臟病等方面，而對于高原低氧環(huán)境導(dǎo)致肝損傷的研究還相對較少，本研究模擬低壓低氧大鼠動物模型，探討隨著缺氧時間變化實驗動物各項指標(biāo)的變化，為下一步高原脂肪肝防治研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF 級大白鼠，雄性，8 周齡，40只，體質(zhì)量190～220 mg，由甘肅中醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供[動物合格證號: SCXK(甘) -2012-0001]。

1.2 實驗儀器采用日立7600-020 全自動生化分析儀(日本，株式會社日立高新技術(shù))測定血清生化指標(biāo)，所用試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，F(xiàn)LYD-WC50-ⅡA 型低壓低氧動物實驗艙(中航工業(yè)貴州風(fēng)雷航空軍械有限責(zé)任公司)。

1.3 低壓低氧動物實驗艙模擬缺氧肝損傷大鼠模型的建立標(biāo)準(zhǔn)大鼠常規(guī)飼養(yǎng)適應(yīng)3 d 后，隨機分為正常對照組和缺氧1 d、3 d、5 d、7 d 組，共5 組，每組8只。按不同缺氧時間分別將各缺氧組大鼠放入低壓艙，密閉艙門，以10 m/s 的速度減壓，模擬上升至海拔6 000 m以上，并維持相應(yīng)的減壓時間，在完成預(yù)定缺氧時間后，調(diào)節(jié)進(jìn)氣孔閥門，以20 m/s 的速度緩慢降至正常海拔高度。水合氯醛麻醉后，股靜脈放血5 ml(用于生化檢測)后即處死，迅速解剖分離肝臟組織，用生理鹽水洗3 次，清除殘血，置于10%中性甲醛液中固定，制作普通病理切片。實驗過程中無大鼠死亡。

1.4 生化指標(biāo)測定ALT、AST、ALP、SOD活性及MDA含量檢測，均按相應(yīng)的試劑盒說明書操作。

1.5 病理學(xué)檢測在肝臟最大葉距邊界5 mm處取大鼠肝組織，浸泡固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 生化指標(biāo)的變化大鼠在升至模擬海拔高度6 093 m、349 mmHg，與正常對照組比較，缺氧組ALT、AST、ALP、MDA隨缺氧時間的延長而升高，尤其以缺氧5 d、7 d組升高明顯(P<0.05)；SOD活性較正常對照組明顯下降(P<0.05，見表1～2)。

2.2 肝臟組織的病理學(xué)表現(xiàn)HE 染色光鏡下觀察，正常對照組大鼠肝結(jié)構(gòu)正常，血管清晰可見，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完好。6 000 m大鼠缺氧1 d組與正常對照組比較，肝細(xì)胞輕度濁腫變性，部分呈空泡樣變，伴炎性細(xì)胞浸潤，隨缺氧時間延長，缺氧3 d組肝細(xì)胞濁腫變性，空泡樣變及炎性細(xì)胞浸潤較正常對照組明顯，比缺氧1 d組稍重，缺氧5 d 組和 7 d 組比缺氧1 d組和3 d組嚴(yán)重，以缺氧7 d組明顯，肝細(xì)胞濁腫變性明顯，空泡樣變增多(見圖1)。

圖1 模擬海拔 6 000 m 急性缺氧不同時間大鼠肝組織顯微結(jié)構(gòu)的影響(200×) A：對照組；B：缺氧1 d 組； C：缺氧 3 d 組； D：缺氧 5 d 組； E：缺氧 7 d 組

表1 模擬海拔6 000 m急性缺氧不同時間大鼠肝酶活性的影響(U/L, ±s)

注:與正常對照組比較，aP<0.05；bP<0.01；cP<0.001。

表2 各組大鼠肝臟SOD活性和MDA含量的變化±s )

注:與正常對照組比較，aP<0.05；bP<0.01；cP<0.001。

3 討論

高原缺氧初期, 機體可以在代償范圍內(nèi)產(chǎn)生適應(yīng)性變化，但持續(xù)的缺氧最終導(dǎo)致組織細(xì)胞缺氧損傷, 這種缺氧損傷主要表現(xiàn)在細(xì)胞膜、線粒體、溶酶體變化上， 缺氧造成細(xì)胞膜對離子的高通透性, 鈉離子內(nèi)流, 又由于ATP生成減少, 使鈉泵發(fā)生功能性障礙, 鈉離子進(jìn)一步內(nèi)流, 導(dǎo)致細(xì)胞水腫。

高海拔地區(qū)由于空氣稀薄、氧分壓低，因組織缺氧可引起肝功能部分損傷，包括ALT、AST等肝臟功能監(jiān)測指標(biāo)升高[1]。高原缺氧使氧自由基產(chǎn)生增多加重細(xì)胞損傷，抗氧化劑SOD活性下降。在高原缺氧環(huán)境下，機體會發(fā)生一定程度的氧自由基代謝紊亂，SOD 活性顯著下降，MDA 含量顯著升高[2]。MDA 是氧自由基和生物膜多聚不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，其產(chǎn)生的量與氧自由基清除的量相平行，測定MDA 可反映氧自由基的代謝情況，間接反映出細(xì)胞損傷的程度[3]。大量流行病學(xué)調(diào)查表明，高原低氧環(huán)境誘導(dǎo)體內(nèi)氧自由基堆積可能導(dǎo)致肝細(xì)胞膜受損和肝臟損傷[4]。有研究報道，間歇低氧及持續(xù)低氧均可引起脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛明顯增加，從而導(dǎo)致肝損傷[5]。

急性或慢性長期缺氧，導(dǎo)致肝內(nèi)血管充血擴張，血液淤滯，肝內(nèi)微循環(huán)不暢，肝組織營養(yǎng)障礙，肝細(xì)胞膜通透性改變，致肝細(xì)胞充血、水腫及脂肪變性。急性低壓缺氧所致的氧化性應(yīng)激及其介導(dǎo)的氧化性損傷也是急性高原病發(fā)病機制的一個重要方面[6-7]，有文獻(xiàn)報道，缺氧性肝損害與缺氧時間呈正相關(guān)[8]。

本實驗研究顯示，實驗大鼠在升至模擬海拔6 000 m高度后，與正常對照組相比，ALT、AST、ALP、MDA含量明顯升高，SOD活性明顯下降，與正常對照組比較，肝細(xì)胞組織形態(tài)發(fā)生了明顯變化，肝細(xì)胞濁腫變性，空泡樣變及炎性細(xì)胞浸潤更為明顯。說明在此條件下缺氧12 h 即可復(fù)制出急性肝損傷動物模型。

目前研究發(fā)現(xiàn)，高原低氧環(huán)境地區(qū)脂肪肝的發(fā)病率高于平原地區(qū)脂肪肝，各種急慢性高原病嚴(yán)重影響著高原地區(qū)軍民的身體健康狀況，該模型為下一步研究高原脂肪肝的發(fā)病機制提供了有利條件，在高原脂肪肝的防治研究中具有重要意義。

[1]Zhang YH, Yuan ZC, Guo RL, et al. Analysis of liver function test results of the population in the plateau to plain for 3 years [J]. Int J Lab Med, 2011, 32(14): 1622-1623. 張雅鴻, 袁振才, 郭瑞林, 等. 高原暴露人群返平原近3年肝功能檢測結(jié)果分析[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 32(14): 1622-1623.

[2] Qian J, Jiang F, Wang B, et al. Ophiopgonin D prevents H2O2-induced injury in primary human umbilical cells [J]. J Ethnopharmacol, 2010, 128(2): 438-445．

[3] Shen ZB, Yin YQ, Tang CP, et al. Pharmacodynamic screening and simulation study of anti-hypoxia active fraction of Xiangdan injection [J]. J Ethnopharmacol, 2010, 127(1): 103-107．

[4] Rong L, Dai LL, Zeng WZ, et al. Protective effect of salidroside on liver injury of rats under altitude hypoxia simulation [J]. Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research, 2010, 14(31): 5813-5817． 榮黎, 戴立里, 曾維政, 等. 紅景天甙對擬高原缺氧大鼠肝損傷的保護(hù)作用[J]．中國組織工程研究與臨床康復(fù), 2010, 14(31): 5813-5817.

[5] Zhang Z, Dong LX, Li S, et al. Study on oxidative stress injury induced by intermittent hypoxia in rats [J]. China Parc Med, 2013, 8(34): 250-251. 張禎, 董麗霞, 李碩, 等. 間歇低氧對大鼠肝臟氧化應(yīng)激損傷的研究[J].中國實用醫(yī)藥, 2013, 8(34): 250-251.

[6] Dosek A, Ohno H, Acs Z， et al. High altitude and oxidative stress [J]. Respir Physiol Neurobiol, 2007, 158(2-3): 128-131.

[7] Maiti P, Singh SB, Mallick B, et al. High altitude memory impairment is due to neuronal apoptosis in hippocampus， cortex and striatum [J]. J Chem Neuroanat, 2008, 36(3-4): 227-238.

[8] Deng HY, Luo FM. The effect of NK 1 tachykinin receptor antagonist on hypoxia induced hepatic function injury and hepatocellular apoptosis in rats [J]. Journal of Biomedical Engineering, 2011, 28(5): 992-996. 鄧宏宇， 羅鳳鳴. P 物質(zhì)受體拮抗劑對缺氧大鼠模型肝功能及肝細(xì)胞凋亡的影響[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志, 2011, 28(5): 992-996.

(責(zé)任編輯：陳香宇)

The research of hepatic oxidative stress injury in high altitude hypoxia in rats

WAN Pingxin1, WAN Shunmei2, YANG Lihong3, GUO Yanfang2, ZHANG Hongyun2

1. Department of Rehabilitation, Jingyuan Hospital of Traditional Chinese Medicine, Jingyuan 730600； 2. Department of Gastroenterology, the First Hospital of Chinese PLA; 3. Lanzhou Military Wudu Road Retired Cadresy, China

Objective To establish an animal model of mountain sickness by a decompression chamber and to investigate the effect of different hypoxia durations on the injury degree of liver in experimental rat．Methods Rats were housed in a decompression chamber and exposed to simulated high altitude of 6 000 meters for 1 day, 3 days, 5 days, 7 days, respectively. Pathological changes， the serum MDA content, ALT, AST, ALP activity and SOD activity were examined. Results The serum MDA content, ALT, AST, ALP activity were gradually increased with time expanded of hypoxia, especially in 5 days, 7 days, the SOD activity was obviously decreased (P<0.05)．Pathological changes of liver tissues were obvious. Conclusion High altitude hypoxia can induce liver oxidative stress and cause liver damage in rat. The injury was aggravated with time expanded of hypoxia. This model provides the basis for the mechanism study of fatty liver and its prevention and control.

High altitude; Hypoxia; Liver injury; Decompression chamber

萬平新，主治醫(yī)師,研究方向：脂肪肝的中醫(yī)藥防治

萬順梅，副主任醫(yī)師，研究方向：脂肪肝的防治。E-mail：lily2008960@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.01.023

R575

A

1006-5709(2016)01-0084-03

2014-12-10