石 偉，倪付勇，李 云，張 暉，孫仙玲，黃道省，李家春,王振中，蕭 偉＊＊

（1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 南京 210000；2. 中藥制藥過程新技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 連云港 222001；3. 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司 連云港 222001）

基于多成分含量測定的六味地黃濃縮丸溶出度考察＊

石 偉1,2，倪付勇2,3，李 云1,2，張 暉2,3，孫仙玲1,2，黃道省2,3，李家春2,3,王振中2,3，蕭 偉2,3＊＊

（1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 南京 210000；2. 中藥制藥過程新技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 連云港 222001；3. 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司 連云港 222001）

目的：本研究以沒食子酸、5-羥甲基糠醛、莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷5個成分的含量為溶出指標(biāo)，建立多成分指標(biāo)評價六味地黃濃縮丸溶出度的方法。方法：測定條件為漿法，以900 mL 0.1 mol·L-1鹽酸作為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速100 r·min-1，溫度（37.0±0.5）℃。采用RP-HPLC外標(biāo)法定量，Agilent TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.02%三氟乙酸溶液為流動相，梯度洗脫；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為30℃；檢測波長：238 nm。結(jié)果：該廠家10個批次的六味地黃濃縮丸中5個成分的溶出曲線相似因子?2大部分高于50，表明該廠家不同批次間六味地黃濃縮丸的溶出度差異性較小。結(jié)論：該方法簡便，重復(fù)性良好，適用于六味地黃濃縮丸中5個成分的溶出度測定。

六味地黃濃縮丸高效液相色譜法溶出度多成分5-羥甲基糠醛

藥物的溶出度是指藥物從丸劑、片劑等固體制劑在規(guī)定溶出介質(zhì)中溶出的速度和程度。因此，考察固體制劑的溶出度可以間接反映該制劑的內(nèi)在質(zhì)量[1-8]。六味地黃濃縮丸是由酒萸肉（制）、熟地黃、茯苓、牡丹皮、澤瀉、山藥6味藥材經(jīng)一定工藝流程制備所得的復(fù)方制劑[9]，用于治療腰膝酸軟、腎陰虧虛等[10-15]。2010版《中國藥典》對六味地黃濃縮丸中的馬錢苷、丹皮酚進(jìn)行控制[9]，相較其成分的復(fù)雜性，不足以反映該制劑的內(nèi)在品質(zhì)。本研究以沒食子酸、5-羥甲基糠醛、莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷5個有效成分的含量為溶出指標(biāo)[16-18]，測定同一廠家10批樣品的溶出度，以考察其質(zhì)量。

1 儀器與試藥

島津高效液相色譜儀（日本島津公司）；XP6電子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；BP211D型電子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；ZRS-8G智能溶出試驗(yàn)儀（天津天大天發(fā)科技有限公司）。

沒食子酸，純度90.1%（中國食品藥品檢定研究院，批號：110831-200803）；5-羥甲基糠醛（中國食品藥品檢定研究院，批號：110626-201308）；馬錢苷對照品，純度99.2%（中國食品藥品檢定研究院，批號：110640-201005）；芍藥苷，純度94.9%（中國食品藥品檢定研究院，批號：110736-201136）。莫諾苷由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院從山茱萸藥材中分離得到，經(jīng)1H-NMR，13C-NMR進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，HPLC峰面積歸一化法分析測得純度為95.7%。乙腈（色譜純），水為自制純化水，其余均為分析純。10批六味地黃濃縮丸均購自廠家A（批號1-10）：130505、130920、131237、140147、140239、140335、140341、140522、140530、140616。

圖1 高效液相色譜圖

圖2 對照品結(jié)構(gòu)式

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為：乙腈（A）-0.02%三氟乙酸（B），梯度洗脫（0-5 min，96% B；5-30 min，96% B-84% B；30-40 min，84% B）；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為30℃；檢測波長：238 nm。色譜圖見圖1。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取沒食子酸（Ⅰ）、5-羥甲基糠醛（Ⅱ）、莫諾苷（Ⅲ）、馬錢苷（Ⅳ）、芍藥苷（Ⅴ）對照品適量，精密稱定，置棕色容量瓶中，加甲醇分別制成每1 mL含沒食子酸0.378 μg、5-羥甲基糠醛（5-HMF）1.89 μg、莫諾苷0.212 μg、馬錢苷0.346 μg、芍藥苷0.229 μg的混合對照品溶液，結(jié)構(gòu)式圖見圖2。

2.3 供試品溶液的制備

取重量差異下的濃縮丸樣品，精密稱定。參照《中國藥典》（2010版二部）附錄XC溶出度測定法第二法，溶出介質(zhì)為900 mL，經(jīng)脫氣處理后的0.1 mol·L-1的鹽酸，采用漿法，轉(zhuǎn)速100 r·min-1，溫度（37.0±0.5）℃，于10、20、30、45、60、90、120 min分別取樣2 mL（取后補(bǔ)同溫溶出介質(zhì)等量），經(jīng)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取對照品混標(biāo)溶液20 μL，按“2.1”色譜條件，進(jìn)樣，測定，連續(xù)6次。以沒食子酸、5-羥甲基糠醛、莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷的峰面積計算，RSD分別為0.57%、1.10%、0.94%、0.71%、1.20%，結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.5 線性關(guān)系考察

取沒食子酸、5-羥甲基糠醛、莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成所需濃度的對照品溶液，即得。分別吸取上述溶液20 μL，注入高效液相色譜儀，測定，以峰面積平均值為縱坐標(biāo)（Y），對照品濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得回歸方程，詳見表1。結(jié)果表明，沒食子酸、5-羥甲基糠醛、莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷在各自的濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取溶出時間為20 min的六味地黃溶出液液，分別于0、2、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣，按“2.1”項色譜條件測定，以沒食子酸、5-羥甲基糠醛、莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷峰面積計算，結(jié)果RSD分別為1.20%、1.40%、1.00%、0.92%、1.60%，結(jié)果表明供試品溶液放置24 h穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取同一批已知含量樣品（批號：130920）粉末0.5 g，共6份，精密稱定，分別精密加入沒食子酸、5-羥甲基糠醛、莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷對照品適量；搖勻，取20 μL進(jìn)樣，測定5個成分的峰面積，計算平均回收率。詳見表2。

表1 5種成分的線性范圍、回歸方程和相關(guān)系數(shù)

表2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.8 同一廠家不同批次六味地黃濃縮丸溶出度的測定

取不同批號的六味地黃丸，按“2.3”項下的方法制備供試品溶液，每次進(jìn)樣量20 μL。取“2.2”項下的對照品溶液，進(jìn)樣20 μL。按“2.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積，測定5個成分的含量，計算成分累積溶出率，繪制累積溶出曲線，結(jié)果見圖3。

結(jié)合各成分實(shí)際溶出情況，本實(shí)驗(yàn)選擇了具有較穩(wěn)定和較高溶出率的批號3樣品作為參比制劑，采用相似因子法（?2）比較該廠家各批次產(chǎn)品中5個成分溶出度的差異。

計算公式為：

公式中Rt和Tt為各取樣點(diǎn)參比和供試制劑的平均溶出率，n為取樣點(diǎn)個數(shù)。當(dāng)?2值介于50到100之間時，供試制劑的溶出曲線與參比試劑相似性良好，比值越高，相似度越高。分析結(jié)果見表3。

結(jié)果顯示，10批產(chǎn)品之間5-羥甲基糠醛、馬錢苷的溶出，各批次與參比制劑間的?2值均大于50；對于沒食子酸的溶出，除第9批與參比制劑間的?2值略低，其余均大于50；莫諾苷的溶出第6、8批與參比制劑間的?2值小于50；而芍藥苷的溶出，各批次相較參比制劑間的溶出度差別均較大。結(jié)果表明，該廠家所選批次之間這5個成分的溶出除芍藥苷外考察基本無顯著差異，佐證了該廠家的產(chǎn)品穩(wěn)定性較好。

3 討論

近年來，化藥中的許多固體制劑比如片劑、膠囊劑等均制定了比較完整的溶出度考察項。中藥溶出度的考察受限于其復(fù)雜的成分，很多固體制劑尚無溶出度考察項。目前，針對六味地黃濃縮丸，在溶出度考察方面，已發(fā)表文獻(xiàn)多集中于一兩個指標(biāo)[19-22]。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法，選取了沒食子酸等5個成分的含量作為測定指標(biāo)，符合中藥現(xiàn)代化和國際化的質(zhì)量控制要求。

圖3 10批六味地黃濃縮丸5種成分累積溶出曲線

本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)[23]，對水和0.1 mol·L-1的鹽酸兩種溶出介質(zhì)進(jìn)行了考察，結(jié)果與該文獻(xiàn)報道基本一致，故選擇0.1 mol·L-1的鹽酸作為溶出介質(zhì)。

通過采用二極管陣列檢測器在210 nm至400 nm范圍內(nèi)掃描，結(jié)果顯示，選取238 nm作為檢測波長，能夠很好的兼顧樣品中這5種成分的紫外吸收。

六味地黃丸主要功用為滋陰補(bǔ)腎，王喜軍[24]等通過研究六味地黃丸及血中移行成分對氫化可的松致大鼠腎虛動物模型的保護(hù)作用，初步證實(shí)分離得到的六味地黃丸血中移行成分為六味地黃丸補(bǔ)腎的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，其中馬錢苷和莫諾苷是補(bǔ)腎的核心成分。中醫(yī)認(rèn)為腎和內(nèi)分泌腺有著密切的關(guān)系，朱東亮等[25]通過成分與藥效的關(guān)聯(lián)性分析，發(fā)現(xiàn)5-羥甲基糠醛、馬錢苷等對內(nèi)分泌綜合效應(yīng)具有正效應(yīng)。戴冰等[26]采用HPLC法對陰虛證與六味地黃入血成分芍藥苷濃度進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)陰虛證大鼠血清中芍藥苷含量較健康大鼠高。沒食子酸同時存在于山茱萸和牡丹皮中，測定其含量有利于兩種藥材的質(zhì)量控制，故選擇上述5個成分的含量作為溶出指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)對同一廠家10個批次的樣品進(jìn)行溶出度考察，由批號可知，各樣本批號周期為一年，時間選擇上亦具有一定的代表性；同時，含測結(jié)果顯示，所選指標(biāo)之一5-羥甲基糠醛的含量較高，可以降低溶出度測定中由于溶出介質(zhì)體積大（900 mL），開始時溶出量較少，藥液濃度偏低，峰面積較小，積分不準(zhǔn)所帶來的誤差。

表3 10批樣品5種成分f2值

本研究以樣品中5個成分的含量變化對其進(jìn)行溶出度考察，并通過相似因子法評價溶出度差異，結(jié)果顯示，該廠家各批次之間4個成分（除芍藥苷外）的溶出考察結(jié)果基本無顯著性差異。馬錢苷相似性較其他成分好，可能與其為藥典含量測定指標(biāo)[9]，要求較其他成分高有關(guān)。芍藥苷的溶出變化存在較顯著差異，其原因可能是由于該制劑中芍藥苷峰面積較小，積分誤差所致；也可能與原料藥的差別、提取溫度的不同以及提取時間的長短等因素有關(guān)。

六味地黃方成分復(fù)雜，制劑種類多樣。目前，所發(fā)表的文獻(xiàn)[19-23]多集中于測定濃縮丸的溶出度，針對其他劑型，如硬膠囊、片劑等劑型考察較少，下一步將考慮對其他劑型進(jìn)行溶出度方面的研究。

1 袁海龍,黃雪,肖小河.中藥固體制劑溶出度研究與展望.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2010, 12(6): 915-919.

2 黃雪,袁海龍,肖小河,等.基于生物熱動力學(xué)表征的中藥固體制劑體外溶出度分析方法初步研究.藥學(xué)學(xué)報, 2010, 45(3): 338-342.

3 楊榮平,楊明,劉小彬.中藥固體制劑及其溶出度的研究概況.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2005, 7(2): 45-49,139.

4 高蓓,孫長山,支壯志,等.兩種難溶性藥物-納米多孔ZnO固體分散體的制備與提高藥物溶出度機(jī)制的研究.藥學(xué)學(xué)報, 2011, 46(11): 1399-1407.

5 吳云,錢俊,蕭偉,等.銀杏內(nèi)酯滴丸的溶出度測定方法學(xué)研究.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2011, 13(6): 1114-1117.

6 戴領(lǐng),申寶德,呂青遠(yuǎn),等.基于生物效價-多成分整合的中藥固體制劑體外溶出度研究.中草藥, 2013, 44(19): 2666-2671.

7 鹿麗麗,蕭偉,徐連明,等.不同粒徑三七粉物理性質(zhì)及體外溶出度的比較研究.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2013, 15(2): 305-309.

8 蔣曄,田書霞.中藥溶出度的研究進(jìn)展.中成藥, 2006, 28(3): 415-419.

9 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部).北京:中國醫(yī)藥科技出版社, 2010: 598.

10 楊承進(jìn),王德英.六味地黃丸(湯)的臨床應(yīng)用及實(shí)驗(yàn)研究.中成藥研究, 1983, 6: 33-34.

11 郭意欣,陳新林,丘振文,等.六味地黃丸聯(lián)合西藥治療高血壓病的Meta分析和系統(tǒng)評價.中國中醫(yī)急癥, 2013, 22(2): 189-191, 210.

12 趙建生,葉振邦,趙濤,等.六味地黃丸延緩衰老的臨床研究及其藥理實(shí)驗(yàn)研究.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2006, 8(2): 117-122, 101.

13 黃江榮,李祥華,張家均,等.六味地黃丸對甲狀腺功能亢進(jìn)腎陰虛型小鼠基礎(chǔ)代謝的影響.中藥藥理與臨床, 2011, 27(5): 1-3.

14 陳麗,周忠志,何澤云,等.六味地黃丸對慢性腎臟病研究的新進(jìn)展.湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報, 2013, 33(8): 104-107.

15 陳喬,李征峰,李青,等.六味地黃丸對老年大鼠學(xué)習(xí)記憶及腦內(nèi)M1膽堿受體陽性神經(jīng)元的影響.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2013, 19(3): 205-208.

16 李肖玲,崔嵐,祝德秋.沒食子酸生物學(xué)作用的研究進(jìn)展.中國藥師, 2004, 7(10): 767-769.

17 戴冰,肖子曾,劉磊,等.六味地黃丸入血成分莫諾苷對大鼠前脂肪細(xì)胞增殖與分化的影響.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué), 2007, 12(11): 1245-1249.

18 丁霞,王明艷,蔡寶昌,等.山茱萸中5-羥甲基糠醛的分離鑒定及生物活性研究.中國中藥雜志, 2008, 33(4): 392-396, 484.

19 蘇瑞強(qiáng),何煜,王瑞成,等.超微粉碎技術(shù)提高六味地黃丸(水蜜丸)溶出度的研究.中國中藥雜志, 2002, 27(7): 34-36.

20 韓玲玲,胡容峰.高效液相色譜法測定六味地黃丸的溶出度.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2007, 13(4): 8-10.

21 程荷珍,王桂紅,王萍.六味地黃丸(濃縮丸)溶出度的測定.中成藥, 2001, 23(5): 70-71.

22 呂興萍,胡容峰,葉蕾,等.高效液相色譜法測定六味地黃丸的溶出度.中成藥, 2014, 36(3): 652-654.

23 羅云,郝偉偉,廖正根,等.基于多指標(biāo)成分同時檢測的六味地黃濃縮丸溶出度測定.中國中藥雜志, 2014, 39(2): 240-246.

24 王喜軍,張寧,孫暉,等.六味地黃丸血中移行成分對氫化可的松致大鼠腎虛動物模型的保護(hù)作用.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2008, 14(2): 33-37.

25 朱東亮,張海,田文君,等.基于“成分-藥效”關(guān)聯(lián)分析的六味地黃丸質(zhì)量控制方法.中國科學(xué):化學(xué), 2010, 40(6): 786-793.

26 戴冰,劉磊,肖子曾,等. RP-HPLC測定口服六味地黃丸后正常及陰虛大鼠血清芍藥苷含量.中國中醫(yī)藥科技, 2008, 15(1): 46-47.

Determination of Dissolution of Liuwei Dihuang Concentrated Pills Based on Multi-Index Components

Shi Wei1,2, Ni Fuyong2,3, Li Yun1,2, Zhang Hui2,3, Sun Xianling1,2, Huang Daosheng2,3, Li Jiachun2,3, Wang Zhenzhong2,3, Xiao Wei2,3
(1. College of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210000, China; 2. State Key Laboratory of New-Tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Lianyungang 222001, China; 3. Jangsu Kanion Pharmaceutical Co. Ltd., Lianyungang 222001, China)

This study aimed to establish a dissolution determination method for multi-index components inLiuwei Dihuangconcentrated pills with the content of gallic acid, 5-hydroxymethyl furfural, morroniside, loganin and paeoniflorin as indexes. The paddle method was adopted with 900 mL of 0.1 mol·L-1hydrochloric acid as the dissolution medium at a rotation rate of 100 r·min-1and the temperature of 37.0±0.5℃. Adopting RP-HPLC method (an external standard method) was applied for quantitative, while Agilent TC-C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) column was with acetonitrile-0.02% TFA as mobile phase gradient elution volume flow of 1.0 mL·min-1, column temperature at 30℃, and detection wavelength at 238 nm. It was found that similarity factorsf2of the dissolution curve of the five main components of different batches ofLiuwei Dihuangconcentrated pills were mostly higher than 50, which referred to the dissolution of a smaller difference between these samples. It was demonstrated that this method was simple, reproducible, applicable for measuring the five components dissolution of Liuwei Dihuang concentrated pills.

Liuwei Dihuangconcentrated pills, HPLC, dissolution, multi-component, 5-hydroxymethyl furfural

10.11842/wst.2016.03.034

R284

A

（責(zé)任編輯：朱黎婷 張志華，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2014-11-24

修回日期：2015-01-29

＊ 國家科技部“重大新藥創(chuàng)制“科技重大專項（2013ZX09402203）：現(xiàn)代中藥創(chuàng)新集群與數(shù)字制藥技術(shù)平臺，負(fù)責(zé)人：王振中。

＊＊ 通訊作者：蕭偉，本刊編委，博士生導(dǎo)師，研究員，主要研究方向：中藥新劑型的研究與開發(fā)。