孫　莉，　嘎　琴，　楊全余，　靳國(guó)恩

(青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心，青海 西寧 810001)

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siRNA沉默EGLN1基因?qū)Φ脱跸麓笫蠓蝿?dòng)脈平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響*

孫莉，嘎琴，楊全余，靳國(guó)恩△

(青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心，青海 西寧 810001)

[摘要]目的： 體外培養(yǎng)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)，利用小干擾RNA技術(shù)轉(zhuǎn)染PASMCs干擾EGLN1基因表達(dá)，檢測(cè)細(xì)胞活力變化，從而驗(yàn)證EGLN1在PASMCs活力變化中的作用。方法: 采用原代培養(yǎng)PASMCs，構(gòu)建出特異的EGLN1 siRNA脂質(zhì)體并轉(zhuǎn)染到PASMCs；分別在常氧和低氧下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，采用Western blot 檢測(cè)PASMCs 的EGLN1蛋白、VEGF蛋白表達(dá)水平；用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，探討低氧條件下沉默EGLN1基因表達(dá)后對(duì)PASMCs活力的影響。結(jié)果: 低氧下PASMCs活力變化和VEGF的蛋白水平表達(dá)較常氧下增加并呈時(shí)間依賴性;EGLN1沉默后，無(wú)論低氧和常氧下，PASMCs活力變化和VEGF的蛋白水平表達(dá)均受到抑制。結(jié)論: EGLN1基因參與調(diào)控低氧下大鼠PASMCs的生長(zhǎng)，其調(diào)節(jié)可能是通過(guò)VEGF的介導(dǎo)而完成的。

[關(guān)鍵詞]低氧； EGLN1基因； 大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞； 細(xì)胞活力

低氧性肺動(dòng)脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension，HPH)是高原地區(qū)常見(jiàn)病、不同年齡段均可發(fā)病，其主要病理特征為肺動(dòng)脈壓的持續(xù)增高和肺動(dòng)脈壁的增厚及血管肌性化，嚴(yán)重時(shí)可誘發(fā)右心結(jié)構(gòu)和功能改變，甚至出現(xiàn)心力衰竭而危及生命。其中低氧是該病發(fā)生的最主要因素。肺動(dòng)脈血管收縮性增加、肺血管重構(gòu)及微血管損傷是HPH的主要病理機(jī)制[1]，前者主要發(fā)生在低氧早期，具有可逆性，后者出現(xiàn)在低氧后期，其可逆性差。其中肺血管重塑主要表現(xiàn)為肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)肥大、增生和細(xì)胞外基質(zhì)合成增多導(dǎo)致肺小動(dòng)脈管壁變厚，內(nèi)徑變窄，肌型血管中膜肥厚，非肌型血管出現(xiàn)平滑肌樣細(xì)胞等。因此，低氧性肺血管重構(gòu)是慢性低氧性肺動(dòng)脈高壓的基礎(chǔ)，低氧性肺血管重構(gòu)的防治研究日益受到人們的重視。

EGLN1基因編碼的脯氨酸羥化酶2(proline hydroxylase 2，PHD2)是重要的低氧反應(yīng)元件和高海拔低氧環(huán)境功能適應(yīng)的主要氧感受器。其作為低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor，HIF)信號(hào)通路中的重要調(diào)節(jié)因子，低氧下PHD2羥基化HIF-1α受阻，蛋白質(zhì)的降解中斷，HIF-1α亞基大量累積，啟動(dòng)多種低氧反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄從而誘導(dǎo)靶基因表達(dá)，形成低氧反應(yīng)調(diào)節(jié)通路，參與調(diào)節(jié)高海拔低氧適應(yīng)過(guò)程。當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)，與缺氧有關(guān)的2 個(gè)基因EPAS1(HIF-2α)和EGLN1在西藏夏爾巴人中強(qiáng)表達(dá)，這2個(gè)基因與非藏族的低海拔地區(qū)(漢族與日本人)明顯不同[2-4]。雖然國(guó)內(nèi)外在研究HIF-1α對(duì)PASMCs的影響方面的報(bào)道很多，但有關(guān)EGLN1是否也參與了低氧下對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞活力的調(diào)控尚未見(jiàn)報(bào)道。

由于，EGLN1對(duì)于PASMCs生長(zhǎng)與肺血管重建的作用并不明確， 本研究主要研究干擾EGLN1 基因的表達(dá), 是否影響其下游低氧應(yīng)答反應(yīng)的激活, 最終調(diào)節(jié)一系列如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等下游低氧應(yīng)答基因的表達(dá)，使得機(jī)體適應(yīng)高海拔低氧環(huán)境。因此，本實(shí)驗(yàn)利用siRNA技術(shù)，體外轉(zhuǎn)染PASMCs并干擾EGLN1的表達(dá)，檢測(cè)細(xì)胞活力變化，探討EGLN1在PASMCs生長(zhǎng)中的作用。

材料和方法

1主要試劑

胎牛血清和OPTI-MEM購(gòu)于Gibco；DMEM/F12購(gòu)于HyClone；0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液和青、鏈霉素混合液(100×)購(gòu)于Solarbio；Lipo2000購(gòu)于Invitrogen；DAPI和FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司；蛋白預(yù)染Marker購(gòu)于Fermentas；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)于Thermo；吐溫-20(Tween-20)購(gòu)于Amresco；NC膜購(gòu)于Millipore；EGLN1、VEGF和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha smooth muscle actin，α-SMA)抗體購(gòu)于Abcam；GAPDH抗體購(gòu)于CST；CCK-8購(gòu)于七海生物。

2方法

2.1大鼠PASMCs的分離、培養(yǎng)及鑒定取SD大鼠超凈臺(tái)內(nèi)處死，取肺組織，分離肺內(nèi)動(dòng)脈血管于PBS中。分離出血管中膜，輕刮內(nèi)膜面3～5次，PBS漂洗1次，置于含20%胎牛血清和1%雙抗的D/F12培養(yǎng)液中。用眼科剪將血管中膜剪碎(1 mm2左右)，將碎片移到培養(yǎng)瓶底均勻排布，加入足量的DMEM/F12，倒置培養(yǎng)箱中孵育4～6 h后，另一側(cè)翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使培養(yǎng)液沒(méi)過(guò)組織塊。在培養(yǎng)箱中孵育3～7 d后進(jìn)行觀察和換液，鏡下觀察細(xì)胞已融合生長(zhǎng)即可傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)時(shí)，吸去培養(yǎng)液和漂浮的組織塊，用PBS漂洗培養(yǎng)瓶2～3次，胰蛋白酶(0.25%)消化3 min，使細(xì)胞脫落后離心。取細(xì)胞懸液，置于培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)箱中孵育。傳代時(shí)，將細(xì)胞懸液靜置，使部分細(xì)胞(成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞)貼壁，然后將未貼壁的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一培養(yǎng)皿中，再次靜置、貼壁，重復(fù)2次即可得到較純的平滑肌細(xì)胞。

將細(xì)胞培養(yǎng)液洗去，細(xì)胞爬片用0.02 mol/L PBS洗滌3次，用4 %甲醛固定30 min，0.02 mol/L PBS洗5 min 3次。滴加合適比例稀釋的I抗，4 ℃下孵育過(guò)夜。PBS漂洗5 min 3次，不時(shí)振蕩洗去多余游離抗體。滴加合適比例稀釋的熒光II抗，4 ℃下孵育1 h。防淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下拍片。

2.2siRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染及靶點(diǎn)篩選轉(zhuǎn)染對(duì)照組：250 μL Opti-mem無(wú)血清培養(yǎng)基；陰性對(duì)照(negative control,NC)組：將5 μL NCsiRNA(約100 pmol)溶于245 μL Opti-mem無(wú)血清培養(yǎng)基中；陽(yáng)性對(duì)照(postive control,PC)組：將5 μL PCsiRNA溶于245 μL Opti-mem無(wú)血清培養(yǎng)基中；干擾組：將5 μL siRNA溶于245 μL Opti-mem無(wú)血清培養(yǎng)基中；每組加入5 μL的lipo2000及245 μL Opti-mem無(wú)血清培養(yǎng)基混合溶液，室溫靜置20 min。轉(zhuǎn)染時(shí)棄去原培養(yǎng)基，用無(wú)菌PBS漂洗 1 次，再加入1 mL不含血清培養(yǎng)液。把各管復(fù)合物緩緩加入相應(yīng)的培養(yǎng)液中，搖勻，37 ℃培養(yǎng)箱中放置6 h，吸除無(wú)血清轉(zhuǎn)染液，換入完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后用Western blot檢測(cè)siEGLN1的3個(gè)靶點(diǎn)的表達(dá)。EGLN1基因3個(gè)siRNA oligo序列如下：靶點(diǎn)1為5’-AUGGAGACGGAAGAUGUGUUU-3’(348～370)；靶點(diǎn)2為5’-GACGGAAGAUGUGUGACAUUU-3’(353～375)；靶點(diǎn)3為5’-GCGGAGGUAUUCUUCGAAUUU-3’(411～433)。

2.3低氧條件下培養(yǎng)PASMCs并檢測(cè)干擾效果空白組只有培養(yǎng)基無(wú)PASMCs；陰性對(duì)照組(非干擾組)即在培養(yǎng)基中加入PASMCs；干擾組為siRNA干擾EGLN1后的PASMCs加入培養(yǎng)基中。采用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液 的DMEM/F12培養(yǎng)液，常氧培養(yǎng)置于37 ℃、5% CO2、20% O2的培養(yǎng)箱(Thermo Forma 3111)中進(jìn)行培養(yǎng)，低氧培養(yǎng)置于37 ℃、5% CO2、2% O2的培養(yǎng)箱(Thermo Forma 3131)中培養(yǎng)。臺(tái)盼藍(lán)染色活細(xì)胞率達(dá)95%以上。在常氧和低氧條件下分別培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、72 h。72 h后用Western blot法檢測(cè)siRNA的干擾效果。

2.4Western blot法檢測(cè)VEGF蛋白的表達(dá)水平Western blot法檢測(cè)VEGF蛋白表達(dá)，提取細(xì)胞總蛋白，取20 μg蛋白樣品于10% SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)膜。膜在室溫下封閉1 h，分別加入I 抗(EGLN1為1∶1 000、GAPDH為1∶1 000)及HRP標(biāo)記的 II 抗孵育。ECL化學(xué)發(fā)光顯影，以目的蛋白與 GAPDH灰度比為表達(dá)值，取 3次結(jié)果的平均值作為相對(duì)密度值。

2.5CCK-8法檢測(cè)EGLN1對(duì)低氧條件下PASMCs細(xì)胞活力的影響將轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞胰蛋白酶消化，稀釋細(xì)胞使其濃度為3×107/L培養(yǎng)液。分別取100 μL至96孔培養(yǎng)板，每種細(xì)胞每塊板接種3個(gè)同樣的孔作為復(fù)孔，每孔3×103個(gè)細(xì)胞，常氧培養(yǎng)過(guò)夜貼壁。在常氧和低氧條件下分別培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、72 h后，按1∶10 體積比混合CCK-8和無(wú)血清基本培養(yǎng)基DMEM/F12，每孔100 μL加入待測(cè)孔中，37 ℃、5% CO2孵育1 h；用微板分光光度計(jì)測(cè)定450 nm波長(zhǎng)下的吸光度(A)值，記錄每塊板的數(shù)值。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用單因素方差分析進(jìn)行組間差異比較，兩兩比較分別采用SNK-q法、Tamhane’s T2法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1PASMCs細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定

原代培養(yǎng)3 d，可見(jiàn)PASMCs貼壁伸展，形態(tài)各樣，大小不一，三角形、梭形、帶狀或不規(guī)則型的都有，胞漿豐富。部分區(qū)域多層重疊生長(zhǎng)，高低起伏，細(xì)胞多的地方疊在一起，形成一個(gè)山峰，細(xì)胞少的地方一個(gè)都沒(méi)有，呈現(xiàn)“峰-谷”狀，是PASMCs的典型生長(zhǎng)特點(diǎn)。應(yīng)用免疫熒光的方法對(duì)PASMCs進(jìn)行鑒定，熒光顯微鏡下可見(jiàn)，綠色熒光標(biāo)記的α-SMA，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The immunofluorescence staining of α-SMA in primary cultured rat PASMCs. 1: primary cell culture (×100); 2: α-SMA (×200); 3: DAPI (×200); 4: merge (×200).

圖1大鼠PASMCs原代培養(yǎng)及其免疫熒光鑒定結(jié)果

2EGLN1 siRNA靶點(diǎn)篩選

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，EGLN1的3個(gè)靶點(diǎn)經(jīng)干擾沉默后， 靶點(diǎn)2、3干擾沉默后EGLN1蛋白表達(dá)均明顯受到抑制(P<0.05)，其中干擾靶點(diǎn)3的效果最好，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The expression of EGLN1 was interfered by the various interference targets determined by Western blot. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs interference control.

圖2Western blot檢測(cè)各干擾靶點(diǎn)EGLN1的表達(dá)量

3低氧后檢測(cè)干擾效果

低氧分組培養(yǎng)72 h后，常氧下和低氧下的siEGLN1組都有較好的干擾效果(P<0.05)。常氧下陰性對(duì)照組EGLN1的表達(dá)較與低氧下陰性對(duì)照組低(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

Figure 3.The protein expression of EGLN1 under the condition of normoxia or hypoxia for 72 h determined by Western blot. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs normoxia control;*P<0.05 vs hypoxia control.

圖3Western blot檢測(cè)分組培養(yǎng)72 h后的EGLN1干擾效果

4Western blot法檢測(cè)VEGF蛋白的表達(dá)水平

當(dāng)?shù)脱跖囵B(yǎng)48 h和72 h時(shí)，無(wú)論對(duì)照組還是干擾組與常氧下相比，VEGF的表達(dá)均有所升高。常氧干擾組和低氧干擾組VEGF的表達(dá)與相應(yīng)的對(duì)照組均有所減少。各組的VEGF表達(dá)均隨培養(yǎng)時(shí)間有所增加，但常氧組增加并不明顯，僅少數(shù)組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而低氧組VEGF增加更明顯，見(jiàn)圖4、表1。

Figure 4.Western blot determined the protein expression of VEGF.

圖4Western blot法檢測(cè)VEGF蛋白的表達(dá)水平

其中，我們?cè)诜謩e培養(yǎng)72 h后檢測(cè)各組EGLN1和VEGF的蛋白表達(dá)， 由圖5可見(jiàn)，低氧下各組EGLN1與VEGF的表達(dá)較常氧下表達(dá)均有所增加，2個(gè)干擾組的EGLN1受到抑制時(shí)，各干擾組相對(duì)其對(duì)照組的VEGF表達(dá)均降低。

Figure 5.Western blot determined the protein expression of EGLN1 and VEGF.

圖5Western blot檢測(cè)培養(yǎng)72 h后各組EGLN1和VEGF的蛋白表達(dá)

表1　各組VEGF/GAPDH相對(duì)表達(dá)量的比較

*P<0.05 vs negative control;#P<0.05 vs normoxia group;△P<0.05 vs 24 h group;◆P<0.05 vs 48 h group.

5CCK-8法檢測(cè)EGLN1對(duì)低氧下PASMCs細(xì)胞活力的影響

CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力情況，結(jié)果顯示出各組的吸光度值均隨時(shí)間增強(qiáng)，其中低氧對(duì)照組增強(qiáng)最明顯，低氧干擾組和常氧對(duì)照組次之，常氧干擾組最弱。由表2可知，因?yàn)榭瞻捉M除培養(yǎng)基外并無(wú)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，空白組在低氧與常氧下無(wú)差異。各組在0 h時(shí)吸光度無(wú)差異。無(wú)論在常氧或低氧情況下，對(duì)照組和空白組與干擾組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。在常氧和低氧情況下，干擾組的細(xì)胞活力與對(duì)照組相比均減弱(P<0.05)。對(duì)照組和干擾組在低氧培養(yǎng)下細(xì)胞活力與常氧組比均有所增強(qiáng)(P<0.05)。

表2　CCK-8法測(cè)量不同分組下PASMCs細(xì)胞活力情況

△P<0.05 vs 0 h group;*P<0.05 vs 24 h group;#P<0.05 vs 48 h group;◆P<0.05 vs normoxia group;▲P<0.05 vs control group.

討論

低氧性肺血管重建是HPH的主要病理變化，包括肌型動(dòng)脈中膜平滑肌增殖肥大、非肌型動(dòng)脈肌化內(nèi)膜增厚以及外膜成纖維細(xì)胞增殖，其中位于血管壁中膜的PASMCs在增殖中起主要作用，是導(dǎo)致HPH的重要環(huán)節(jié)，而細(xì)胞活力的變化能從側(cè)面說(shuō)明細(xì)胞增殖情況。對(duì)于低氧性HPH研究顯示，低氧促進(jìn)了PASMCs的異常增殖，PASMCs低氧性增殖在肺血管重建中起重要作用[5]，這與本研究的研究結(jié)果相符。EGLN1(PHD2)是在人體內(nèi)普遍存在的Fe2+和2-同戊二酸依賴的加氧酶超家族成員, 對(duì)HIF-1α的調(diào)節(jié)起關(guān)鍵作用, 是HIF-1α降解反應(yīng)的限速酶[6-8]。近年來(lái)的研究表明,發(fā)現(xiàn)EGLN1與藏族的高原適應(yīng)性有關(guān)。其中，EGLN1 基因在高海拔低氧環(huán)境適應(yīng)的人群中存在很強(qiáng)的正選擇, 它是歐亞(包括藏族)和安第斯人群共同的與高海拔低氧環(huán)境適應(yīng)相關(guān)的基因[9-11]。VEGF是HIF-1α介導(dǎo)的下游轉(zhuǎn)錄基因，而VEGF與肺血管通透性、血管生成以及血管結(jié)構(gòu)重構(gòu)密切相關(guān)。因此，本研究用轉(zhuǎn)染法將外源siRNA摻入到肺平滑肌細(xì)胞而獲得新的遺傳標(biāo)志的過(guò)程來(lái)構(gòu)建EGLN1干擾模型。在經(jīng)過(guò)體外轉(zhuǎn)染PASMCs并做篩選后，選定轉(zhuǎn)染效率最好的靶點(diǎn)3，采用Western blot實(shí)驗(yàn)來(lái)檢查轉(zhuǎn)染結(jié)果，結(jié)果顯示干擾后的EGLN1表達(dá)顯著降低，說(shuō)明轉(zhuǎn)染模型構(gòu)建成功。低氧下，EGLN1的表達(dá)量增加，VEGF表達(dá)增高，PASMCs活力較常氧下有明顯增高，并具有時(shí)間依賴性，這與羅穎等[12]的研究結(jié)果一致。而EGLN1siRNA作用后，EGLN1的表達(dá)受到抑制的同時(shí)，VEGF的表達(dá)相比未干擾組有所下降，這與Fisher等[13]的研究結(jié)果一致。此外，研究結(jié)果也顯示EGLN1對(duì)PASMCs活力可能具有一定的增強(qiáng)作用，低氧下PASMCs細(xì)胞活力較常氧下增加。當(dāng)EGLN1受到抑制時(shí)，VEGF的表達(dá)和細(xì)胞活力變化均受抑制。EGLN1能夠促進(jìn)對(duì)機(jī)體PASMCs活力增強(qiáng)及肺血管重建，但該基因的過(guò)度表達(dá)對(duì)非低氧適應(yīng)性動(dòng)物并不起保護(hù)作用。而也有研究顯示PHD-2敲除后增加細(xì)胞HIF-1α水平和導(dǎo)致增加VEGF等下游血管生成因子的轉(zhuǎn)錄[14]。因此，低氧下，EGLN1是如何調(diào)控VEGF的表達(dá)來(lái)影響肺平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)的尚需要進(jìn)一步證明。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

Effects of EGLN1 siRNA on growth of rat pulmonary artery smooth muscle cells under hypoxic condition

SUN Li, GA Qin, YANG Quan-yu, JIN Guo-en

(ResearchCenterofHigh-AltitudeMedicine,QinghaiUniversity,Xining810001,China.E-mail:jmcy2005_teacher@aliyun.com)

[ABSTRACT]AIM: To observe whether EGLN1 gene is involved in the growth of pulmonary arterial smooth muscle cells (PASMCs) during hypoxia when EGLN1 gene expression was interference by siRNA. METHODS: The rat primary pulmonary arterial smooth muscle cells were cultured, and the specific lipidosome of EGLN1 siRNA was constructed and transfected into the PASMCs. The transfected PASMCs were cultured under hypoxia or normoxia conditions, respectively. The viability of the PASMCs was detected by CCK-8 assay. The protein expression of EGLN1 and vascular endothelial growth factor (VEGF) was determined by Western blot. RESULTS: The viability of the PASMCs was increased and the protein expression of VEGF was up-regulated in the PASMCs under hypoxic condition in a time-dependent manner. In hypoxia or normoxia condition, the viability and VEGF protein expression of the PASMCs were suppressed by EGLN1 siRNA. CONCLUSION: EGLN1 gene may involve in the growth of rat PASMCs by regulating VEGF protein level under hypoxic condition.

[KEY WORDS]Hypoxia; EGLN1 gene; Rat pulmonary arterial smooth muscle cells; Cell viability

[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)05- 0787- 05

[收稿日期]2015- 07- 27[修回日期] 2016- 03- 11

*[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81160243)； 人社部留學(xué)人員科技活動(dòng)項(xiàng)目([2011]518號(hào)); 青海省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室發(fā)展專項(xiàng)(No. 2014-Z-Y-30)

通訊作者△Tel: 0971-8172252； E-mail: jmcy2005_teacher@aliyun.com

[中圖分類號(hào)]R332； R363.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.05.003

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