劉　峰，　張　佳，　許　迪，　項宗勤，　徐　穎

(暨南大學(xué)粵港澳中樞神經(jīng)再生研究院，廣東 廣州 510632)

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rd1小鼠視網(wǎng)膜退變中期節(jié)細(xì)胞功能的變化*

劉峰，張佳，許迪，項宗勤，徐穎△

(暨南大學(xué)粵港澳中樞神經(jīng)再生研究院，廣東 廣州 510632)

[摘要]目的： 探討視網(wǎng)膜色素變性模型rd1小鼠視網(wǎng)膜退變中期各類視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells, RGCs)功能的變化情況。方法: 運用多電極陣列(multi-electrode arrays,MEA)記錄方法，記錄視網(wǎng)膜退變中期(出生后20 d，P20)的rd1小鼠或正常對照小鼠視網(wǎng)膜中多個節(jié)細(xì)胞動作電位的發(fā)放,并比較自發(fā)發(fā)放和光反應(yīng)特征等指標(biāo)，評價幸存的節(jié)細(xì)胞功能變化。另外，采用免疫組化染色方法驗證視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的退化情況。結(jié)果: 免疫組化的結(jié)果表明rd1小鼠視網(wǎng)膜感光層的厚度顯著低于正常小鼠。根據(jù)節(jié)細(xì)胞光反應(yīng)特性的不同，可以將其分成6類：ON sustained、ON transient、ON-OFF sustained、ON-OFF transient、OFF sustained和OFF transient RGCs，但OFF sustained RGCs所占比重極小(1.0%～3.1%)。rd1小鼠視網(wǎng)膜中保持光反應(yīng)的節(jié)細(xì)胞比例顯著低于正常小鼠。rd1小鼠節(jié)細(xì)胞的自發(fā)發(fā)放顯著高于正常小鼠,而不同類型的節(jié)細(xì)胞變化情況有所不同。rd1小鼠視網(wǎng)膜各類節(jié)細(xì)胞的光反應(yīng)強度及光敏感度均顯著低于正常小鼠。結(jié)論: 在rd1小鼠退變的中期，視網(wǎng)膜感光層明顯退變；rd1小鼠退變中期的視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞發(fā)生明顯的功能退變，而且不同類型的節(jié)細(xì)胞變化情況有所不同。

[關(guān)鍵詞]多電極陣列； 視網(wǎng)膜色素變性; 視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞； rd1小鼠

視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa, RP)是一種最常見的遺傳性致盲眼病，主要是由編碼視桿細(xì)胞的磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)β亞基突變引起，導(dǎo)致患者的感光細(xì)胞死亡和視野的收縮，最終失明。同樣的突變也存在于rd1小鼠中：在rd1小鼠中，視網(wǎng)膜視桿細(xì)胞磷酸二酯酶Pde6bβ亞基的7號外顯子突變[1]，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)環(huán)鳥苷酸(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)累積，從而在出生后幾周內(nèi)引起大量視桿細(xì)胞的死亡。因此rd1小鼠是一種理想的RP動物模型。研究表明視桿細(xì)胞在rd1小鼠出生后第8天左右開始快速凋亡，緊接著是視錐細(xì)胞，到6周的時候感光細(xì)胞幾乎完全消失[2-3]。視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的死亡導(dǎo)致視網(wǎng)膜外層結(jié)構(gòu)完全消失，但內(nèi)層神經(jīng)元(雙極細(xì)胞、水平細(xì)胞、無長突細(xì)胞、節(jié)細(xì)胞)基本保留完好；許多視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells, RGCs)和與其相連的中央視覺神經(jīng)系統(tǒng)仍然保持部分功能[4],然而感光細(xì)胞的死亡導(dǎo)致視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元的二次重構(gòu)，即神經(jīng)元突起的損失或萌芽、細(xì)胞的遷移和反應(yīng)性膠質(zhì)增生[5-8]，從而直接影響內(nèi)層神經(jīng)元的功能變化。

在視網(wǎng)膜退變的早期，患者很難意識或者檢查到自己患有視網(wǎng)膜色素變性等相關(guān)疾病，故視桿細(xì)胞大量死亡，而視錐細(xì)胞大部分尚存的退變中期將是一個非常重要的治療時期。目前僅有少量文獻(xiàn)簡單報道在rd1小鼠的感光細(xì)胞退變的早期，整體節(jié)細(xì)胞自發(fā)的增加和ON、ON-OFF和OFF 3大類節(jié)細(xì)胞光反應(yīng)的減少[9]；但在rd1小鼠退變的中期，視網(wǎng)膜6類節(jié)細(xì)胞的神經(jīng)電生理的特性尚不清楚。因此，本研究將主要運用多電極記錄系統(tǒng)，記錄rd1小鼠退變的中期視網(wǎng)膜各類節(jié)細(xì)胞的功能的變化，為臨床研究提供更為具體、更為可靠的依據(jù)，為探索新的有效治療方案提供一定的理論基礎(chǔ)。

材料和方法

1動物

SPF級C57BL/6野生型(wild type, WT)小鼠，雌雄不限，出生20天(postnatal 20 days，P20)，由廣東省實驗動物中心提供,許可證號為SCXK(粵)2013-0002。SPF級C3H/HeJ(rd1)小鼠，雌雄不限，P20，由南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院引進(jìn)，許可證號為SCXK(蘇)2015-0001。本研究中使用的所有小鼠均在正常的光照環(huán)境中飼養(yǎng)，即12 h/12 h明暗交替,保證小鼠正常的生理周期。

2主要試劑

艾姆斯試劑(Ames’ Medium)和NaHCO3購自Sigma；DAPI購自Electron Microscopy Sciences；包埋劑(optimal cutting temperature compound，OCT)購自廣州瑞千生物科技有限公司；混合氧氣(95% O2+5%CO2)購自廣州市英萊氣體有限公司。

3主要方法

3.1視網(wǎng)膜的剝離在微弱的紅光中，暗適應(yīng)后的小鼠采用快速頸椎脫臼方法處死并取出眼球，立即轉(zhuǎn)移至通氧的AMES溶液中。剝離出視網(wǎng)膜后，從中心處分為4部分，進(jìn)一步將其修整為邊長為2 mm的正方形，使其與視神經(jīng)乳頭的距離約0.3 mm，從而保證每次記錄的位置是相近的。

3.2多電極陳列(multi-electrodes arrays,MEA)記錄本實驗中所用的多電極陣列(MED64)系統(tǒng)的記錄電極為內(nèi)嵌64個電極通道，每個電極直徑為10 μm，間距為100 μm，并排列成8×8的平面矩陣。將修整好的視網(wǎng)膜用吸管轉(zhuǎn)移至灌有AMES溶液的電極槽內(nèi)，使節(jié)細(xì)胞層朝下緊貼電極陣列；輕輕蓋上錨并平穩(wěn)轉(zhuǎn)移至MEA connector，通AMES灌流液。在記錄的過程中，視網(wǎng)膜需一直浸在AMES溶液中且其周圍溫度為31～33 ℃，保持流速為4.5 mL/min。每片視網(wǎng)膜開始記錄前均需孵育至少30 min，絕大部分實驗在3～6 h內(nèi)均能記錄到穩(wěn)定的動作電位(又稱spike)發(fā)放。

3.3視覺刺激通過MED64主放大器輸出電壓的大小和中性濾光片控制投射到視網(wǎng)膜上的光強的大小，從而得到實驗所需的光刺激強度：1.50×104～3.61×107photons·μm-2·s-1；本實驗中采用的視覺刺激均為全視野閃光刺激，刺激模式為2 s(撤光)+2 s(給光)+6 s(撤光)，每個刺激循環(huán)時間為10 s，共30次。

3.4數(shù)據(jù)分析采用閾值檢測法從原始數(shù)據(jù)中檢測出動作電位，選取基線噪音水平4.5倍的標(biāo)準(zhǔn)差(4.5σ)作為閾值。當(dāng)記錄信號峰值超過閾值時，判斷為有動作電位產(chǎn)生。通常單個電極會記錄到多個RGCs動作電位的發(fā)放，因此需要使用Offline Sorter 軟件(Plexon Inc)將單個電極所記錄到的多個RGCs發(fā)放的信號進(jìn)行分開，即為spike sorting。因為神經(jīng)元有1 ms的不應(yīng)期間隔, 對于分開的單個RGCs，去掉峰電位間隔<1 ms的spikes。另外還需手動移除那些不規(guī)則的spikes，比如2個或者更多spikes在極短時間內(nèi)的累加或者部分重疊。

3.5視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞分類將分開后單個RGCs所發(fā)放的spikes，通過Spike2編程以10 ms的時間窗(bin)做刺激前后反應(yīng)直方圖(peristimulus time histograms，PSTH)，然后統(tǒng)計各個時段spikes發(fā)放的數(shù)目。

3.5.1優(yōu)勢響應(yīng)指標(biāo)(response dominance index，RDI)根據(jù)節(jié)細(xì)胞對給光(ON)、撤光(OFF)的反應(yīng)，可以將節(jié)細(xì)胞分為ON(僅給光時興奮)、OFF(僅撤光時興奮)及ON/OFF(對給光和撤光均反應(yīng))。我們根據(jù)以下公式定量判斷節(jié)細(xì)胞的ON-OFF 反應(yīng)類型[10]：

其中，RON、ROFF分別代表給光和撤光2 s內(nèi)spike平均發(fā)放頻率，減去給光前節(jié)細(xì)胞的自發(fā)頻率。通過RDI值將記錄到的RGCs分成3類：若RDI≥0.6，則此類為ON RGCs；若RDI≤-0.6，則此類為OFF RGCs; RDI介于兩者之間，則為ON-OFF RGCs。

3.5.2響應(yīng)時程指標(biāo)(response time index，RTI)根據(jù)節(jié)細(xì)胞對光反應(yīng)的持續(xù)時間，可以將節(jié)細(xì)胞分為2大類，短暫型(transient) 及持久型(sustained)。根據(jù)以下公式定量判斷節(jié)細(xì)胞的反應(yīng)類型[10]：

其中， Rpeak代表在給光(或撤光)500 ms內(nèi)spike的最大發(fā)放頻率，Rmaintained是給光(或撤光)1 s～2 s內(nèi)spike的平均發(fā)放頻率；因為ON-OFF RGCs在給光和撤光時均會有較強的spikes的發(fā)放，故RTION-OFF為RTION和RTIOFF的平均值。對于ON或OFF RGCs來說，如果RTI值小于5，則表示該類為sustained RGCs；相反，則為transient RGCs。而對于ON-OFF RGCs而言，RTI值的判斷標(biāo)準(zhǔn)為10，即：如果RTI值小于10，則表示該類為sustained RGCs；相反，則為transient RGCs。

3.5.3統(tǒng)計指標(biāo)通過RDI和RTI指標(biāo)，將所記錄到的RGCs分成6類，即：ON transient、ON sustained、ON-OFF transient、ON-OFF sustained、OFF transient和OFF sustained RGCs。判斷RGC是否有光反應(yīng)時，如果給光或撤光引起的最大反應(yīng)強度大于自發(fā)水平3倍的標(biāo)準(zhǔn)差，則認(rèn)為是較好光反應(yīng)的RGCs；相反，則為光反應(yīng)極差或無光反應(yīng)，即無效的RGCs。通過統(tǒng)計每類節(jié)細(xì)胞的自發(fā)、平均光反應(yīng)和最大光反應(yīng)，可以衡量各類RGCs的電生理特性。定義如下：節(jié)細(xì)胞的自發(fā)是給光前2 s內(nèi)平均每秒spikes的發(fā)放數(shù)目；而平均光反應(yīng)和最大光反應(yīng)則分別為給光5 s內(nèi)spikes減去自發(fā)后的平均發(fā)放頻率和最大反應(yīng)頻率。

3.6免疫組化

3.6.1冰凍切片每次MEA記錄后的視網(wǎng)膜片均需要進(jìn)行免疫組化并統(tǒng)計形態(tài)學(xué)上是否有差異。首先將視網(wǎng)膜放入4%的多聚甲醛中，固定30 min；用0.1% PBS洗滌3遍，每遍5 min；然后將固定后的視網(wǎng)膜放入30%蔗糖溶液中脫水，直至沉入EP管底；將視網(wǎng)膜放入已填充OCT的包埋盒中，然后迅速放入-80 ℃冰箱。使用 Leica 切片機切片時，每個視網(wǎng)膜厚度為10 μm；切片完成后，烘片2 h，保存于-20 ℃冰箱。

3.6.2DAPI染色取出切好的玻片，用0.1% PBST洗滌3次，每次5 min；將DAPI加入0.3%PBST中，然后滴加到玻片上，孵育5～10 min后將液體倒去；接著使用熒光封片劑封片。最后，處理好的玻片在Confocal顯微鏡(Zeiss LSM700)下進(jìn)行拍照，并使用Imag J進(jìn)行統(tǒng)計分析。

4統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)表示，組間比較采用兩樣本獨立t檢驗，以P <0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1免疫組化結(jié)果

在rd1小鼠視網(wǎng)膜退變的中期，感光層(outer nuclear layer, ONL)的厚度顯著低于正常小鼠(P<0.01)。同齡正常小鼠視網(wǎng)膜感光層的厚度為(63.50±1.25)μm，有多層感光細(xì)胞，而rd1小鼠感光層的厚度為(3.03±0.07)μm，僅保留了一層細(xì)胞，但二級神經(jīng)元層(inner nuclear layer, INL)和三級神經(jīng)元層(ganglion cell layer, GCL)卻基本保存了下來，見圖1。

Figure 1.Most photoreceptors degenerate in rd1 mice at P20. A: representative photomicrographs of DAPI stained retinal sections (nuclei) from wide type mice and rd1 mice at P20; B: comparison of the thickness of outer nuclei layer where photoreceptors locate. The ONL thickness in rd1 mice is significantly lower than that in C57 mice. ONL: outer nuclear layer; INL: inner nuclear layer; IPL: inner plexiform layer; GCL: ganglion cell layer.Mean±SEM. n=5.**P<0.01 vs C57.

圖1rd1小鼠在P20時大部分視網(wǎng)膜感光細(xì)胞已經(jīng)退變

2MEA記錄與視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的分類

本研究中，我們將邊長為2 mm左右的視網(wǎng)膜平鋪在8×8的MEA電極面上，使節(jié)細(xì)胞緊貼電極，這樣可同時記錄多個視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的活動，并且能夠直接比較視網(wǎng)膜一定區(qū)域內(nèi)相鄰節(jié)細(xì)胞的spikes發(fā)放和光反應(yīng)特性(第64通道紅色標(biāo)記時刻表示給光時間，從圖中可以觀察到很多通道均有較好的光反應(yīng))。為了能夠比較視網(wǎng)膜同一類型的節(jié)細(xì)胞spikes發(fā)放特性，我們根據(jù)它們對光反應(yīng)的不同，將視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞分為6類：ON sustained、ON transient、ON-OFF sustained、ON-OFF transient、OFF sustained和OFF transient RGCs(紅色區(qū)域為給光時間),見圖2。

Figure 2.Multi-electrode array (MEA) recording from the normal mouse retina and classification of retina ganglion cells. A: picture shows a piece of retina mount on the MEA recording system; B: a sample recording of light-evoked spike activities from the retina of a C57 mouse at P20.The red vertical bar in the right bottom grid shows the onset of light stimulus, while other channels exhibit corresponding spiking to the light stimulus; C: typical classification of 6 types of RGCs in wild-type retinas.Light stimulus(2 s) is indicated by red region.

圖2C57小鼠視網(wǎng)膜的多電極陣列記錄及其節(jié)細(xì)胞的分類

3rd1與正常小鼠視網(wǎng)膜中對光反應(yīng)的節(jié)細(xì)胞的百分比及其6類節(jié)細(xì)胞所占百分比的比較

在視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡的中期，大量感光細(xì)胞的死亡，可能使部分節(jié)細(xì)胞的光反應(yīng)消失。因此，我們首先統(tǒng)計有明顯光反應(yīng)的RGCs占總數(shù)的百分比。在rd1小鼠中，我們總共記錄到587個RGCs，但只有410個RGCs有較好光反應(yīng)，所以有光反應(yīng)節(jié)細(xì)胞的百分比為(69.4±3.8)%；而正常野生型小鼠有效比為(96.5±2.3)%，明顯高于rd1小鼠(P<0.01)。因此在視網(wǎng)膜退變中期，rd1小鼠視網(wǎng)膜中保持光反應(yīng)的節(jié)細(xì)胞比例已經(jīng)顯著低于正常小鼠。

接著我們比較了rd1和C57小鼠視網(wǎng)膜6類節(jié)細(xì)胞所占的百分比，這是首次在rd1小鼠視網(wǎng)膜退變模型中根據(jù)功能將節(jié)細(xì)胞分成6類。在正常小鼠中，記錄到的ON RGCs占68.4%，ON-OFF RGCs占24.5%；而在rd1小鼠視網(wǎng)膜中，所記錄到的ON RGCs占48%，ON-OFF RGCs占38.4%;此外,OFF sustained RGCs型細(xì)胞所占比重和數(shù)目極小(rd1 1.0%；C57 3.1%)，故后續(xù)的分析我們將OFF sustained和OFF transient合并為OFF RGCs進(jìn)行統(tǒng)計分析。初步分析6類RGCs顯示：相比正常小鼠，rd1小鼠的ON sustained型比例顯著下降(P<0.05)，而ON-OFF sustained 的比例顯著上升(P<0.01)，提示rd1小鼠在感光細(xì)胞退變過程中，不同類型的節(jié)細(xì)胞的變化情況可能不一致,見圖3。

Figure 3.The percentage of responsive RGCs and six types of RGCs in C57 and rd1 mice at P20. A:percentage of visually responsive RGCs in response to flashes for wild-type and rd1 retinas; B:percentage of 6 classes of RGCs among light responsive cells in C57 and rd1 mice. Mean±SEM.*P<0.05,**P<0.01 vs C57.

圖3rd1與正常小鼠視網(wǎng)膜中對光反應(yīng)的節(jié)細(xì)胞的有效百分比及其6類節(jié)細(xì)胞所占百分比

4視網(wǎng)膜退變中期最大光強下節(jié)細(xì)胞的自發(fā)增強、平均和最大光反應(yīng)強度顯著降低

為了評估視網(wǎng)膜退變中期各類節(jié)細(xì)胞功能的變化情況，我們將在最大光強下(3.61×107photons·μm-2·s-1)所記錄到的RGCs根據(jù)功能分成5類，分別統(tǒng)計各類的自發(fā)發(fā)放、平均光反應(yīng)和最大光反應(yīng)，觀察各類RGCs的變化。

首先我們比較了視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞自發(fā)發(fā)放的變化。當(dāng)統(tǒng)計全部RGCs時， rd1小鼠節(jié)細(xì)胞的自發(fā)發(fā)放顯著高于正常小鼠(P<0.01)。而當(dāng)我們具體觀察每一種類型的節(jié)細(xì)胞時，僅有ON sustained、ON transient和ON-OFF sustained RGCs 3類RGCs的自發(fā)發(fā)放顯著高于正常小鼠(P<0.01)；但ON-OFF transient和OFF RGCs 2類并沒有顯著差異。這是首次報道視網(wǎng)膜退變過程中，小鼠各類節(jié)細(xì)胞自發(fā)發(fā)放的變化有所不同。

隨后我們比較了各類型節(jié)細(xì)胞對光反應(yīng)強度的變化。由于至今仍然沒有很統(tǒng)一的指標(biāo)去統(tǒng)計節(jié)細(xì)胞光反應(yīng)的變化，我們采用了目前最常用的2種方法，即平均反應(yīng)強度(average response)和最大反應(yīng)強度(peak response)。兩種統(tǒng)計指標(biāo)均顯示相似的趨勢：在rd1小鼠退變的中期，視網(wǎng)膜各類節(jié)細(xì)胞的光反應(yīng)強度及幅度都顯著低于正常小鼠,見圖4。

Figure 4.Comparison of spontaneous and light responses between RGCs of rd1 and C57 mice at P20. Light stimulus is a 2 s flash with intensity of 3.6×107photons·μm-2·s-1. A: average spontaneous spiking rate for rd1 RGCs is overall significantly increased than that in C57 RGCs, but is differentially affected among different RGC types.There was significant difference in ON sustained, ON transient and ON-OFF sustained RGCs between normal and degenerated retina, whereas no difference is observed in both ON-OFF transient and OFF RGCs; B: comparison of the average and peak response of all types of RGCs between normal and degenerated retina. For all types of RGCs, the light-induced responses are decreased significantly for both the average and the peak in rd1 retina compared with those in C57 mice. Numbers inside histograms represent number of recorded cells. Mean±SEM.*P<0.05,**P<0.01 vs C57.

圖4最大光強下rd1小鼠與C57小鼠視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的自發(fā)、平均和最大光反應(yīng)強度的比較

5視網(wǎng)膜退變中期節(jié)細(xì)胞的光敏感度顯著降低

最后，我們探討了rd1小鼠視網(wǎng)膜退變的中期，各類節(jié)細(xì)胞的光敏感度的變化情況。如圖5所示，視網(wǎng)膜6類節(jié)細(xì)胞的平均光反應(yīng)和最大光反應(yīng)幅度有著相似的趨勢：在各種能激發(fā)spike發(fā)放的刺激光強下，rd1小鼠所有RGCs的光反應(yīng)幅度顯著低于正常組(P<0.01)。隨著光強的增加，節(jié)細(xì)胞光反應(yīng)幅度均會隨著增加。除了OFF 型節(jié)細(xì)胞，正常小鼠的其它類型節(jié)細(xì)胞在最大光強前已經(jīng)達(dá)到飽和，即已經(jīng)達(dá)到最大反應(yīng)強度。但rd1小鼠視網(wǎng)膜的所有類型節(jié)細(xì)胞的光反應(yīng)并沒有達(dá)到飽和且正處在上升支，說明rd1小鼠節(jié)細(xì)胞需要更高的光強刺激才有可能達(dá)到最大發(fā)放。因此，在rd1小鼠視網(wǎng)膜退變的中期，各類節(jié)細(xì)胞光反應(yīng)的敏感度均顯著低于正常C57小鼠。

討論

1rd1小鼠視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞光反應(yīng)強度及光敏感度減弱、自發(fā)發(fā)放增強

在rd1小鼠退變的中期，視網(wǎng)膜的各類節(jié)細(xì)胞光反應(yīng)強度及光敏感度均顯著低于正常小鼠，而且光反應(yīng)強度并未達(dá)到最大值并正處在上升支，這可能是來自視網(wǎng)膜最外層感光層的信號減少所致，這和形態(tài)學(xué)結(jié)果相一致。在rd1小鼠出生后17 d左右時，僅2%左右的視桿細(xì)胞保存下來，而此時至少還有75%的視錐細(xì)胞保留下來；大部分視錐感光細(xì)胞至第36天才逐漸消失[2]。因此，到視網(wǎng)膜凋亡中期第20天時，尚存的視錐細(xì)胞和少量視桿細(xì)胞，也許可以維持整個視覺通路功能。通過多電極記錄我們發(fā)現(xiàn)約69.4%的節(jié)細(xì)胞保持明顯的光反應(yīng)，表明較少感光細(xì)胞的存留仍然能夠維持較多節(jié)細(xì)胞的光反應(yīng)。一方面可能由于突變過程中神經(jīng)回路的重組，比如雙極細(xì)胞樹突的遷移及其突起的增生，另一方面細(xì)胞級聯(lián)放大系統(tǒng)可以將感光細(xì)胞層的信號進(jìn)行放大輸出[11]，從而使較多的節(jié)細(xì)胞能夠有效地接收殘存感光細(xì)胞的輸入信號。

同時，我們也觀察到節(jié)細(xì)胞有著極度活躍的自發(fā)發(fā)放。rd1小鼠較高的自發(fā)發(fā)放并非是由于組織準(zhǔn)備時視網(wǎng)膜受損致使的敏感度增高或者M(jìn)EA記錄時活性降低所致；因為：第一，這種較高的自發(fā)和光反應(yīng)均能夠穩(wěn)定地持續(xù)3～6 h，表明不受組織活性的影響；第二，在不同的rd1小鼠視網(wǎng)膜中均能觀察到較高的自發(fā)發(fā)放，因此不是個別現(xiàn)象；第三，有文獻(xiàn)報道極度活躍的自發(fā)發(fā)放是來自于視網(wǎng)膜內(nèi)部通路的變化，并且能夠引起上丘神經(jīng)元發(fā)放的增加[12]。超強的自發(fā)也不是由于不同品系小鼠的背景不同造成的，因為在rd1/C57背景的小鼠視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞也觀察到類似的現(xiàn)象[9]。另外，退行性視網(wǎng)膜這種超強的自發(fā)在其它幾種小鼠品系中均有報道，包括rd10[13]、P23H-1大鼠[14]和RCS大鼠[15]。這種視網(wǎng)膜退行性疾病模型的自發(fā)目前被認(rèn)為是來自于AII無長突細(xì)胞[16-17]，并且通過AII無長突細(xì)胞和其它細(xì)胞類型(比如ON-Cone雙極細(xì)胞)耦合的縫隙連接向視網(wǎng)膜網(wǎng)絡(luò)傳播[16,18]。視網(wǎng)膜退變過程中自發(fā)發(fā)放的增強將干擾正常信號的傳導(dǎo)，因此如何有效抑制自發(fā)發(fā)放成為臨床治療視網(wǎng)膜退變的一個重要考慮因素。

Log light intensity (photons·μm-2·s-1)

Figure 5.Average (left) and peak (right) light intensity response curves of all RGCs types from C57 and rd1 mice.The average and peak response of light-evoked spikes increase with the increase of light intensity. By the maximum light intensity, the light-evoked response in C57 RGCs saturate, while the response of rd1 retinas is still rising. The average and peak responses in rd1 RGCs are both significantly lower than those of C57 RGCs.Numbers in each graph indicate number of cells recorded. Mean±SEM.*P<0.05,**P<0.01 vs C57.

圖5視網(wǎng)膜五類節(jié)細(xì)胞的平均和最大光強響應(yīng)曲線

2視網(wǎng)膜退變中期不同類型節(jié)細(xì)胞功能的變化

在視網(wǎng)膜退變的中期，各類節(jié)細(xì)胞占具有光反應(yīng)的節(jié)細(xì)胞總數(shù)的百分比與正常小鼠相比有所不同。rd1小鼠ON sustained RGCs的比例顯著低于正常C57小鼠，而ON-OFF sustained RGCs的比例卻顯著高于正常小鼠，其它類型的RGCs卻沒有顯著變化。同時，各類節(jié)細(xì)胞的自發(fā)變化也是不同的。rd1小鼠視網(wǎng)膜ON sustained、ON transient和ON-OFF sustained RGCs 3類RGCs的自發(fā)發(fā)放要顯著高于正常小鼠；但ON-OFF transient和OFF RGCs兩類并沒有顯著變化。因此，我們首次發(fā)現(xiàn)了視網(wǎng)膜退變過程中，不同類型節(jié)細(xì)胞的自發(fā)變化有所不同。然而，不同類型節(jié)細(xì)胞的光反應(yīng)強度和光敏感度的影響卻是一致的，均顯著低于正常C57小鼠。以上的差異可能與內(nèi)層神經(jīng)元谷氨酸受體表達(dá)不同[19]和不同類型節(jié)細(xì)胞接受的信號輸入不同有關(guān)。比如大量ON型節(jié)細(xì)胞接受視桿系統(tǒng)的輸入，而中期視桿細(xì)胞大量凋亡，信號中斷，大量的視桿雙極細(xì)胞轉(zhuǎn)而與殘存的視桿及視錐細(xì)胞建立聯(lián)系，產(chǎn)生異常突觸連接[20-21]，從而導(dǎo)致下游的信號變化。

3視網(wǎng)膜退行性疾病的治療

300人中大約有1人是患有全盲或半盲的視網(wǎng)膜退行性疾病，比如色素性視網(wǎng)膜炎、年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration,AMD)、糖尿病視網(wǎng)膜病變等。在這些疾病中，感光細(xì)胞變性凋亡，導(dǎo)致患者失明，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，從而帶來巨大的社會、經(jīng)濟問題。目前，有兩類可能的治療方法：其中一個主要是針對于非常早期的疾病狀態(tài)，目的是運用藥物療法[22]和基因替代療法[23]去減緩或者停止光感光器的退變進(jìn)程；另外一個治療方案是在光感受器完全消失后采取一些治療手段從而恢復(fù)視覺，這些治療方法包括干細(xì)胞療法[24]、電子假體[25]和光遺傳學(xué)法[26-27]等。不管采用哪種治療手段，一個理想的治療視網(wǎng)膜退行性疾病的方案應(yīng)該滿足以下要求：(1)恢復(fù)視網(wǎng)膜的光敏感度；(2)在周圍環(huán)境的光強下應(yīng)該有較好的功能；(3)與殘存視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元有較好的生理兼容性；(4)保護視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞固有的觸發(fā)特性；(5)沒有毒性和免疫原性的副作用；(6)所有的治療應(yīng)該是微創(chuàng)并且由安全的臨床技術(shù)來完成[28]。而且這些治療方案都要求在治療階段視網(wǎng)膜下游神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能是完整的。如果節(jié)細(xì)胞喪失了對上級神經(jīng)元信號刺激的興奮性反應(yīng)或喪失了往下級神經(jīng)元傳遞興奮性的功能，即使在治療中成功誘導(dǎo)退變感光細(xì)胞、雙極細(xì)胞或節(jié)細(xì)胞直接對光產(chǎn)生反應(yīng)，也無法將信息傳遞到大腦產(chǎn)生視覺。因此了解感光細(xì)胞退變過程中節(jié)細(xì)胞功能變化，對于尋找治療視網(wǎng)膜退行性疾病的有效治療窗口有重要的意義。本研究詳細(xì)闡述了在視網(wǎng)膜退變中期各類節(jié)細(xì)胞功能的變化，將在一定程度上為臨床上尋找有效的防治時間、作用靶點提供重要的參數(shù)。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 余小慧)

Functional changes of retinal ganglion cells in rd1 mice during midterm of retinal pigmentosa

LIU Feng, ZHANG Jia, XU Di, XIANG Zong-qin, XU Ying

(GHMInstituteofCNSRegeneration,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:xuying@jnu.edu.cn)

[ABSTRACT]AIM: To investigate how the function of retinal ganglion cells (RGCs) change in the midterm of retinal pigmentosa (RP) in rd1 mice (a transgenic animal model of RP). METHODS: The action potentials from multiple RGCs in rd1 mice at postnatal 20 d (P20) or normal C57 mice (control) were simultaneously recorded by multi-electrode array recording. The functional changes of surviving ganglion cells were evaluated by comparing spontaneous and light-evoked activities of RGCs between rd1 and control mice. The extent of photoreceptor degeneration was verified by immunohistochemical staining. RESULTS: Immunohistochemistry results showed the thickness of the retinal photoreceptor layer of rd1 mice was significantly lower than that in normal mice at P20. According to the light response properties, we classified ganglion cells into 6 subgroups: ON sustained, ON transient, ON-OFF sustained, ON-OFF transient, OFF sustained and OFF transient RGCs, with a very tiny percentage of OFF sustained RGCs (1.0%～3.1%). The percentage of RGCs remaining light responsive in rd1 mice was significantly lower than that in C57 mice. The average spontaneous spiking rate for rd1 RGCs was overall significantly increased compared to that in C57 cells, whereas different RGC types had different changes. The light-induced responses and light sensitivities of all types of RGCs in rd1 mice were both significantly lower than those in C57 mice. CONCLUSION: The photoreceptors of rd1 mice are severely degenerated in the midterm of retinal degeneration. The functions of RGCs in rd1 mice in the midterm of degeneration decay obviously, with variance in different RGCs types.

[KEY WORDS]Multi-electrode arrays; Retinal pigmentosa; Retinal ganglion cells; rd1 mice

[文章編號]1000- 4718(2016)05- 0811- 08

[收稿日期]2016- 02- 17[修回日期] 2016- 03- 29

*[基金項目]國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81470656)

通訊作者△Tel: 020-85227086; E-mail: xuying@jnu.edu.cn

[中圖分類號]R774; R363

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.05.007

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