向國安，　蘇程程，　張譯丹，　馬永強(qiáng)，　周　欣，　魏路清，　姬文婕

(1中國人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸與重癥醫(yī)學(xué)科，天津 300162； 2中國人民武裝警察部隊(duì)福建總隊(duì)醫(yī)院，福建 福州 350000；3中國人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院附屬醫(yī)院心臟中心，心血管病研究所，天津 300162)

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螺內(nèi)酯對實(shí)驗(yàn)性矽肺小鼠的干預(yù)研究*

向國安1▲，蘇程程1▲，張譯丹2，馬永強(qiáng)3，周欣3，魏路清1△，姬文婕1△

(1中國人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸與重癥醫(yī)學(xué)科，天津 300162；2中國人民武裝警察部隊(duì)福建總隊(duì)醫(yī)院，福建 福州 350000；3中國人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院附屬醫(yī)院心臟中心，心血管病研究所，天津 300162)

[摘要]目的： 探討螺內(nèi)酯(spirolactone，SPI)在實(shí)驗(yàn)性小鼠矽肺病理進(jìn)展中的作用及機(jī)制。方法: 將120只雄性C57 BL/6小鼠(18～20 g)隨機(jī)分為生理鹽水組(NS組)、石英組(quartz組)、石英+生理鹽水組(quartz+NS組)和石英+螺內(nèi)酯組(quartz+SPI組)，經(jīng)口咽吸入石英混懸液建立實(shí)驗(yàn)性小鼠矽肺模型；quartz+SPI組及quartz+NS組每天分別經(jīng)灌胃給予螺內(nèi)酯10 mg/kg或等體積的生理鹽水。術(shù)后3 d、14 d和28 d處死小鼠，行常規(guī)支氣管肺泡灌洗術(shù)，回收支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)進(jìn)行細(xì)胞分類和計(jì)數(shù)；采用ELISA法檢測BALF上清中轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)的含量；采用HE染色、Masson染色和免疫熒光染色觀察肺組織病理學(xué)變化及纖維化程度；采用RT-qPCR檢測各組肺組織中膠原I(Col I)、膠原III(Col III)及TGF-β1的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果: 經(jīng)口咽吸入石英后，小鼠肺組織經(jīng)歷了典型的急性炎癥期和纖維化期改變，給予SPI干預(yù)后的小鼠肺組織炎癥反應(yīng)程度相比于quartz+NS組減輕(P<0.05)。給予螺內(nèi)酯干預(yù)后，在第3天小鼠肺組織TGF-β1 的mRNA表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.01)，BALF中TGF-β1的含量也顯著減少(P<0.01)。到第28天，quartz+SPI組小鼠肺組織Col I、Col III的mRNA表達(dá)量明顯低于quartz+NS組(P<0.05)。結(jié)論: SPI可能通過調(diào)控TGF-β1的mRNA表達(dá)，減少TGF-β1蛋白的分泌，從而改善石英導(dǎo)致的早期急性炎癥反應(yīng)，并在纖維化期減輕了Col I和Col III的mRNA表達(dá)，抑制了纖維化的進(jìn)展。

[關(guān)鍵詞]石英； 肺纖維化； 螺內(nèi)酯； 轉(zhuǎn)化生長因子β1

矽肺是由于長期吸入大量游離石英粉塵所引起，以肺部廣泛性結(jié)節(jié)性肺纖維化為主要特征的疾病。矽肺病理發(fā)展呈不可逆性，脫離暴露因素后患者肺功能仍進(jìn)行性惡化，目前尚無有效治愈方法[1-3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)不僅參與內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，還在肺組織炎癥、修復(fù)和纖維化過程中起到重要作用。作為典型的胞核甾體類激素受體，鹽皮質(zhì)激素受體(mineralocorticoid receptor，MR)在多個靶器官系統(tǒng)的促炎癥和促纖維化作用越來越被重視，螺內(nèi)酯(spirolactone，SPI)是公認(rèn)的MR拮抗劑。選擇性敲除單核巨噬細(xì)胞系MR，能夠減輕慢性鹽皮質(zhì)激素導(dǎo)致的心肌纖維化[4]。本研究采用實(shí)驗(yàn)性小鼠矽肺模型， 探討MR拮抗劑SPI對石英誘導(dǎo)小鼠肺纖維化的影響，并明確其對實(shí)驗(yàn)性矽肺肺損傷炎癥反應(yīng)及纖維化的作用及分子機(jī)制。

材料和方法

1動物

SPF級雄性C57BL/6小鼠，18～20 g，購自解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號為SCXK-(軍)2012-0004。實(shí)驗(yàn)前小鼠均適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。飼養(yǎng)環(huán)境實(shí)施12 h/12 h明暗周期，保持恒定通風(fēng)、溫度和濕度。

2主要試劑

游離石英粉塵和螺內(nèi)酯(Sigma)；TRIzol Reagent (Invitrogen)；MMLV反轉(zhuǎn)錄酶和dNTPs(Promega)；SYBR Green 實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(Roche)；轉(zhuǎn)化生長因了β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；其余國產(chǎn)試劑均為分析純。所用引物由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司根據(jù)設(shè)計(jì)合成。

3主要方法

3.1小鼠矽肺模型的制備、標(biāo)本的采集與處理120只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為生理鹽水組(NS組)、石英組(quartz組)、石英+生理鹽水組(quartz+NS組)和石英+螺內(nèi)酯組(quartz+SPI組)，經(jīng)2%異氟烷麻醉后，采取經(jīng)口咽吸入法建立實(shí)驗(yàn)性矽肺模型，quartz組按100 mg/kg劑量給予石英混懸液40 μL，待小鼠完全吸入并蘇醒后常規(guī)飼養(yǎng)；NS組吸入同等體積的無菌生理鹽水；模型制備完成后quartz+SPI組和quartz+NS組還需分別按每日10 mg/kg的劑量經(jīng)灌胃給予SPI或等體積的無菌生理鹽水。在術(shù)后第3天、14天、28天麻醉后處死小鼠，血漿分裝保存于-80 ℃?zhèn)溆?。每個時(shí)點(diǎn)每組取5只小鼠行經(jīng)支氣管肺泡灌洗術(shù)，回收支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類，上清分裝后置于-80 ℃保存。未灌洗的小鼠左肺用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，右肺凍存于液氮中用于提取RNA。

3.2病理學(xué)分析小鼠肺組織經(jīng)固定、石蠟包埋、連續(xù)切片(3 μm～5 μm)后，采用HE染色觀察炎癥反應(yīng)，用炎癥評分(inflammation score，IS)代表炎癥反應(yīng)程度；采用Masson染色及α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)免疫熒光檢測膠原纖維含量，用膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)代表纖維化程度。

3.3BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類BALF回收后經(jīng)4 ℃、3 000 r/min離心15 min，用D-Hanks液重懸細(xì)胞團(tuán)，采用Countstar自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，甩片后經(jīng)4 ℃無水乙醇固定30 min、HE染色，普通光學(xué)顯微鏡下連續(xù)計(jì)數(shù)200個細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的比例。上清分裝保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

3.4ELISA檢測BALF上清中TGF-β1的含量嚴(yán)格按照TGF-β1 ELISA試劑盒操作說明進(jìn)行BALF上清中TGF-β1含量的檢測及建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。簡述步驟如下，每個待測樣品渦旋混勻后取100 μL進(jìn)行檢測，采用酶標(biāo)儀分別在450 nm 和630 nm處測吸光度(A)值，最終使用兩種A值之差(A492-A630)進(jìn)行分析。

3.5RT-qPCR檢測肺組織中mRNA的表達(dá)水平采用Trizol Reagent試劑盒分離純化第3天和第28天各組肺組織的總RNA，分光光度法測定計(jì)算提取的總RNA含量及濃度。參照OneStep Real-Time PCR試劑盒推薦的標(biāo)準(zhǔn)操作步驟，在ABI 7300熒光定量PCR儀上進(jìn)行RT-qPCR，內(nèi)參照使用β-actin，擴(kuò)增條件為95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,40個循環(huán)。根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫中目的基因cDNA 序列，使用Primer Premier 6.0 軟件設(shè)計(jì)特異性引物，由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司合成(表1)，使用2-ΔΔCt法對RT-qPCR結(jié)果進(jìn)行分析。

表1　引物序列

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用STATA 14.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用單因素方差分析和SNK法兩兩比較。不滿足正態(tài)性或方差齊性，以中位數(shù)、四分位間距描述原始數(shù)據(jù)，并采用非參數(shù)秩和Mann-Whitney檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1小鼠肺組織病理學(xué)變化

普通光學(xué)顯微鏡下可見NS組肺組織結(jié)構(gòu)基本正常，未見明顯的炎癥細(xì)胞浸潤和膠原纖維沉積。與NS組相比，quartz組及quartz+NS組的小鼠在第3天可見肺組織有大量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡間隔水腫增厚，可見部分肺泡腔陷閉，IS明顯高于NS組(P<0.01)，給予鹽皮質(zhì)激素受體拮抗劑SPI干預(yù)的quartz+SPI組炎性細(xì)胞浸潤及肺泡腔增厚與quartz組及quartz+NS組相比較輕，肺泡結(jié)構(gòu)相對完整，IS低于quartz+NS組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。隨著時(shí)間的進(jìn)展， Masson染色和α-SMA免疫熒光染色結(jié)果顯示， quartz組和quartz+NS組肺組織在第28天均出現(xiàn)成纖維細(xì)胞增殖、膠原沉積，并可觀察到纖維結(jié)節(jié)及大量致密藍(lán)染膠原纖維或大量α-SMA陽性區(qū)域，該2組的CVF值均顯著高于NS組(P<0.01)；與quartz+NS組比，給予鹽皮質(zhì)激素受體拮抗劑SPI干預(yù)的quartz+SPI組肺部病變減輕，CVF顯著低于quartz+NS組(P<0.01)，見圖1、2。

Figure 1.Spironolactone reduced quartz-induced alveolitis (A), and the synthesis and secretion of TGF-β1 (B) were down-regulated. Mean±SD. n=5.**P<0.01 vs NS group;#P<0.05,# #P<0.01 vs quartz+NS group.

圖1螺內(nèi)酯減輕了石英誘導(dǎo)的肺泡炎癥，下調(diào)了TGF-β1的合成與分泌

Figure 2.Spironolactone attenuated quartz-induced pulmonary fibrosis. A: Masson’s trichrome staining and the immunofluorescent staining of α-SMA (FITC-labeled, green; nuclei were counterstained by DAPI); B: the mRNA expression of Col I and Col III in the lung tissues on day 28 after quartz challenged. Mean±SD. n=5.**P<0.01vsNS group;##P<0.01vsquartz+NS group.

圖2螺內(nèi)酯減輕石英誘導(dǎo)的肺纖維化

2BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類比較

與NS組相比，quartz和quartz+NS組小鼠BALF細(xì)胞總數(shù)在第3、14天均明顯升高。而quartz+SPI組小鼠BALF細(xì)胞總數(shù)明顯低于quartz+NS組，并且中性粒細(xì)胞數(shù)變化也呈相同趨勢。在急性炎癥期(第3天)，quartz+SPI組小鼠BALF的巨噬細(xì)胞數(shù)略低于quartz+NS組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；第14天，quartz+NS組的巨噬細(xì)胞數(shù)明顯增高，而給予SPI干預(yù)的小鼠巨噬細(xì)胞數(shù)明顯少于quartz+NS組(P<0.05)，見表2。由此推測，SPI可減輕急性期和纖維化期肺泡炎性細(xì)胞浸潤。

表2　3 d和14 d各組肺泡灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)分類結(jié)果的比較

**P<0.01 vs NS group;#P<0.05,##P<0.01 vs quartz+NS group.

3SPI下調(diào)TGF-β1的mRNA表達(dá)水平及蛋白合成

染塵后第3天，與NS組相比較，quartz 組及quartz +NS組小鼠肺BALF上清中的TGF-β1 含量及肺組織中TGF-β1的mRNA表達(dá)水平均呈一致性升高(P<0.05)；而經(jīng)灌胃給予SPI的quartz+SPI組小鼠肺BALF上清中的TGF-β1 含量及肺組織中TGF-β1 的mRNA表達(dá)水平相對于quartz +NS組明顯降低(P<0.05)，見圖1。

4小鼠肺組織中Col I和Col III的mRNA表達(dá)

造模后第28天quartz小鼠肺組織Col I和Col III的mRNA表達(dá)量較NS組明顯升高，然而，quartz+SPI組小鼠肺組織Col I和Col III的mRNA表達(dá)量均低于quartz+NS組(P<0.05)，由此看出，給予SPI干預(yù)可以抑制石英刺激后小鼠肺組織Col I和Col III的mRNA的表達(dá)升高，見圖2。

討論

近年來研究報(bào)道顯示，RAAS活性增高在慢性心血管和其它疾病的炎癥和重塑病理學(xué)機(jī)制中起了很重要的作用，同時(shí)也是肺損傷的發(fā)病機(jī)制中重要因素之一[5-6]。作為RAAS的效應(yīng)環(huán)節(jié)，醛固酮涉及到多類纖維化相關(guān)的慢性炎癥疾病的發(fā)病機(jī)制[7-8]。目前巨噬細(xì)胞MR在石英誘發(fā)的急性肺損傷和肺纖維化中的作用尚不明確。

TGF-β1是公認(rèn)的促進(jìn)纖維化形成和發(fā)展的關(guān)鍵性細(xì)胞活性物質(zhì)，其在肺纖維化中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。大量研究表明TGF-β1通過促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖、聚集以及轉(zhuǎn)換為成肌纖維細(xì)胞表型，從而參與了細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的沉積，這是肺纖維化的形成的重要機(jī)制之一。Neveu等[9]的新近研究表明，TGF-β1可通過修飾肺成纖維細(xì)胞中胸腺細(xì)胞分化抗原1(Thy-1)的表達(dá)，加重特發(fā)性肺纖維化的程度。TGF-β1還可通過促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞產(chǎn)生ROS，進(jìn)而導(dǎo)致JNK的激活以及Col I、Col III的合成[10]。另有研究表明，游離石英粉塵在大鼠矽肺模型中通過刺激肺組織可引起大鼠血清中含量的增加，且表明TGF-β1合成與分泌在炎癥期和纖維化期起了重要作用[11]。阻斷MR能夠減輕博來霉素誘發(fā)的纖維化的現(xiàn)象已經(jīng)被廣泛認(rèn)可[12-14]，我們實(shí)驗(yàn)室的前期研究也證明了SPI減輕博來霉素誘發(fā)的肺纖維化可能是通過影響MCP-1 和TGF-β1的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的[15]。SPI作為一種利尿藥物，在臨床已廣泛使用，我們由此受到啟發(fā)去進(jìn)一步探索SPI在治療游離石英粉塵誘導(dǎo)的肺纖維化中作用。

在本研究中，采用經(jīng)口咽吸入游離石英粉塵建立小鼠實(shí)驗(yàn)性矽肺模型，灌胃給予SPI干預(yù)實(shí)驗(yàn)性矽肺小鼠。通過研究我們發(fā)現(xiàn)，經(jīng)SPI干預(yù)后實(shí)驗(yàn)性矽肺小鼠急性肺組織炎癥反應(yīng)和肺組織膠原纖維的沉積都得到了緩解，肺纖維化的病理進(jìn)展得到了抑制，同時(shí)，小鼠肺組織中TGF-β1mRNA和蛋白的表達(dá)水平也都下調(diào)。這與本實(shí)驗(yàn)室前期研究中發(fā)現(xiàn)SPI能減輕博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化的結(jié)果是相一致的。肺巨噬細(xì)胞是石英顆粒作用的主要靶細(xì)胞，IFN-γ和TNF-α或LPS可誘導(dǎo)產(chǎn)生M1型巨噬細(xì)胞，隨之釋放大量ROS、NO及促炎細(xì)胞因子，引起過度的炎癥反應(yīng)與組織損傷，最終激發(fā)了纖維化；而M2型巨噬細(xì)胞則分泌大量抗炎因子如IL-4、IL-10和IL-13，主要有下調(diào)炎癥反應(yīng)與啟動損傷修復(fù)的作用，并在控制細(xì)胞增殖、膠原沉積和組織修復(fù)中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用[16]。同時(shí)，有報(bào)道顯示石英可通過上調(diào)肺泡巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá), 增加膠原合成而參與矽肺纖維化的發(fā)展[17]。我們接下來擬通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探討巨噬細(xì)胞表型偏移在通過阻斷MR抑制石英誘導(dǎo)的纖維化進(jìn)展中的作用及其作為潛在肺纖維化預(yù)防和治療靶點(diǎn)的可能性。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Effect of spirolactone on mouse model of experimental silicosis

XIANG Guo-an1, SU Cheng-cheng1, ZHANG Yi-dan2, MA Yong-qiang3, ZHOU Xin3, WEI Lu-qing1, JI Wen-jie1

(1DepartmentofRespiratoryMedicineandIntensiveCareUnit,HospitalAffiliatedtoLogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForces,Tianjin300162,China；2FujianPeople’sArmedPoliceCorpsHospital,Fuzhou350000,China;3CardiacCenter,InstituteofCardiovascularDiseases,HospitalAffiliatedtoLogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForces,Tianjin300162,China.E-mail:ji_wenjie@hotmail.com;wei-luqing@hotmail.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the role of spirolactone (SPI) in the progression of quartz-induced experimental silicosis mouse model. METHODS: Male C57BL/6 mice (n=120, 18～20 g) were randomly divided into normal saline (NS) group, quartz group, quartz+SPI group and quartz+NS group. Oropharyngeal aspiration of quartz suspension was performed to make model. The mice in quartz+SPI group and quartz+NS group were treated with SPI (10 mg /kg) or the same volume of NS daily by oral gavage throughout the experiment. The mice were sacrificed following anesthesia on days 3, 14 and 28 after treatment. The total number and different types of bronchoalveolar lavage fluid (BALF)-derived cells were routinely counted. HE staining, Masson’s trichrome staining and immunofluorescent staining were used to conduct histopathologic examination. The mRNA expression levels of collagen I (Col I), collagen III (Col III) and transfor-ming growth factor-β1(TGF-β1) were examined by real-time PCR. The content of TGF-β1 in BALF was measured by ELISA. RESULTS: The classical pathological stages of quartz-induced lung injury, including acute inflammation phase (3 d), progressive fibrosis phase (14 d) and late fibrosis phase (28 d), were observed. Compared with quartz+NS group, the inflammatory responses of the lungs in quartz+SPI group were attenuated in the acute inflammation phase, and the degree of fibrosis was significantly reduced at 28 d after the inspiration of quartz. After the treatment with SPI, the mRNA expression of Col I, Col III and TGF-β1 in the lung tissues was effectively down-regulated. Meanwhile, the content of TGF-β1 in BALF was reduced. CONCLUSION: Treatment with SPI may significantly attenuates quartz-induced early inflammatory responses of the lung tissues by regulating the mRNA expression of TGF-β1 and secretion of TGF-β1 protein, and reduces the mRNA expression of Col I and Col III at fibrotic phase, resulting in the inhibition of the progression of fibrosis.

[KEY WORDS]Quartz; Lung fibrosis; Spirolactone; Transforming growth factor-β1

[文章編號]1000- 4718(2016)05- 0947- 06

[收稿日期]2016- 02- 22[修回日期] 2016- 03- 29

*[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81570335； No. 81441101)；武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院項(xiàng)目(No. FYJ201510； No. FYZ201402； No. FYZ201538)

通訊作者△姬文婕 Tel: 022-60577283; E-mail: ji_wenjie@hotmail.com； 魏路清 Tel： 022-60578671； E-mail： wei_luqing@hotmail.com

[中圖分類號]R363

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.05.031

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net

▲并列第1 作者