何 平，楊文娟，李法凱，趙衛(wèi)鋒，周華波，李瑞凱，梁明麗，韋紅云，何劍橋，祝 健，韋祖樟，黃偉堅(jiān)，陳 櫻

（1. 廣西大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530004；2. 南寧市華波寵物醫(yī)院，南寧 53004）

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貓杯狀病毒的分離鑒定及其全基因組的序列分析

何 平1，楊文娟1，李法凱1，趙衛(wèi)鋒1，周華波2，李瑞凱1，梁明麗1，韋紅云1，何劍橋1，祝 健1，韋祖樟1，黃偉堅(jiān)1，陳 櫻1

（1. 廣西大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530004；2. 南寧市華波寵物醫(yī)院，南寧 53004）

摘 要：本研究采用MDCK細(xì)胞從養(yǎng)殖場(chǎng)患病豬的鼻拭子樣品中分離獲得1株貓的杯狀病毒（Feline calicivirus，F(xiàn)CV），命名為GX01-2013。采用RT-PCR方法擴(kuò)增了該毒株的全基因組，并進(jìn)行了序列測(cè)定和分析。結(jié)果表明，該毒株基因組全長(zhǎng)7704 bp，與哈爾濱分離株HRB-SS較為相近，其核苷酸同源性為82.3%。根據(jù)FCV衣殼蛋白構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)該病毒與F9、F4、225和2024疫苗株均不在同一分支，氨基酸同源性為84.2%～87.7%，各毒株間無明顯地域差異。此外，VP1蛋白的E區(qū)（426～521aa）發(fā)現(xiàn)有4個(gè)中和性抗原位點(diǎn)發(fā)生改變。

關(guān)鍵詞：貓杯狀病毒；全基因組；遺傳進(jìn)化分析

貓杯狀病毒（Feline calicivirus，F(xiàn)CV）屬于杯狀病毒科，杯狀病毒屬，單股正鏈RNA病毒，是一種主要引起貓科動(dòng)物多發(fā)性口腔和呼吸道疾病、慢性胃炎的重要病原[1]，由于病毒株毒力強(qiáng)弱及動(dòng)物抵抗力的不同，有些病毒株引起貓的急性關(guān)節(jié)炎、腸炎、肺炎及跛行綜合征等[2]。目前認(rèn)為貓杯狀病毒呈世界性分布，其在貓科動(dòng)物中具有高度的傳染性，貓及某些野生動(dòng)物獵豹[3]、虎[4]和獅[5]等對(duì)其均有易感性，癥狀的嚴(yán)重程度隨病毒毒力的強(qiáng)弱和動(dòng)物年齡的差別而不同，但以一歲以下的貓易感性最高，也有感染狗的報(bào)道[6]。由于該病毒是杯狀病毒科中唯一可在體外成功培養(yǎng)的病毒，因此可通過對(duì)該病毒的培養(yǎng)來進(jìn)一步了解其他杯狀病毒。本研究從發(fā)病貓場(chǎng)的鼻拭子中，利用MDCK細(xì)胞分離獲得1株FCV，并對(duì)其進(jìn)行了全基因組擴(kuò)增和序列測(cè)定，為進(jìn)一步研究廣西FCV的分子流行病學(xué)和生物學(xué)特性奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1樣品來源及處理 2013年9月柳州某養(yǎng)貓場(chǎng)發(fā)生呼吸道疾病，發(fā)病率約為30%，患病貓群體溫為39.3℃～41.5℃，出現(xiàn)流鼻涕，口和眼的分泌物較多。采集患病貓的鼻拭子及其分泌物30份，將混合物放入PBS液（pH=7.2～7.6，2000U/mL青鏈霉素）中，振蕩2～4min后，15 000×g離心5 min，棄去棉拭子，將上清保存于－80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2細(xì)胞和主要試劑 MDCK細(xì)胞由廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心惠贈(zèng)，由本實(shí)驗(yàn)室保存。E.coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自TIANGEN公司；pMD18-T Vector、LA Taq DNA polymerase（5 μL）購(gòu)自TaKaRa；細(xì)胞裂解液RNAiso plus、dNTP、RNasin酶抑制劑、M-MuLV Reverse Transcriptase（200 U/μ L）購(gòu)自大連寶生物公司；Easy Taq DNA

polymerase購(gòu)自全式金生物公司；柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；通用型DNA膠回收試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液以及胎牛血清為Gibco產(chǎn)品。

1.3病毒分離 MDCK細(xì)胞培養(yǎng)至單層，首先用PBS 洗2遍，然后將過濾好的鼻咽拭子混合物分別接種細(xì)胞，孵育1 h后，棄上清，將配好的不含F(xiàn)BS的細(xì)胞培養(yǎng)液接種MDCK，37℃培養(yǎng)48 h，每12 h觀察是否出現(xiàn)細(xì)胞病變（cytopathic effect，CPE），48 h后取上清進(jìn)行鑒定。

1.4病毒RT-PCR鑒定 參考Abd-Eldaim[7]的引物設(shè)計(jì)和PCR程序。取200μL，按照說明書提取病毒總RNA。用貓杯狀病毒的P6引物，并按照AMV反轉(zhuǎn)錄酶使用說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。25 μL反轉(zhuǎn)錄體系：5×Buffer 5 μ L，2.5mmol/L dNTP mix 2 μL，引物 1 μL，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶 0.5μL，RNasin抑制劑 0.5μL，RNA 16 μL。置PCR儀42℃反轉(zhuǎn)錄1 h。陽(yáng)性對(duì)照為貓三聯(lián)苗，商品名為“妙三多”（美國(guó)輝瑞）；ddH2O為陰性對(duì)照。

1.5病毒全基因組擴(kuò)增 根據(jù)GenBank中已知的FCV全基因組序列并參考鄭翠玲等[8]設(shè)計(jì)了如下引物（見表1）。按照1.4的方法提取病毒RNA和反轉(zhuǎn)錄，取5 μL cDNA進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，1個(gè)循環(huán)；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸4 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；最后4℃保存。用OMEGA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物后，克隆于pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化宿主菌DH5α。將陽(yáng)性重組質(zhì)粒送往上海杰李生物技術(shù)公司進(jìn)行序列測(cè)定。

表1 本文所使用的引物及其序列Table 1 The primers used in this paper

1.6基因序列分析及其遺傳演化分析 將所測(cè)的序列應(yīng)用Lasergene DNAStar 7.1軟件中的Seqman進(jìn)行拼接，并在NCBI（BLAST，megablast; http://www. ncbi.nlm.nih.gov/）上進(jìn)行檢索確認(rèn)。用MEGA6.0 beta軟件來構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2　結(jié)果

2.1病毒分離情況 將RT-PCR鑒定為陽(yáng)性樣品接種單層MDCK細(xì)胞，其中1份樣品接種細(xì)胞后，48 h出現(xiàn)皺縮、變圓，呈葡萄串狀的CPE現(xiàn)象（圖1）。隨著病毒傳代數(shù)（第11代）的增加，病毒引起細(xì)胞病變速度加快，說明病毒對(duì)MDCK細(xì)胞的適應(yīng)性逐漸增強(qiáng)。對(duì)該毒株進(jìn)行RT-PCR鑒定，結(jié)果顯示，第3代的細(xì)胞上清可以擴(kuò)增獲得約550bp左右的目的片段，與預(yù)期相符（圖2）。將該分離株命名為FCV/ Feline/Guangxi/01/2013(GX01-2013)。

圖1　分離株GX01-13細(xì)胞培養(yǎng)48 h時(shí)細(xì)胞病變圖Fig. 1 CPE in MDCK cells at 48 hpiA: 陰性對(duì)照; B: GX01-2013毒株A: Negative control; B: GX01-2013 isolate

圖2　分離株GX01-2013的RT-PCR檢測(cè)Fig. 2 Detection of GX01-2013 isolate by RT-PCRM: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000); 1: 陽(yáng)性對(duì)照; 2: 陰性對(duì)照; 3: 病毒樣品M: DNA Marker(DL2000); 1: Positive control; 2: Negative control; 3: Virus sample

2.2病毒全基因組擴(kuò)增 運(yùn)用表1中的3對(duì)特異性引物對(duì)GX01-2013進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見預(yù)期大小條帶，其中P1P2引物擴(kuò)增的片段為2464 bp，P3P4引物擴(kuò)增的片段為2901 bp，P5P6引物擴(kuò)增的片段為2366 bp（圖3）?；蛐蛄幸奊enBank（登錄號(hào)：KT970059）。

圖3　分離株GX01-2013全基因組擴(kuò)增圖Fig. 3 PCR results of GX01-2013 genomeM: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL15000); 1: P1P2引物擴(kuò)增產(chǎn)物(2464 bp); 2: P3P4引物擴(kuò)增產(chǎn)物(2901 bp); 3: P5P6引物擴(kuò)增產(chǎn)物(2366 bp)M: DNA Marker(DL15000); 1: Segment from P1P2 Primers (2464 bp); 2: Segment from P3P4 Primers (2901 bp) ; 3: Segment from P5P6 Primers (2366 bp)

2.3衣殼蛋白基因（open reading frame，ORF2）序列的遺傳進(jìn)化分析 本研究還選取了25株國(guó)內(nèi)外流行毒株和疫苗株與該分離株的衣殼蛋白基因（ORF2）進(jìn)行了序列分析，并構(gòu)建了核苷酸和氨基酸遺傳進(jìn)化樹（圖4）。從核苷酸序列進(jìn)化樹分析可以看出，該毒株與中國(guó)其他分離株CH-GD、FB-NJ-13 和HRB-SS均不在一個(gè)分支上，其分布無地域性差異。此外，氨基酸序列進(jìn)化樹中，該毒株雖與美國(guó)的UTCVM-H1、UTVCM-H2和FCV-182cvs5A毒株在同一大分支上，但親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；與疫苗株F9、F4、225和2024均不在一個(gè)分支上。初步推斷該分離株不屬于疫苗株。

2.4全基因組核苷酸和氨基酸序列同源性分析 全基因組核苷酸序列同源性分析發(fā)現(xiàn)GX01-2013與哈爾濱分離毒株HRB-SS的核苷酸同源性最高，為82.3%，與疫苗株F9、2024和F4的核苷酸同源性分別為78.5%、78.7%和79.6%（表2）。其中編碼病毒非結(jié)構(gòu)聚蛋白ORF1基因相對(duì)保守，與HRB-SS的氨基酸同源性高達(dá)93.9%；ORF2的超變區(qū)基因差異較為顯著，與HRB-SS的同源性僅為68.1%，與商業(yè)化疫苗株的氨基酸同源性為63.6%～72.7%，結(jié)果符合FCV的分子生物學(xué)特征。編碼VP2蛋白的ORF3基因氨基酸同源性在80.4%～91.6%，與FCV-225株的同源性相對(duì)較低，為80.4%。

圖4　分離株GX01-2013衣殼蛋白核苷酸（a）和氨基酸序列（b）遺傳進(jìn)化分析圖Fig. 4 Phylogenetic analysis of FCV capisd nucleotide(a) and amino acid (b) sequences注: 圓圈代表本實(shí)驗(yàn)分離毒株; 三角形代表疫苗株Note: Black circles are the isolates in our study; triangles are the vaccine strains

表2 GX01-2013分離株全基因組和各片段的核苷酸與氨基酸序列同源性分析Table 2 Nucleotide and amino acid sequences identity between GX01-2013 strain and other strains

3　討論

貓杯狀病毒是引發(fā)貓科動(dòng)物出現(xiàn)急性或者慢性上呼吸道疾病的病原之一。感染后動(dòng)物出現(xiàn)呼吸道和口腔潰瘍、鼻炎、眼結(jié)膜炎和口腔炎癥。臨床上表現(xiàn)為嚴(yán)重的流鼻涕，嗜睡、厭食、發(fā)燒、食欲下降和跛行，嚴(yán)重的可引發(fā)肺炎和流產(chǎn)等。康復(fù)貓和隱性感染的貓是病原的主要攜帶者。近年來頻有FCV強(qiáng)毒變異株感染的報(bào)道，即使是接種了疫苗的貓也有可能會(huì)發(fā)生感染[9]，2003年英國(guó)及2009年法國(guó)就曾爆發(fā)過疫苗免疫的成年貓以黃疸、水腫、高死亡率為特點(diǎn)的全身性疾?。╲irulent systemic disease，VSD）[10]。本研究發(fā)現(xiàn)免疫貓三聯(lián)疫苗的貓場(chǎng)暴發(fā)了貓的杯狀病毒，發(fā)病率高達(dá)30%，死亡率約1%，通過RT-PCR鑒定和病毒分離獲得了分離株GX01-2013。由于當(dāng)時(shí)疑似流感病毒與其混合感染，因此將陽(yáng)性樣品接種于MDCK細(xì)胞進(jìn)行分離，接種48 h后，發(fā)現(xiàn)MDCK細(xì)胞出現(xiàn)較為明顯的CPE，經(jīng)RT-PCR鑒定為FCV。連續(xù)傳11代后，發(fā)現(xiàn)該病毒仍能較好地在MDCK細(xì)胞保持穩(wěn)定增殖。然而，目前報(bào)道FCV大多在CRFK、F81、DK、Vero等細(xì)胞分離獲得，并且貓腎細(xì)胞較為敏感[11]。本研究所分離毒株對(duì)MDCK細(xì)胞較為易感，在研究中較為少見，其生物學(xué)特性有待進(jìn)一步研究。

本研究獲得的GX01-2013基因組全長(zhǎng)7704 bp，ORF1的長(zhǎng)度為5292 bp（20～5311），ORF2為2007 bp （5314～7320），ORF3為321 bp（7317～7637）。ORF3起始密碼子與ORF2的終止密碼子有4個(gè)核苷酸重疊，與過去的報(bào)道的一致[12]。但是ORF3的終止密碼子（TAG）與國(guó)外疫苗株（F9、F4、225和2024）的TGA有不同，而且3'端的非編碼區(qū)延伸到7704個(gè)堿基。不同基因組長(zhǎng)度是否與其臨床表現(xiàn)相關(guān)，有待進(jìn)一步研究。通過比較各毒株之間的衣殼蛋白核苷酸和氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)FCV之間無明顯的地域差別，同一個(gè)國(guó)家之間的FCV相差甚遠(yuǎn)。盡管全基因組序列分析發(fā)現(xiàn)分離株與HRB-SS在一個(gè)分支（數(shù)據(jù)未出示），但是衣殼蛋白氨基酸序列分析，卻發(fā)現(xiàn)分離株與中國(guó)的FCV毒株NJ-13、CH-GD、HRBSS均不在一個(gè)分支。通過比較該分離株與疫苗株F9、F4、225和2024不同基因片段之間的差別，編碼多聚蛋白的ORF1片段，在FCV中相對(duì)較保守，氨基酸同源性高于90%。編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP2的ORF3片段與HRB-SS的氨基酸同源性高達(dá)91.6%，而與其他疫苗株氨基酸同源性為80.4%～89.6%。ORF2片段編碼FCV的衣殼蛋白，它分為A、B、C、D、E 和F等6個(gè)區(qū)，其中E為超變區(qū)，各毒株之間的氨基酸同源性為84.2%～87.7%。疫苗免疫失敗多數(shù)與病毒變異相關(guān)，該病毒最易發(fā)生變異的蛋白為衣殼蛋白（VP1），特別是VP1蛋白中的E區(qū)。E區(qū)大約在427～524 aa 之間，含有 FCV 的抗原表位，該區(qū)被28 個(gè)保守序列（con E）分成 5'端（33 aa）和 3'端（34 aa）高變區(qū)（HRV），被作為流行病學(xué)調(diào)查的工具[13]。因此，我們對(duì)該毒株的E區(qū)進(jìn)行了氨基酸位點(diǎn)分析。由于受到宿主的免疫壓力影響，幾乎所有的變異都發(fā)生在衣殼蛋白，其中E區(qū)的超變區(qū)抗中和位點(diǎn)發(fā)生改變，T441→A、A448→K、K449→A和D494→N，這些氨基酸的改變是否影響病毒的嗜性或者病毒的毒力和復(fù)制能力，有待進(jìn)一步研究。

根據(jù)目前國(guó)內(nèi)對(duì)FCV的流行情況分析，F(xiàn)CV不僅危害寵物貓，而且對(duì)大型貓科動(dòng)物也具有致病性。國(guó)外已經(jīng)研制出FCV疫苗預(yù)防該病的發(fā)生，但是隨著FCV的頻繁變異，當(dāng)前的疫苗株可能喪失了一定保護(hù)力。因此，加強(qiáng)對(duì)FCV的流行病學(xué)情況調(diào)查，分離獲得更多毒株并了解其生物學(xué)特性，為今后篩選疫苗候選株和研發(fā)新型疫苗提供科學(xué)參考。

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·研究論文·

SEQUENCE ANALYSIS OF THE COMPLETE GENOME OF FELINE CALICIVIRUS ISOLATE

HE Ping1, YANG Wen-juan1, LI Fa-kai1, ZHAO Wei-feng1, ZHOU Hua-bo2, LI Rui-kai1, LIANG Ming-li1, Wei Hong-yun1, HE Jian-qiao1, ZHU Jian1, WEI Zu-zhang1, HUANG Wei-jian1, CHEN Ying1

(1. College of Animal Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530004, China; 2. Huabo Pet Hospital, Nanning, 530004, China)

Key words:Feline calicivirus; genome; phylogenetic analysis

Abstract:A feline calicivirus strain GX01-2013 was isolated by inoculating nasal swabs of diseased cats into MDCK cells. The complete sequence of the GX01-2013 strain was amplifi ed in RT-PCR and analyzed. Its complete genome was 7704 bp in length. The nucleotide homology was 82.3% with HRB-SS strain. Phylogenetic analysis of capsid protein revealed that GX01-2013 was distant from the vaccine strains (F9, F4, 225 and 2024) as their overall similarity of amino acids ranged from 84.2% to 87.7%. In addition, no geographical difference was found among these strains. This study also revealed that four amino acid sites associated with virus neutralization altered in the E region (426-521aa) of the capsid gene.

中圖分類號(hào)：S852.659.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1674-6422（2016）01-0001-06

收稿日期：2015-11-20

基金項(xiàng)目：廣西教育廳高?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（YB2014005）；廣西大學(xué)科研基金項(xiàng)目（XJZ140236）；廣西自然科學(xué)基金回國(guó)項(xiàng)目（2015GXNSFCA139002）

作者簡(jiǎn)介：何平，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

通信作者：陳櫻，E-mail：yingchen@gxu.edu.cn