丁明洋，戚偉強，陳宗艷，朱 杰，吳巧梅，繆秋紅，李傳峰，吳 潤，劉光清

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2. 甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，蘭州 730070）

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一種新型鴨呼腸孤病毒SYBR Green II熒光定量PCR方法的建立

丁明洋1,2，戚偉強1,2，陳宗艷1，朱 杰1，吳巧梅1，繆秋紅1，李傳峰1，吳 潤2，劉光清1

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2. 甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，蘭州 730070）

摘 要：該研究旨在建立一種快速、敏感和特異性檢測新型鴨呼腸孤病毒（Novel duck reovirus，NDRV）的熒光定量PCR診斷方法。本實驗以感染新型鴨呼腸孤病毒的鴨組織RNA提取物為模板，根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中呼腸孤病毒S1基因全序列，設(shè)計合成了一對特異性引物，PCR擴增基因片段，將其克隆至pET-30a載體，重組質(zhì)粒測序并進行同源性分析；以陽性質(zhì)粒為模板，建立SYBR Green II熒光定量PCR檢測方法，并進行敏感性和特異性檢測。經(jīng)測序證實擴增片段與預期目的片段相符，所建立的SYBR Green II熒光定量PCR檢測S1的反應在101～108copies/uL之間具有良好的線性關(guān)系，反應的檢出下限為10 copies/μL，而H5型禽流感病毒、H9型禽流感病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、C型鴨肝炎病毒、新城疫病毒、鵝細小病毒、鴨瘟病毒等病毒的檢測為陰性，表明該方法敏感、特異。本研究成功建立了SYBR Green II熒光定量PCR檢測新型鴨呼腸孤病毒的方法，為新型鴨呼腸孤病毒致病機制和機體免疫保護機制的研究提供了技術(shù)平臺。

關(guān)鍵詞：新型鴨呼腸孤病毒；S1；熒光定量PCR；熔解曲線；檢測

禽呼腸孤病毒（Avian reovirus，ARV）屬于呼腸孤病毒科，正呼腸孤病毒屬成員。ARV相繼從患有病毒性關(guān)節(jié)炎/腱鞘炎、心肌炎、矮小綜合癥、腸道疾病和“吸收不良綜合癥”等病的雞體內(nèi)分離出來[1]。番鴨呼腸孤病毒（Muscovy duck reovirus，MDRV）的感染，最早由Kaschula報道發(fā)生于非洲[2]，1997年以來我國福建省、浙江省等省雛番鴨也發(fā)生類似疫病，吳寶成等[3]在國內(nèi)首次確認該病原為番鴨呼腸孤病毒。此后，黃瑜等[4]、王永坤等[5]先后報道了半番鴨、鵝感染呼腸孤病毒。劉紅等[6]從北京鴨病料中分離到一株呼腸孤病毒DRV-GZ株。研究表明MDRV對北京鴨、麻鴨、鵝和雞不具有致病性[7,8]。在四川省、廣東省、安徽省等省份陸續(xù)報道鴨群中出現(xiàn)一種新的病毒病，威脅著水禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，陳少鶯等[9,10]從肝臟不規(guī)則壞死和出血混雜為主要特征的發(fā)病麻鴨群中分離到新的呼腸孤病毒，隨后，各地陸續(xù)報道新型鴨源呼腸孤病的流行[11,12]。NDRV感染宿主的范圍逐漸擴大，現(xiàn)已成為危害家禽養(yǎng)殖業(yè)重要傳染病之一。

禽弧腸孤病毒無囊膜，呈二十四面體雙層衣殼結(jié)構(gòu)，核酸為線性雙鏈 RNA，基因組由10 個雙鏈RNA 基因片段組成，根據(jù)它們的電泳遷移率分為三組：L（大），M90（中），S（小）。L 組有三個片段（L1、L2、L3），M 組三個片段（M1、M2、M3），S組四個片段（S1、S2、S3、S4）[13]，其中S1基因的第三個ORF為σC基因，該基因編碼σC蛋白，與NDRV的致病機制有關(guān)。

目前該病的診斷包括病毒分離和血清學方法。但這些方法繁瑣、費時，不適用于本病的快速診斷[14]。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中呼腸孤病毒S1 基因全序列，設(shè)計合成了一對特異性引物，以NDRV TH11分離株為模板，建立了檢測NDRV的實時熒光定量RT-PCR方法。該方法操作簡便、敏感性高、重復性好、特異性強，為臨床上NDRV的快速診斷及分子流行病學調(diào)查提供了有效手段。

1　材料與方法

1.1毒株 新型鴨呼腸孤病毒（Novel duck reovirus

TH11，DRV TH11）、H5禽流感病毒（H5 subtype avian in-fluenza virus，H5-AIV）、H9禽流感病毒（H9 subtype avian in-fluenza virus，H9-AIV）、雞傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）、C型鴨肝炎病毒（Duck hepatitis virus type C，C-DHV）、新城疫病毒（New castle disease virus，NDV）、鵝細小病毒（Goose Parvovirus，GPV）及鴨瘟病毒（Duck viral enteritis，DEV）為本實驗室保存。

1.2試劑和儀器 Trizol購自invitrogen公司；禽源反轉(zhuǎn)錄酶（AMV）、T4 DNA連接酶載體購自Promega公司；pET-30a購自Novagen公司；SYBR Premix ExTaq II購自康為世紀公司；質(zhì)粒提取試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞均購自天根生化科技有限公司；膠回收試劑盒、熒光定量PCR管購自Axygen公司；Taq酶、RNA酶抑制劑、dNTP、DNA Marker等均購自大連寶生物有限公司。主要儀器為Mastercycler ep realplex 4熒光定量PCR儀（Eppendorf公司）。

1.3引物 使用MegAlign軟件對本實驗室分離毒株NDRV TH11株σC基因序列（GenBank登錄號：JX826587）及GenBank數(shù)據(jù)庫中其他呼腸孤病毒σC基因核苷酸序列進行同源性分析，在高度保守區(qū)域設(shè)計并合成一對特異性引物。F：5'-GGAGTCGTCTCACTCCAAGC-3'；R：5'-TTTGCGAAGACATGAGCAAC-3'。預計擴增目的片段長度為189bp。引物交由上海杰李生物技術(shù)有限公司合成。

1.4病毒RNA的提取和cDNA的合成 按照Trizol法說明書提取各病毒的總RNA：取反復凍融三次的病料上清500μL至EP管中，加入500μLTrizol試劑混勻，室溫靜置5 min后加入0.2mL氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫靜置3 min，4℃ 12 000×g離心10 min，小心吸取上清至另一EP管中，加入500μL預冷的異丙醇，-20℃沉淀30 min，4℃ 12 000×g離心10 min，棄上清，加入1 mL預冷的75%乙醇洗滌沉淀，4℃7500×g離心5 min，棄上清，室溫自然干燥5 min，用Nuclease-Free Water 20 μL溶解RNA沉淀，分裝后置于-20℃儲存?zhèn)溆谩DNA的合成：2 μg總RNA模板，1 μL隨機引物，5 μL 5×反轉(zhuǎn)錄Buffer，2 μL dNTP mix（10 mmol/L），1 μL反轉(zhuǎn)錄酶（200U/μL）、1 μL RNA RNase Inhibitor（20U/ μL），補足Nuclease-Free Water至25 μL體系，將上述溶液渦旋混勻后，于37℃孵育60 min后，置于75℃孵育10 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶，反應結(jié)束后，即得到反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA，用于后續(xù)實驗。

1.5陽性標準模板的制備 以cDNA為模板使用特異性引物，擴增NDRV TH11株病毒的σC基因，反應體系：2×Premix ExTaq 10μL、上下游引物各1 μL、cDNA 2μL、ddH2O 6μL。S1基因PCR反應程序：95℃預變性5 min；94℃變性30s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min。反應結(jié)束后，在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測擴增結(jié)果。用膠回收試劑盒回收純化的片段，與pET-30a載體連接克隆，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-30aσC。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α大腸埃希氏菌種感受態(tài)細胞挑取陽性菌落，提取質(zhì)粒進行PCR鑒定和序列測定，挑選結(jié)果正確的質(zhì)粒并測定其濃度，根據(jù)公式計算出重組質(zhì)粒pET-30a-σC標準品的拷貝數(shù)。

1.6SYBR Green II實時熒光定量PCR檢測方法的建立

1.6.1SYBR Green II熒光定量PCR反應體系的建立及優(yōu)化 以重組質(zhì)粒pET-30a-σC標準品為模板，采用矩陣法篩選引物的最佳濃度，并對反應條件進行優(yōu)化。優(yōu)化反應條件為采用兩步法PCR，并繪制熔解曲線。

1.6.1.1熒光定量 RT-PCR 引物濃度的優(yōu)化 取1×105copies/μL陽性質(zhì)粒標準品pET-30a-σC為模板。分別以0.2 μL、0.5 μL、1.0 μL、1.5 μL、2.0 μL的引物（10 μm/mL）進行 PCR 反應，以獲得最佳引物濃度。

1.6.1.2熒光定量 RT-PCR 退火溫度的優(yōu)化 取1×105copies/μL陽性質(zhì)粒標準品pET-30a-σC為模板，分別以55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60.0℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃為退火溫度對病毒進行 PCR擴增，以確定最佳退火溫度。

1.6.2標準曲線的建立 將S1基因PCR擴增產(chǎn)物克隆于pET-30a載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-30a-σC，以重組質(zhì)粒為標準品，紫外分光光度計測定陽性標準品的OD260值，根據(jù)陽性標準品的分子量與質(zhì)量濃度，計算其拷貝濃度，調(diào)整濃度后，將重組pET-30a-σC質(zhì)粒做10倍梯度稀釋，獲得1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102copies/μL的系列標準模板，采用優(yōu)化好的條件進行SYBR GreenⅡ?qū)崟r熒光定量PCR，得到各自的Ct值。以Ct值為橫坐標，起始模板濃度的對數(shù)為縱坐標，建立標準曲線。

1.7特異性試驗 利用本研究建立的熒光定量RTPCR檢測方法，對新型鴨呼腸孤病毒的基因組RNA，以及對照病原AIV、IBV、C-DHV、NDV、GPV、DEV等病毒的核酸進行特異性檢測。

1.8敏感性試驗 對陽性重組質(zhì)粒標準品以10倍極限稀釋后，取1.0×105copies/μL～1.0×101copies/μL共5個濃度進行敏感性試驗。

1.9重復性試驗 對陽性重組質(zhì)粒標準品的1×106copies、1×105copies、1×104copies等3個濃度進行批內(nèi)3個重復和批間3個重復檢測。

1.10實驗室感染樣品的檢測 將NDRV TH11株病毒以病毒原液、400TCID50、200TCID50三組不同劑量病毒液通過腿部肌肉途徑接種3日齡麻鴨，每一組10只，設(shè)立對照組。選取經(jīng)NDRV TH11株病毒感染后d7病鴨，采集的病鴨脾臟組織共30份，分別運用SYBR Green II熒光定量PCR方法和本實驗室建立的常規(guī)RT-PCR方法進行檢測，并對比檢測結(jié)果。

2　結(jié)果

2.1陽性標準品的制備 RT-PCR擴增獲得NDRV的σC基因片段，將其克隆到pET-30a載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-30a-σC, 對其進行PCR鑒定，得到1條大小約189bp的特異片段，與預期目的片段大小相符（圖1），表明σC基因片段已克隆到pET-30a載體中。重組陽性質(zhì)粒的濃度100.3ng/μL, 大小為5611bp，拷貝數(shù)（Copies）=(amount×6.022×1023)/ （DNA length×109×660），經(jīng)計算，調(diào)整重組陽性標準質(zhì)粒的DNA分子數(shù)為1.0×108copies/μL。

圖1　標準品目的片段PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果Fig. 1 Amplication results of standard fragmentM: DNA分子量標準 (DL2000 plusⅡ); 1: 空白對照; 2: 標準品擴增產(chǎn)物M: DNA Marker DL2000 plusⅡ; 1: Negative control ; 2: Standard fragment

2.2SYBR Green II實時熒光定量PCR反應條件的確定及標準曲線的建立 將陽性重組質(zhì)粒經(jīng)10倍系列稀釋為1.0×108～1.0×101copies/μL 共8個濃度，作為標準品進行實時熒光定量RT-PCR 反應。反應體系為 25 μL，包括 SYBR Premix Ex Taq II 12.5μL、ROX Reference DyeII 0.5μL、上下游引物各 0.5μL （0.2mmol/L）、模板（質(zhì)粒或cDNA）2 μL、補Nuclease-Free Water 25 μL。反應條件：94℃ 預變性30 s；94℃ 變性5 s，63℃退火30 s，擴增40 個循環(huán)。結(jié)果各濃度有很好的線性關(guān)系。陰性對照無擴增反應。得到標準曲線方程為Y=-3.486X+32.38；Efficiency=0.94；R2=0.997（見圖2）。

圖2　熒光定量PCR標準曲線Fig.2 Standard curve of real-time fl uorescent quantitative PCR

2.3SYBR GreenΠ實時熒光定量PCR的熔解曲線 根據(jù)參數(shù) 95℃ 15 s、60℃～95℃ 20 min、95℃ 30 s繪制溶解曲線。結(jié)果顯示，標準樣品均出現(xiàn)了窄且尖的單峰，說明擴增產(chǎn)物單一，無非特異性擴增，而陰性對照沒有出現(xiàn)熔點峰，熔解溫度為（85±0.4）℃（圖3），表明該SYBR Green II實時熒光定量 PCR反應為特異性擴增。

2.4特異性試驗結(jié)果 NDRV TH11株病毒的熒光定量RT-PCR 檢測結(jié)果為陽性，而AIV、IBV、C-DHV、NDV、GPV、EDSV、DEV等毒株的檢測結(jié)果均為陰性（熒光信號未到檢測可信閾值）（圖4），說明本方法具有很好的特異性。

2.5敏感性試驗結(jié)果 用建立的方法對不同拷貝濃度陽性標準品（1.0×101～1.0×105copies/μL）進行實時熒光定量RT-PCR檢測。陽性標準品均出現(xiàn)特異性熒光擴增，陰性對照無熒光擴增，結(jié)果表明該方法最低可以檢出1.0×101copies/μL的標準品（圖5）。

2.6SYBR GreenΠ實時熒光定量PCR的重復性 對 3批次的S1基因標準品分別做 3 個批內(nèi)重復和3 個批間重復，組內(nèi)變異系數(shù)均小于1%，組間變異系數(shù)均小于 1%，重復性良好（表1）。

2.7麻鴨感染NDRV實驗室樣品的檢測 對采集的30份病鴨肝脾組織，進行研磨，提取病毒RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，運用建立的SYBR Green II熒光定量PCR方法和本實驗室建立的常規(guī)RT-PCR方法進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用SYBR Green II熒光定量PCR方法檢測所有接種病毒樣品，均為陽性，對照組均為陰性；常規(guī)的RT-PCR檢測接種病毒樣品中陽性率僅為83.3%，對照組均為陰性。結(jié)果見表2。

圖3　實時熒光定量RT-PCR溶解曲線Fig .3 The melting curve of real-time RT-PCR

圖4　NDRV SYBR Green II 實時熒光定量PCR檢測方法的特異性Fig. 4 Specifi city of NDRV SYBR Green II real-time fl uorescent quantitative PCR detecting method

3　討論

NDRV的自然宿主相對ARV和MDRV更廣泛，自然狀態(tài)下對各種品種鴨（番鴨、半番鴨、北京鴨、麻鴨）均有致病性[6,9,10]，人工感染亦可引起SPF雞的發(fā)病甚至死亡。發(fā)病日齡約為3～25日齡，其中以5～10日齡居多，不同的毒株之間發(fā)病率和死亡率有很大差異[10]。該病臨床癥狀主要表現(xiàn)為精神萎靡，羽毛凌亂、粗糙、排白色稀糞。剖檢眼觀病變?yōu)楦闻K呈土黃色、質(zhì)脆、有點狀出血點和白色壞死灶，脾臟腫大、壞死嚴重，腎臟出血、腫大[9,10]。

圖5　NDRV實時熒光定量PCR檢測方法的敏感性Fig. 5 Sensitivity of NDRV real-time fl uorescent quantitative PCR detecting method1～5: 1.0×105～1.0×101拷貝數(shù)1-5: 1.0×105-1.0×101copies, respectively

表1 熒光定量PCR組內(nèi)、組間重復性試驗結(jié)果Table 1 Intra-and inter-assay of real-time PCR reproducibility

劉紅等[6]從廣東省一種以腫頭、軟腳、流淚、拉黃綠色稀糞，肝臟出血和壞死及食道泄殖腔有潰瘍和結(jié)痂為主要特征的北京鴨病料中分離到1株呼腸孤病毒以來，福建省、浙江省、重慶市、安徽省等地不斷報道番鴨、北京鴨、麻鴨群發(fā)生該疫病的流行，并且有逐年增加趨勢。建立快速、準確、敏感的新型鴨呼腸孤病毒檢測方法，是臨床上防控該病的前提。

表2 熒光定量PCR從人工感染鴨組織中對新型鴨呼腸孤病毒的檢測Table 2 Detection of Novel duck reovirus from the infected tissues by SYBR Green Ⅱfl uorescent quantitative RT-PCR

本研究建立的實時熒光定量RT-PCR檢測NDRV的方法，特異性好，不與檢測的其他常見家禽傳染病發(fā)生特異性反應。實驗所建立的標準曲線的相關(guān)系數(shù)R2=0.997，擴增效率E=0.94說明核酸拷貝數(shù)的對數(shù)值與Ct之間有極顯著的線性關(guān)系，優(yōu)化體系和條件很好地滿足了實驗要求。重復性實驗得出組內(nèi)變異系數(shù)為0.2%～0.9%組間變異系數(shù)為0.3%～0.9%，說明此方法具有很好的重復性，可以穩(wěn)定地用于NDRV核酸的定量檢測。該試驗中建立的曲線可檢測到10 copies/μL的初始模版量，比常規(guī)RT-PCR敏感性高100倍。利用本實驗建立的熒光定量RT-PCR方法對30份實驗室樣品進行了檢測，結(jié)果檢出陽性樣品30份，而常規(guī)RT-PCR檢出陽性樣品25份，該方法比RT-PCR具有更高的敏感性，而且從收到樣品到得出檢測結(jié)果時間短，因此非常適合NDRV的早期診斷、定量分析以及流行病學監(jiān)測。本試驗檢測速度快，比其他的血清學檢測方法節(jié)省時間，準確性高。操作簡便、敏感性高、重復性好、特異性強，為臨床上NDRV的快速診斷及分子流行病學調(diào)查提供了有效手段。

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·研究論文·

DETECTION OF NOVEL DUCK REOVIRUS USING SYBR GREEN II FLUORESCENT QUANTITATIVE PCR ASSAY

DING Ming-yang1,2, QI Wei-qiang1,2, CHEN Zong-yan1, ZHU Jie1, WU Qiao-mei1, MIAO Qiu-hong1, LI Chuan-feng1, WU Run1, LIU guang-qing1

(1. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2.College of Animal Medicine,Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

Key words:Novel duck reovirus; S1; fl uorescent quantitative PCR; melting curve; detection

Abstract:To develop a fast, sensitive, specifi c SYBR Green II fl uorescent quantitative PCR assay for detecting Novel duck reovirus (NDRV) infection, S1 gene was amplifi ed in RT-PCR from the NDRV infected-duck tissues, and cloned into pET-30a vector. The resulting recombinant plasmid was used as the template for making a standard curve. Subsequently, the sensitivity and specifi city of the SYBR Green II fl uorescent quantitative PCR assay that was developed were determined. The results showed that the NDRV real-time PCR assay had a dynamic range of detection between 101and 108copies/μL with a sensitivity of 10 copies/μL. There was no cross reaction with H5 subtype Avian infl uenza virus, H9 subtype Avian infl uenza virus, Infectious bronchitis virus, Duck hepatitis virus type C, New castle disease virus, Goose parvovirus and Duck viral enteritis. In conclusion, a SYBR Green II fl uorescent quantitative PCR assay has been developed for quantifi cation of NDRV, which can be sued for investigating the pathogenesis of NDRV.

中圖分類號：S852.659.4

文獻標志碼：A

文章編號：1674-6422（2016）01-0007-08

收稿日期：2015-09-15

基金項目：上海市科委創(chuàng)新項目（13391901600）；國家自然科學基金項目（31270194）

作者簡介：丁明洋，男，碩士研究生，預防獸醫(yī)專業(yè)；戚偉強，男，碩士研究生，預防獸醫(yī)專業(yè)

通信作者：劉光清，liugq@shvri.ac.cn；吳潤，E-mail：wurun@gsau.edu.cn