劉 通，李澤青，閆 峻，李 寧，穆淑琴，李 馳，馬 墉，王文杰

1.西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，陜西 楊凌 712100；2.天津市寶坻區(qū)畜牧水產(chǎn)業(yè)發(fā)展服務中心；3.天津市畜牧獸醫(yī)研究所；4.天津市畜禽健康養(yǎng)殖技術工程中心

構建Diquat誘導斷奶仔豬氧化應激模型的研究

劉 通1，李澤青2，閆 峻3,4,*，李 寧1，穆淑琴3,4，李 馳1，馬 墉3,4，王文杰3,4

1.西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，陜西 楊凌 712100；2.天津市寶坻區(qū)畜牧水產(chǎn)業(yè)發(fā)展服務中心；3.天津市畜牧獸醫(yī)研究所；4.天津市畜禽健康養(yǎng)殖技術工程中心

試驗通過觀察斷奶仔豬一次性腹腔注射Diquat后生長性能、血液生化及抗氧化指標的變化，驗證氧化應激模型是否構建成功，并進一步探明用來評價氧化應激的敏感指標。選用DLY斷奶仔豬10頭，體重10.64±1.08 kg，隨機分配到2個組中，每組5個重復，每個重復1頭豬。處理組按體重一次性腹腔注射10 mg/kg Diquat溶液，對照組腹腔注射相同劑量的滅菌生理鹽水。試驗期21 d，在試驗第3、10、21天空腹前腔靜脈采血，檢測血清生化及抗氧化指標。結果表明，Diquat顯著降低仔豬ADG和ADFI(\%P\%<0.01)，顯著提高血液中ALT、AST活性和COR含量(\%P\%<0.05)，顯著降低血液中GSH-Px活力(\%P\%<0.05)。試驗表明，一次性腹腔注射10 mg/kg Diquat溶液可以誘導斷奶仔豬氧化應激，應激效應可持續(xù)21 d以上，血液中ALT、AST、GSH-PX活力以及COR含量可作為評價氧化應激的指標。

Diquat；斷奶仔豬；氧化應激；模型

The Construction Method of Diquat Induced Oxidative Stress Model of Weaned Pigs

氧化應激是指當動物受到各種有害刺激時，機體內(nèi)高活性分子物質如活性氧自由基和活性氮自由基過量產(chǎn)生，氧化程度超出氧化物的清除，機體處于過氧化損傷的一種狀態(tài)。出生、斷奶、環(huán)境等多種因素均可誘導畜禽體內(nèi)產(chǎn)生氧化應激。生產(chǎn)過程中，氧化應激極大降低了畜禽的生產(chǎn)性能和免疫力，進而引發(fā)疾病，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失。為深入研究氧化應激的機制及抗應激措施，建立穩(wěn)定的氧化應激模型非常重要。Diquat 是二吡啶基除草劑，有研究表明，Diquat能利用分子氧產(chǎn)生O2-和H2O2，其誘導產(chǎn)生氧化應激程度取決于劑量和次數(shù)，易于操作和控制，可作為構建氧化應激的誘導物。本試驗通過給斷奶仔豬一次性腹腔注射10 mg/kg Diquat溶液，考察氧化應激的持續(xù)時間和血液敏感指標變化，構建穩(wěn)定的仔豬氧化應激模型。

1 材料與方法

1.1 材料

Diquat(水劑，有效成分20%)購于河北榮威生物藥業(yè)有限公司 。

1.2 試驗動物及處理

選取健康、體重相近(10.60±1.10 kg)杜×長×大三元雜交斷奶仔豬30頭(公母各半)，隨機分為2個處理組，每個處理3重復，每重復5頭豬。對照組每頭豬腹腔注射2 mL滅菌生理鹽水，處理組每頭豬一次性腹腔注射10 mg/kg Diquat溶液2 mL。

1.3 試驗飼糧

基礎日糧參考NRC (2012)10～20 kg仔豬營養(yǎng)需要配制，組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎日糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎) %

組成(%)營養(yǎng)水平玉米豆粕(46%CP)膨化豆粕乳清粉魚粉蔗糖玉米油石粉磷酸氫鈣食鹽膽堿多維*多礦〔合計60.0011.0015.005.004.002.000.500.800.850.200.100.050.50100粗蛋白CP(%)賴氨酸(%)鈣(%)總磷(%)消化能(MJ/kg)---------18.731.160.950.5113.95---------

*每kg配合飼料提供Supplied the followings per kg of diets：VA10 000 IU：VD32 000 IU；VE100 IU；VK32 mg；VB12 mg；VB26 mg；VB1212 μg；Niacin 30 mg；Folic acid 0.7 mg；D-pantothenic acid 15 mg；Biotin 0.5 mg；Fe 100 mg；Cu 40 mg；Zn 100 mg；Mn 30 mg；Se 0.3 mg；I 0.2 mg。(消化能為計算值，其余為測定值)。

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗豬在保育舍飼養(yǎng)，粉料飼喂，自由采食和飲水，試驗期為21 d。按常規(guī)飼養(yǎng)管理方法進行。分別于試驗開始和結束時空腹稱重，記錄每頭豬體重；在第3、10、21天，全部試驗豬空腹前腔靜脈采血5 mL，制備血清，-20℃保存待檢。

1.5 指標檢測與方法

1.5.1 生長性能 記錄每天飼料消耗量，計算全期的ADG(平均日增重)、ADFI(平均日采食量)和F/G(料重比)。

1.5.2 血液生化指標的測定方法 總蛋白(Total protein，TP)、白蛋白(Albumin，ALB)、葡萄糖(Glucose，GLU)使用東芝120生化檢測儀檢測；皮質醇(Cortisol，COR)、白細胞介素10(interleukin-10，IL-10)使用XH6080放免儀檢測；丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-PX)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；免疫球蛋白A、G、M試劑盒購自北京金?？朴缟锟萍及l(fā)展有限公司。

1.6 數(shù)據(jù)分析與處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件的ONE-WAY 單因素方差分析，以Duncan氏法進行組間多重比較，\%P\%<0.05為差異顯著。結果使用平均值±標準差表示。

2 試驗結果與分析

2.1 Diquat對斷奶仔豬生產(chǎn)性能的影響

從表2可以看出，與對照組相比，處理組的ADFI和ADG顯著降低(\%P\%<0.05)， F/G有提高趨勢但差異不顯著(\%P\%>0.05)。

表2 Diquat對斷奶仔豬生產(chǎn)性能的影響

注：同行數(shù)據(jù)肩標不同的小寫字母表示差異顯著(\%P<\%0.05)，相同或無字母表示差異不顯著(\%P>\%0.05)。下表同。

2.2 Diquat對仔豬血液生化指標的影響

由表3可以看出，注射后第3天對照組和處理組間血液ALT、AST無顯著差異(\%P>\%0.05)；注射后第10天試驗組血液ALT、AST提高了17.71%和15.54%；注射后第21天，處理組血液ALT、AST顯著高于對照組(\%P<\%0.05)。

2.3 Diquat對仔豬血液氧化指標的影響

從表4可以看出，試驗第3、10、21 d，處理組血液COR含量均顯著高于對照組(\%P<\%0.05)，血液GSH-Px均顯著低于對照組(\%P<\%0.05)。

表3 Diquat對仔豬血液生化指標的影響

表4 Diquat對仔豬血液氧化指標的影響

3 討論

3.1 Diquat對仔豬生長性能的影響

消化道是動物消化、吸收和代謝的主要器官，在氧化應激狀態(tài)下，細胞內(nèi)產(chǎn)生大量的自由基，破壞生物膜，影響細胞的正常生理功能，誘發(fā)消化道疾病，致使消化道腺體分泌異常、腸道損傷及腸粘膜通透性升高和腸源性感染，動物表現(xiàn)出采食量下降，生產(chǎn)性能降低。研究發(fā)現(xiàn)，氧化應激通過破壞細胞之間的緊密連接，引起水和大量離子由腸黏膜進入腸腔內(nèi)，誘發(fā)腹瀉。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，注射Diquat 30 min后所有試驗豬出現(xiàn)嘔吐、腹瀉的癥狀，三天后基本恢復正常，氧化應激顯著降低了仔豬的ADFI和ADG，降低了仔豬的生長性能。

3.2 Diquat對血液生化指標的影響

Diquat的靶器官是動物肝臟。血液ALT 、AST的水平反映肝細胞的損傷程度。當肝細胞受到損傷或發(fā)生病變時，細胞的結構和功能完整性遭到破壞，其內(nèi)部的ALT、AST釋放并大量進入血液，引起血液ALT、AST 含量升高，而肝臟組織中兩種酶的活性下降，因此血液中ALT、AST升高可作為肝臟功能受損或病變的敏感指標。王轉丁等研究發(fā)現(xiàn)，游泳應激30 min、50 min 后小鼠血液ALT 和AST顯著升高，之后有所下降但仍高于游泳前水平，說明游泳應激可能造成小鼠肝臟損傷，血液ALT和AST可作為評價小鼠應對游泳應激的敏感指標。本試驗與上述研究結果一致，Diquat顯著提高了血液ALT和AST水平，對仔豬肝臟造成了損傷，造成氧化應激。而試驗前期ALT、AST均處于一個較高水平且差異不顯著，這可能與仔豬斷奶應激有關，朱夢玲等研究表明，仔豬斷奶后血液ALT、AST水平顯著升高，試驗中后期ALT、AST活性呈現(xiàn)下降趨勢，說明仔豬逐漸適應斷奶應激。

3.3 Diquat對血液抗氧化指標的影響

GSH-Px是動物體內(nèi)的天然自由基清除劑，可以催化H2O2和脂質過氧化物還原，在抗氧化損傷和維持細胞的結構方面起著重要的作用。劉曉慧等研究發(fā)現(xiàn)，小鼠巨噬細胞氧化損傷模型中GSH-Px活性顯著低于正常細胞。COR是由腎上腺皮質分泌的一種糖皮質激素，主要作用是調節(jié)體內(nèi)糖和蛋白質的代謝。馬文濤等研究表明，應激組大鼠血清COR含量顯著高于對照組。本試驗結果表明，Diquat能顯著降低GSH-Px活性，增加血液COR含量，降低了仔豬抗氧化能力，使仔豬處于氧化應激狀態(tài)。

3.4 Diquat誘導的仔豬氧化應激模型

本試驗綜合仔豬生產(chǎn)性能、血液生化指標可知，通過一次性腹腔注射10 mg/kg Diquat溶液可有效誘導仔豬發(fā)生氧化應激，建立穩(wěn)定的氧化應激模型。袁施彬等研究發(fā)現(xiàn)，給仔豬一次性腹腔注射12 mg/kg Diquat溶液后第49 d的血清抗氧化酶活力及免疫指標仍顯著低于對照組，表明應激持續(xù)了49 d。徐靜等研究表明，給生長豬一次性腹腔注射8 mg/kg Diquat溶液后氧化應激效應可持續(xù)約28 d，到第35 d時，應激效應基本消除。本試驗中，仔豬在注射Diquat后的3周內(nèi)均處于氧化應激狀態(tài)，說明應激效應時間可持續(xù)21 d以上。

4 結論

給斷奶仔豬一次性腹腔注射10 mg/kg Diquat溶液可誘導氧化應激，建立仔豬氧化應激模型，應激效應可持續(xù)21d以上；血清中ALT、AST、GSH-Px和COR可作為評價氧化應激的敏感指標。

[1] 王建花,張燚,龍淼.玉米赤霉烯酮所致氧化應激的研究進展 [J].畜牧與飼料科學,2015,36(9):30- 32.

[2] Xiangbing Mao,Mei Lv,Bing Yu,et al.The effect of dietary tryptophan levels on oxidative stress of liver induced by diquat in weaned piglets [J].Journal of Animal Science and Biotechnology,2014,5(49):104- 110.

[3] 陳群.氧化應激對動物消化道結構與功能影響的研究 [D].江南大學博士學位論文,2007.

[4] Assim Akopoulos SF,Scopa CD,Vagianos CE.Pathophysiology of increased intestinal permeability in obstructive jaundice [J].World J Gastroenterol,2007,48:6458- 6464.

[5] Guttman JA,Finlay BB.Tight junctions as targets of infectious agents [J].Biochimica et Biophysica Acta,2009,1788:832- 841.

[6] 李利平.探討肝功能中ALT，AST及血脂中TG、TC 在脂肪肝診斷中意義 [J].世界最新醫(yī)學信息文摘,2015,15(66):107- 108.

[7] 蔡文麗,張慧,唐選,等.有氧運動對酒精性肝損傷小鼠ALT、AST、IL-10 和IL-6等的影響 [J].沈陽體育學院學報,2013,32(3):89- 92.

[8] 王轉丁,楊晶晶,李留安,等.不同強度游泳應激對小鼠血清ALT、AST 和ALP 活性的影響 [J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2013,21,(63):164- 166.

[9] 朱夢鈴.斷奶應激對三個品系仔豬血液生化指標的影響 [D].南京農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文,2009.

[10] 劉曉慧,揭國良,林康,等.EGCG和茶氨酸對細胞氧化損傷的協(xié)同保護和修復作用研究 [J].茶葉科學, 2014,34(3):239- 247.

[11] 馬文濤,楊來啟,林玉梅,等.應激對大鼠血清皮質醇及白細胞介素2、6 、8 水平的影響 [J].中國心理衛(wèi)生雜志,2002,16(1):14- 15.

[12] 袁施彬.仔豬氧化應激及硒的抗應激效應和機理的研究 [D].四川農(nóng)業(yè)大學博士學位論文,2007.

[13] 徐靜.豬氧化應激模型構建以及茶多酚的抗應激效應的研究 [D].四川農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文 ,2009.

LIU Tong1, LI Ze-qing2, YAN Jun3,4,*, LI Ning1, MU Shu-qin3,4, LI Chi1,

MA Yong3,4, WANG Wen-jie3,4

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnologyNorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China; 2TianjinBaodiDevelopmentServicecenterofLivestockandAquaculture,Tianjin301800; 3.TianjinInstituteofAnimalhusbandryandveterinary,Tianjin300381,China; 4.TianjinTechnologyEngineeringCenterofLivestockandPoultryhealthyhusbandry,Xiqing,Tianjin300381,China)

This study was to observing growth performance, serum biochemical and antioxidant level of weaned pigs after intraperitoneal injected Diquat, verify whether oxidative stress model was successfully constructed and further evaluate sensitive indicator of oxidative stress.Thirty 10.60±1.10 kg weaned pigs were randomized in two groups, each group has 3 replicates with 5 piglet, the treated group intraperitoneal injected Diquat 10 mg/kg, the control group was injected with the same dose of sterile saline.Trial period 21d, in the 3, 10, 21 days of fasting before venous blood sampling and test serum biochemical and antioxidant indices.The results showed that, Diquat significantly reduce pig’s ADG and ADFI (\%P\%<0.05), significantly increased serum ALT, AST activity and COR level (\%P\%<0.05), significantly reduce serum GSH-Px vitality (\%P\%<0.05).The study showed that intraperitoneal injection of 10 mg/kg Diquat in weaned pigs can induce oxidative stress, stress reaction can retain 21d above, serum ALT, AST, GSH-PX vitality and COR levels can be as stress-sensitive indicators.

Diquat; weaned piglets; oxidative stress; model

2016-08-29

十二五農(nóng)村領域國家科技計劃(2012BAD39B01-3)；博士后基金(2014M561191)；天津市農(nóng)科院院長基金 (15001)。

劉通(1992-)，男，遼寧大連人，碩士，主要從事動物營養(yǎng)研究。E-mail:173148612@qq.com。

*[通訊作者] 閆峻(1984-)，江蘇徐州人，博士，主要從事單胃動物營養(yǎng)與健康養(yǎng)殖技術研究。E-mail:yjjsxz@163.com。

S 828.8

A

1004-6704(2016)06-0061-03