宋得華

定西市臨洮農(nóng)校，甘肅 定西 730500

梅花鹿大腸桿菌的分離與鑒定

宋得華

定西市臨洮農(nóng)校，甘肅 定西 730500

本試驗(yàn)采集武威市天?？h某養(yǎng)殖場病死梅花鹿病料，經(jīng)細(xì)菌分離培養(yǎng)、細(xì)菌形態(tài)觀察、培養(yǎng)特性、生化特性鑒定、藥敏試驗(yàn)及致病性檢測，初步確定致病菌種。對已分離經(jīng)純培養(yǎng)的菌株提取基因組DNA，利用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并得到預(yù)期的基因片段。切下目的條帶分別進(jìn)行回收、載體與產(chǎn)物的連接轉(zhuǎn)化，最后挑取陽性斑置于LB肉湯中，送生物公司測序后，結(jié)合細(xì)菌學(xué)試驗(yàn)結(jié)果最終確定該梅花鹿死亡是由大腸桿菌引起，在此基礎(chǔ)上提出綜合性的防治措施。

梅花鹿；大腸桿菌；分離；鑒定

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病料 武威市天?？h某養(yǎng)殖場病死梅花鹿內(nèi)臟組織。

1.1.2 試驗(yàn)設(shè)備 MOTIC B SERIES光學(xué)顯微鏡、DHP-9270B恒溫培養(yǎng)箱、溫度梯度基因擴(kuò)增儀、高速冷凍離心機(jī)、恒溫鼓風(fēng)干燥箱、DYY-11B型三恒電泳儀、干式恒溫器(DC10)。

1.1.3 試驗(yàn)試劑 瓊脂粉、SS瓊脂、麥康凱瓊脂、生化反應(yīng)所需試劑、引物、OMEGA D3350-01基因組提取試劑盒、Promega膠回收試劑盒、JM109感受態(tài)細(xì)胞、pGEM-T載體等。

1.1.4 試驗(yàn)藥品 麥迪霉素、阿米卡星、米諾環(huán)素、左氧氟沙星、克林霉素、氨曲南、頭孢西丁、頭孢哌酮藥敏紙片。

1.1.5 試驗(yàn)動物 Balb/c小鼠8只，由蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病料涂片染色 采取病死梅花鹿肝、肺涂片，革蘭氏染色鏡檢，在各臟器中均能見到革蘭氏陰性短桿菌。懸滴法檢查運(yùn)動力，運(yùn)動力活潑。

1.2.2 分離培養(yǎng) 采取病死梅花鹿肝、肺分別接種于普通瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、伊紅美蘭瓊脂平板、血瓊脂平板，置37℃溫箱培養(yǎng)24 h。從普通瓊脂平板上挑取單個(gè)可疑菌落移植至普通斜面進(jìn)行純培養(yǎng)。

1.2.3 生化試驗(yàn) 將上述分得的菌株分別進(jìn)行糖醇類代謝試驗(yàn)、氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗(yàn)、有機(jī)酸鹽和胺鹽利用試驗(yàn)。

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 根據(jù)美國臨床標(biāo)準(zhǔn)委員會(NCCLS)推薦的K-B瓊脂法進(jìn)行，觀察大腸桿菌在體外對麥迪霉素、阿米卡星、米諾環(huán)素、左氧氟沙星、克林霉素、氨曲南、頭孢西丁、頭孢哌酮8種不同藥物的敏感性。

1.2.5 動物接種試驗(yàn) 將分離到的菌株接種于普通肉湯，置37℃溫箱培養(yǎng)24 h，吸取菌液分別采取皮下、腹腔注射于小白鼠0.3 mL/只，并設(shè)立對照組。

1.2.6 分子生物學(xué)試驗(yàn) (1)16S rRNA基因組提取 將經(jīng)純培養(yǎng)得到的菌株接種于LB肉湯中，置37℃溫箱培養(yǎng)24 h，吸取1 mL菌液置于1.5ML Eppendorf管中，使用Pormega公司基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，將提取的基因組DNA置于-20℃保存。(2)PCR預(yù)擴(kuò)增 利用引物擴(kuò)增已提取基因組DNA。引物序列：上游引物：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG;下游引物：TACGGCTACCTTGTTACGACTT。反應(yīng)體系為25 μL：預(yù)混酶12.5 μL，上游引物 1 μL，下游引物 1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL；擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠)電泳，觀察是否出現(xiàn)目的條帶。(3)PCR擴(kuò)增及膠回收 取基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠)電泳后，切下目的條帶進(jìn)行膠回收。擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μL：其中預(yù)混酶25 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 22 μL；擴(kuò)增條件同預(yù)擴(kuò)增條件。膠回收按照Promega公司膠回收試劑盒步驟進(jìn)行。(4)pGEM-T載體連接 膠回收產(chǎn)物與pGEM-T載體進(jìn)行連接。連接體系為10 μL：其中T4DNA連接酶快速連接緩沖液5 μL，pGEM-T載體1 μL，膠回收產(chǎn)物2 μL，T4DNA連接酶1 μL，去離子水1 μL，4℃孵育過夜。(5)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 按照下列Promega公司pGEM-T載體連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化步驟進(jìn)行。①離心時(shí)連接反應(yīng)內(nèi)容物匯集到管底，取2 μL連接產(chǎn)物加到置于冰上的1.5 μL離心管中。② 將凍存的JM109高效率感受態(tài)細(xì)胞從-70℃冰箱取出，放置在冰浴直至融化(大概5 分鐘)，輕輕振動離心管使之混勻。③ 向已加入連接反應(yīng)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化管中加入50 μL感受態(tài)細(xì)胞。④ 輕輕振動小管混勻，冰浴20 min。⑤ 在精確的42℃水浴中熱擊45～50 s(不要振動)。⑥ 迅速將管子移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻2 min。⑦ 每管連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞中加入平衡至室溫的950 μL SOC培養(yǎng)基。⑧ 在37℃振蕩培養(yǎng)(150 rpm)1.5 h。⑨ 將轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基100 μL涂到LB/氨芐/IPTG/X-Gal平板上。⑩將平板于37℃過夜培養(yǎng)(16～24 h)。(6)陽性重組質(zhì)粒的鑒定 挑取平板中的白斑(陽性)于LB肉湯中置于37℃搖床中過夜培養(yǎng)；吸取菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件均同PCR預(yù)擴(kuò)增條件；PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠)電泳，觀察是否出現(xiàn)目的條帶。(7)測序 若電泳檢測出現(xiàn)目的條帶，說明連接轉(zhuǎn)化成功，即吸取1mL菌液置于1.5 mL Eppendorf管于中送生物公司測序。(8)序列分析 將生物公司測序后的序列經(jīng)BLAST比對后得到序列比對結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 細(xì)菌培養(yǎng)特性 普通肉湯呈渾濁生長，少量絮狀沉淀，振易散，普通瓊脂平板上菌落呈透明圓形，光滑濕潤，邊緣整齊，輕度隆起，菌落大小約2～3 mm；麥康凱瓊脂平板上呈光滑濕潤，邊緣整齊的紅色小菌落；伊紅美蘭瓊脂平板上呈黑色帶金屬光澤的菌落；血瓊脂平板上菌落呈圓形濕潤，且不溶血。

2.1.2 生化試驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)細(xì)菌染色、培養(yǎng)特性、生化試驗(yàn)等初步確診為大腸桿菌(見表1)。

表1 生化試驗(yàn)結(jié)果

注：+：陽性；-：陰性；

2.1.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.1.4 動物接種試驗(yàn)結(jié)果

表3 動物接種試驗(yàn)結(jié)果

取死亡小鼠肝、脾組織接種于普通瓊脂平板均分離到原感染細(xì)菌，涂片鏡檢為革蘭氏陰性短桿菌(見圖1)。

圖1 革蘭氏染色， 1000×

2.1.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠)電泳后，得到約1500bp的目的條帶(見圖2)。

2.1.5 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后電泳結(jié)果 連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化后挑取白斑接種于LB肉湯中，置于37℃搖床過夜培養(yǎng)。吸取菌液經(jīng)1%瓊脂糖凝膠(含溴乙錠)電泳后，觀察有明顯的約1500bp的目的條帶。說明載體連接成功(圖3)。

1：PCR擴(kuò)增結(jié)果；M：DL-2000 DNA Marker

1：1號白斑擴(kuò)增結(jié)果；2:2號白斑擴(kuò)增結(jié)果；M：DL-5000 DNA Marker

2.1.6 測序結(jié)果

序列比對結(jié)果表明此序列同大腸桿菌序列同源性為99%。

3 討論

隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，細(xì)菌性疾病對養(yǎng)殖業(yè)的影響越來越嚴(yán)重，及時(shí)檢測出致病原因并采取相應(yīng)措施對養(yǎng)殖戶來說至關(guān)重要。本事驗(yàn)旨在對病死梅花鹿內(nèi)臟組織進(jìn)行細(xì)菌學(xué)試驗(yàn)及分子生物學(xué)試驗(yàn)，快速有效的檢測出其致死原因以便提出相應(yīng)的預(yù)防及治療方案。

本試驗(yàn)較全面的從細(xì)菌形態(tài)及培養(yǎng)特性觀察、生化試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)、致病性檢測以及分子生物學(xué)試驗(yàn)五個(gè)方面對病死梅花鹿內(nèi)臟組織進(jìn)行檢測，且根據(jù)大腸桿菌致病特點(diǎn)及養(yǎng)殖戶對病死梅花鹿臨床特征的描述，最終確定引起梅花鹿死亡的原因?yàn)榇竽c桿菌。

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Isolation and Identification of \%Escherichia coli \%from Dead Sika

SONG De-hua

(LintaoAgriculturalSchool,DingxiGansu730500China)

Pathological samples of dead sika was collected from a farm of Tianzhu, pathogenic bacterium was identified primitively by culturing isolated bacterial, observing morphology, identifying biological trait, medical sensitivity experiment and animal pathogenicity test. We extracted genomic DNA of the isolated strain, used primers for PCR amplification and got the expected gene fragment. Cutting the target band and proceeding gel extraction, production and pGEM-T was ligated and transformed. Finally, positive blot was picked and cultured in LB-Broth-Medium. Combined the result of bacteriological experiment and the result of biology company sequenced, \%Escherichia coli \%was identified finally, and there are some omnibus control measures was adopted on the basis of result.

Sika; \%Escherichia coli;\% isolation; identification

2016-04-12

宋得華 (1978-)，男，甘肅臨洮人，本科，從事獸醫(yī)臨床工作與研究。電子郵件：westdotianqihui@163.com。

S 855.1+2

A

1004-6704(2016)06-0051-04