劉培林，王慧建，劉霄龍，陳書愛，張建鋒濮陽(yáng)市人民醫(yī)院骨科，河南濮陽(yáng)　457000

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骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在兔DBM上增殖作用的研究

劉培林，王慧建，劉霄龍，陳書愛，張建鋒
濮陽(yáng)市人民醫(yī)院骨科，河南濮陽(yáng)457000

[摘要]目的分析骨髓機(jī)制干細(xì)胞在兔DBM上增殖作用。方法2014年3月—2015年7月，以3只大白兔為研究對(duì)象，根據(jù)Urist方法制備出DBM（同種脫鈣骨基質(zhì)），測(cè)定光密度（OD）值，繪制增殖曲線，分析復(fù)合培養(yǎng)后最佳修復(fù)軟骨移植時(shí)機(jī)。結(jié)果SEM觀察呈現(xiàn)高密度空隙網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，平均孔隙率為（60.19±6.1）%；平均孔徑大小為（119.42±6.46）μm；兔DBM材料BMSCs體外復(fù)合培養(yǎng)后可見大量骨髓基質(zhì)干細(xì)胞粘附，MTT法檢測(cè)復(fù)合培養(yǎng)6d骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。結(jié)論兔脫鈣骨基質(zhì)具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和良好的細(xì)胞相容性是一種較好的軟骨組織工程支架材料，最適合移植。

[關(guān)鍵詞]脫鈣骨基質(zhì)；組織工程；支架材料；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

軟骨的再生和修復(fù)能力極其有限，一旦損傷很難自行修復(fù)，組織工程學(xué)位解決這一難題提供了新途徑[1]。種子細(xì)胞、支架材料等在組織工程中起到核心作用[2]，BMSCs是一種多功能細(xì)胞，在特定培養(yǎng)條件下可分化為成軟骨、成骨等多種細(xì)胞[3]，目前被認(rèn)為屬于最佳種子細(xì)胞。為探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與同種異體脫鈣骨基質(zhì)共同培養(yǎng)，2014年3月—2015年7月以3只大白兔為研究對(duì)象，觀察BMSCs的生長(zhǎng)情況及DBM的生物相容性，以兔為研究對(duì)象，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

選擇成年新西蘭大白兔（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所中心）3只，雌雄不限，體重約12～15 kg。

主要試劑包括GIBCO公司提供L-DMEM、胎牛血清，主要儀器包括AMRESCO公司提供MTT、DMSO，美國(guó)OlympusIX71提供倒置相差顯微鏡，以及法國(guó)產(chǎn)飛利浦XL30ESEM提供掃描電鏡。

1.2DBM的制備

實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格依照《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》要求。由市場(chǎng)購(gòu)買家兔新鮮肩胛骨，取其松質(zhì)骨，制備成圓餅形狀，乙醇浸泡30 min，風(fēng)干后備用。

1.3BMSCs的分離和培養(yǎng)

取新西蘭大白兔3只經(jīng)耳緣靜脈，戊巴比妥麻醉，雙側(cè)髂嵴脫毛。雙側(cè)髂嵴穿刺，抽取骨髓，加入LDMEM培養(yǎng)基，混勻后，培養(yǎng)24 h后換液，觀察其生長(zhǎng)情況。原代細(xì)胞融合達(dá)到80%～90%，接種進(jìn)入傳代培養(yǎng)，第3代細(xì)胞進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.4DBM結(jié)構(gòu)觀察

取6塊DBM，固定漂洗脫水，保存過夜，干燥，定向粘附于載物臺(tái)上觀察。

用掃描電鏡觀察DBM的表面結(jié)構(gòu)。每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)取10幅照片，計(jì)算平均孔徑大小（Image J軟件的Measure功能）和孔隙率（CS6軟件的直方圖（histogram）功能）?？障睹娣e采用像素（Pixel）表示，孔隙率=（整個(gè)照片的像素-骨小梁占的像素）÷整個(gè)照片的像素[4]。

1.5BMSCs與DBM體外復(fù)合培養(yǎng)及掃描電鏡觀察

取DBM若干塊、再取6塊24孔培養(yǎng)板，分為2組，BMSCs為A組：各板放置DBM材料，第3代BMSCs接種于24孔培養(yǎng)板的預(yù)濕材料上。B組做空白對(duì)照試驗(yàn)，每2 d更換液。觀察其生長(zhǎng)變化。隨后分別在第2、4、6、8、12天時(shí)加入MTT 100 μL,測(cè)定各孔光密度（OD）值,并繪制生長(zhǎng)曲線，電子顯微下觀察細(xì)胞粘附、增殖情況。

2　結(jié)果

2.1DBM的結(jié)構(gòu)觀察

DBM支架材料肉眼可見呈現(xiàn)白色海綿狀，表面多孔，孔隙大小不一，相互連接，布滿網(wǎng)狀結(jié)果，軟件測(cè)定平均孔隙率為（60.19±6.1）%；平均孔徑大小為（119.42± 6.46）μm。

2.2倒置相差顯微鏡及SEM的觀察

倒置相差顯微鏡觀察可見A組1 h后細(xì)胞開始貼壁，48 h開始增殖。DBM周圍存在大量細(xì)胞，培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)數(shù)量逐漸增多。SEM觀察，A組培養(yǎng)2 d DBM細(xì)胞大量生長(zhǎng)，鋪滿表面，呈長(zhǎng)梭形狀，培養(yǎng)6 d細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞相互交叉重疊（圖1）。B組孔隙相互交通，呈現(xiàn)蜂窩孔隙狀結(jié)構(gòu)（圖2）。

圖1　A組培養(yǎng)6 d時(shí)SEM觀察

圖2　B組培養(yǎng)6 d時(shí)SEM觀察

2.3繪制BMSCs在DBM上的生長(zhǎng)曲線繪制

分別在第2、4、6、8、10、12天測(cè)定OD值，在培養(yǎng)6 d時(shí)，增殖穩(wěn)定，A組在6d達(dá)到最高，生長(zhǎng)停滯，然后細(xì)胞強(qiáng)度下降，見表1。

表1　OD值變化

3　討論

BMSCs來源廣泛，體外培養(yǎng)時(shí)增殖能力強(qiáng)，一直被認(rèn)為是軟骨組織工程有前途的種子細(xì)胞。DBM是目前研究的比較熱門的一種骨組織工程材料，大量研究結(jié)果證實(shí)DBM可應(yīng)用于軟骨缺損修復(fù)。DBM是同種異體骨通過脫鈣、脫脂、處理得到，去掉了礦物質(zhì)、脂質(zhì)成分同時(shí)保留了骨基質(zhì)中以骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）為主的具有誘導(dǎo)軟骨形成作用以及膠原[5]。

在組織工程中，種子細(xì)胞和復(fù)合體屬于核心環(huán)節(jié)，近幾年生物材料相容性研究中多采用體外細(xì)胞培養(yǎng)，檢測(cè)增殖情況方法[6]。培養(yǎng)BMSCs和支架材料體外復(fù)合體得到軟骨，復(fù)合時(shí)機(jī)是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，時(shí)間過早，移植后容易被沖走，減少?gòu)?fù)合體數(shù)量。時(shí)間過晚，細(xì)胞活性大大降低，難以形成軟骨組織。形成生物材料復(fù)合物后，移植到缺損部位，形成有功能組織，達(dá)到修復(fù)組織效果。在該組分析中，采用掃描電鏡發(fā)現(xiàn)，DBM上細(xì)胞具有很好的伸展、增殖，細(xì)胞突起交錯(cuò)，雖然DBM存在部分不足，但是不會(huì)影響細(xì)胞增長(zhǎng)，符合軟骨工程支架材料要求。

該組制備DBM中參照Urist MR[7-8]試驗(yàn)方法，通過檢測(cè)結(jié)果顯示孔隙相互交通，平均孔隙率為（60.19± 6.1）%；平均孔徑大小為（119.42±6.46）μm，能夠提供足

夠的內(nèi)表面積和空間，有利于細(xì)胞增殖，并且具有一定的力學(xué)強(qiáng)度[9]。祝聯(lián)等人[10]在分析骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與珊瑚復(fù)合物體內(nèi)移植時(shí)間中認(rèn)為培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)相應(yīng)降低細(xì)胞功能。在該組分析中，測(cè)定種子細(xì)胞增殖穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)間，結(jié)果表明A組DBM上在第6天時(shí)細(xì)胞增殖達(dá)高峰，所以我們認(rèn)為第6天時(shí)是有利于軟骨缺損的最佳時(shí)機(jī)。

綜上，兔脫鈣骨基質(zhì)具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和良好的細(xì)胞相容性是一種較好的軟骨組織工程支架材料，DBM與BMSCs復(fù)合培養(yǎng)6d，BMSCs增殖達(dá)到穩(wěn)定，最適合移植。兔DBM支架材料解決了熱弄合成孔徑大小等問題，保持良好的生物相容性，具有很大應(yīng)用前景，能夠?yàn)橄乱徊疥P(guān)節(jié)腔內(nèi)軟骨缺損移植和臨床提供研究依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

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[10]祝聯(lián)，周廣東，陳付國(guó)，等.骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與珊瑚復(fù)合物體內(nèi)移植時(shí)間的研究[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2004，21（l: 10-13.

臨床醫(yī)學(xué)

Analysis of Value-added Function of Bone Marrow Stromal Stem Cells in Rabbit DBM

LIU Pei-lin,WANG Hui-jian,LIU Xiao-long,CHEN Shu-ai,ZHANG Jian-feng
Department of orthopedics,Puyang People's Hospital,Puyang,Henan Province,457000 China

[Abstract]Objective To analyze the value-added function of bone marrow stromal stem cells in rabbit DBM.Methods From March 2014 to July 2015,3 big white rabbits were selected as the research object,DBM（demineralized allogeneic bone matrix）was prepared according to the Urist method,the optical density（OD）value was detected,the value-added curve was drawn and the best repair cartilage transplantation after compound culture was analyzed.Results High density space truss structure was presented by SEM observation,the average porosity was（60.19±6.1）%and the average pore diameter size was（119.42±6.46）μm,a large number of bone marrow stromal stem cells adhesion was seen on the rabbit DBM materials after BMSCs compound culture in vitro,the value-added of bone marrow stromal stem cells?reached a steady state after 6d of compound culture by the detection of MTT method.Conclusion Rabbit DBM has a three-dimensional network structure and good cell compatibility,which is a good cartilage tissue engineering scaffold material and most suitable for transplantation.

[Key words]Decalcified bone matrix;Tissue engineering;Scaffold material;Bone marrow derived mesenchymal stem cell

[中圖分類號(hào)]R318.1

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1674-0742（2016）01（c）-0053-03

DOI：10.16662/j.cnki.1674-0742.2016.03.053

[作者簡(jiǎn)介]劉培林（1968-），男，河南濮陽(yáng)人，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事骨科工作。

收稿日期：（2015-10-23）