騫蕾陽(yáng),周志軍,常巖林

(河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北省無(wú)脊椎動(dòng)物系統(tǒng)學(xué)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北保定　071002)

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新型基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)研究現(xiàn)狀

騫蕾陽(yáng),周志軍,常巖林

(河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北省無(wú)脊椎動(dòng)物系統(tǒng)學(xué)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北保定071002)

摘要：規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列及其相關(guān)系統(tǒng)(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated,CRISPR/Cas system)是細(xì)菌和古細(xì)菌防御外來(lái)噬菌體、質(zhì)?；蚱渌庠碊NA侵染的獲得性免疫系統(tǒng).依據(jù)Cas蛋白種類和同源性,CRISPR/Cas系統(tǒng)被分為3類,其中,Ⅰ類和Ⅲ類需要多種Cas蛋白參與,而Ⅱ類系統(tǒng),即CRISPR/Cas9組成簡(jiǎn)單,僅需Cas9蛋白參與即可.經(jīng)過(guò)遺傳工程改造后的CRISPR/Cas9已經(jīng)作為一種新型的基因編輯工具被用于多種生物的基因組編輯.本文就CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)、結(jié)構(gòu)組成、作用機(jī)制、研究現(xiàn)狀、面臨的困境及應(yīng)用前景等幾方面進(jìn)行了總結(jié).

關(guān)鍵詞：基因編輯；CRISPR/Cas9系統(tǒng)；CRISPR干擾；干擾機(jī)制；基因治療

基因編輯(gene editing)技術(shù)是指在基因組水平進(jìn)行基因定點(diǎn)插入/缺失突變、敲除、多位點(diǎn)同時(shí)突變和小片段刪除等精確操作的技術(shù).目前,已報(bào)道的基因編輯技術(shù)包括鋅指核酸酶(zinc-finger nucleases,ZFN)[1-2]、類轉(zhuǎn)錄激活因子核酸酶(transcription activator like effector nucleases,TALEN)[3-6]和新近興起的CRISPR/Cas9[7-9],3種核酸內(nèi)切酶都可以特異性識(shí)別、切割靶DNA序列,引起DNA雙鏈斷裂(DSB).其中,ZFN與TALEN復(fù)合體由多個(gè)酶亞基組成,分別執(zhí)行靶DNA序列識(shí)別與內(nèi)切活性.ZFN和TALEN技術(shù)都需要針對(duì)不同靶DNA序列重新構(gòu)建切割工程酶,任務(wù)繁重且容易出錯(cuò).CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一種新興的基因編輯技術(shù),僅由CRISPR-derived RNA(crRNA)、反式激活crRNA(trans-activating crRNA,tracrRNA)和Cas9核酸內(nèi)切酶3個(gè)元件組成[10],依靠簡(jiǎn)單的向?qū)NA(single-guide RNA,sgRNA)實(shí)現(xiàn)靶DNA序列識(shí)別,可以通過(guò)對(duì)sgRNA進(jìn)行簡(jiǎn)單修改完成不同基因的靶向編輯[11-12].該系統(tǒng)目前已成功應(yīng)用于多種生物的基因組編輯,極大地促進(jìn)了功能基因研究[8]1266.本文就CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)、結(jié)構(gòu)組成、作用機(jī)制、研究現(xiàn)狀、面臨的困境及應(yīng)用前景等幾方面進(jìn)行了總結(jié).

1CRISPR/Cas系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)與結(jié)構(gòu)組成

規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列及其相關(guān)系統(tǒng)(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated,CRISPR/Cas system)[13]存在于大約50%的細(xì)菌和90%的古細(xì)菌基因組中[14],是細(xì)菌和古細(xì)菌抵御外來(lái)噬菌體、質(zhì)?；蚱渌苿?dòng)元件[15]侵染的獲得性免疫系統(tǒng)[14,16-20].CRISPR位點(diǎn)最早由Ishino等[21]在大腸桿菌Escherichiacoli堿性磷酸酶基因iap的側(cè)翼序列中發(fā)現(xiàn).Bult等[22]描述了產(chǎn)甲烷古細(xì)菌Methanocaldococcus(Methanococcus)jannaschii基因組中的18個(gè)CRISPR位點(diǎn).直至Jansen等[23]對(duì)40余種原核生物基因組中的CRISPR位點(diǎn)進(jìn)行描述后被正式命名.此后,多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)CRISPR中的間隔區(qū)(spacer)與侵染細(xì)菌的病毒、質(zhì)粒等外源核酸序列一致[24-26],Makarova等[27]提出CRISPR具有免疫防御作用的假說(shuō).Barrangou等[28]發(fā)現(xiàn)嗜熱乳酸鏈球菌Streptococcusthermophilus的CRISPR可以通過(guò)從侵染的噬菌體基因組上獲取新的間隔DNA序列,從而獲得對(duì)該噬菌體的特異性免疫能力.

CRISPR由1個(gè)前導(dǎo)序列(Leader)、多個(gè)短而保守的重復(fù)序列區(qū)(Repeat)和多個(gè)間隔區(qū)(Spacer)組成[27,29-31](圖1).Leader位于上游,沒(méi)有編碼活性,可能是CRISPR簇的啟動(dòng)子序列,具有物種特異性.不同系統(tǒng)的Repeats長(zhǎng)度為23～47 bp,在同一個(gè)CRISPR排列中,Repeats是高度保守的,而且在一些近緣種間也具有一定相似性[14].Spacers是噬菌體或質(zhì)粒侵入后留下的痕跡,從而賦予細(xì)胞獲得對(duì)相應(yīng)的噬菌體和質(zhì)粒的免疫防御能力.在同一個(gè)CRISPR排列中,位于2個(gè)Repeats之間的Spacers長(zhǎng)度相似,但序列不同[14-15,20].預(yù)測(cè)HaliangiumochraceumDSM 14365擁有最長(zhǎng)的CRISPR序列,587個(gè)Spacers僅2個(gè)相同[15].

圖1　 細(xì)菌及古細(xì)菌中CRISPR系統(tǒng)的基因座組成[8]1267Fig.1　 CRISPR loci in bacteria and archaea

cas基因位于CRISPR位點(diǎn)附近,主要編碼核酸酶和DNA解旋酶等切割修飾核酸的相關(guān)的Cas蛋白[14,32].Cas是基因組剪輯和基因調(diào)控的強(qiáng)有力工具[19].根據(jù)CRISPR/Cas系統(tǒng)中Cas蛋白的種類和同源性,可將CRISPR/Cas系統(tǒng)區(qū)分成Ⅰ～Ⅲ 3種類型[14-15,33],Ⅰ型系統(tǒng)在細(xì)菌和古細(xì)菌中都有發(fā)現(xiàn)；Ⅱ型系統(tǒng)僅在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)；Ⅲ型系統(tǒng)主要發(fā)現(xiàn)于古細(xì)菌和少數(shù)細(xì)菌之中.根據(jù)cas基因的遺傳信息以及所編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的多樣性,這3種類型可分為12種亞型.它們的保守中心包括cas1到cas6 6個(gè)基因,其中cas1和cas2 是3種CRISPR/Cas系統(tǒng)的共有基因[14,34],而cas3、cas9和cas10 是特定的“標(biāo)記”基因[32].cas1、cas2基因和Cas1蛋白對(duì)crRNA的生物合成以及靶向等與CRISPR相關(guān)的過(guò)程是不可缺少的.Cas1以序列獨(dú)立的方式緊緊結(jié)合于dsDNA,Cas1和 Cas2是金屬依賴性核酸內(nèi)切酶,Cas1能夠?qū)sDNA切割成短片段[32].多個(gè)CRISPR/Cas系統(tǒng)可共存于單個(gè)基因組,每套cas基因跟各自的CRISPR基因座功能相關(guān)[14].

2CRISPR/Cas9系統(tǒng)的免疫干擾機(jī)制及基因工程改造

目前,CRISPR/Cas9的研究最為深入,通過(guò)對(duì)SpyCas9 和AnaCas9 的結(jié)構(gòu)分析確定了Cas9酶家族的分子構(gòu)架,1個(gè)保守的結(jié)構(gòu)中心包含RuvC和HNH 2個(gè)結(jié)構(gòu)不同的核酶區(qū)域[33],分別負(fù)責(zé)切割目標(biāo)DNA的2條鏈,同時(shí)也包含識(shí)別5′-NGG或5′-NAG 等與原間隔區(qū)臨近基序(protospacer adjacent motif,PAM)[35-37]的結(jié)構(gòu).Cas9酶在apo狀態(tài)下接收并催化不活躍的構(gòu)象,DNA識(shí)別和切割也需要構(gòu)象激活[38].

CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用機(jī)制分為3個(gè)階段：間隔序列獲取,crRNA表達(dá)、加工和成熟,免疫干擾[32-34].當(dāng)噬菌體或質(zhì)粒首次侵染細(xì)菌或古細(xì)菌時(shí),Cas9核酸內(nèi)切酶通過(guò)PAM信號(hào)識(shí)別并切割靶向DNA序列[15,19,39],酶切產(chǎn)生的DNA短片段被插入到前導(dǎo)序列和第1個(gè)重復(fù)序列之間,并伴隨重復(fù)序列復(fù)制[40].當(dāng)該噬菌體或質(zhì)粒再次侵染細(xì)菌或古細(xì)菌時(shí),在前導(dǎo)序列調(diào)控下,CRISPR被轉(zhuǎn)錄生成crRNA前體(pre-crRNA),Cas操縱子上游與pre-crRNA重復(fù)序列互補(bǔ)的tracrRNA也被同時(shí)轉(zhuǎn)錄合成[41],tracrRNA能夠激發(fā)Cas9和雙鏈RNA特異性RNase Ⅲ核酸酶對(duì)pre-crRNA進(jìn)行加工,形成包含保守重復(fù)序列和間隔區(qū)的成熟crRNA[14,39,42].crRNA與tracrRNA通過(guò)堿基配對(duì)結(jié)合形成雙鏈RNA[42-43],并與Cas9結(jié)合形成復(fù)合體[44].該復(fù)合體識(shí)別并結(jié)合與crRNA互補(bǔ)的靶DNA序列,使其雙鏈解開(kāi)形成R-loop,Cas9的HNH核酶區(qū)識(shí)別、切割與crRNA配對(duì)的靶DNA互補(bǔ)鏈；而RuvC核酶區(qū)切割處于游離狀態(tài)的非互補(bǔ)鏈[19,29,44-45](圖2),最終在靶DNA中PAM上游3nt 處雙鏈斷裂(double strand broken,DSB).

圖2　CRISPR/Cas9免疫干擾示意[45]248　Fig.2　diagram of CRISPR/Cas9 immune interference

經(jīng)過(guò)遺傳工程改造的CRISPR/Cas9系統(tǒng)已作為一種新型的基因編輯工具被廣泛使用[46].該系統(tǒng)僅包括1個(gè)Cas9蛋白和1條sgRNA[47],其中,sgRNA由tracrRNA和crRNA融合形成.Cas9 蛋白作為核酸酶切割雙鏈DNA,而sgRNA則通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)決定靶序列的特異性,靶序列可以是DNA雙鏈的任意鏈.基因組中的靶DNA序列與crRNA存在約20 bp的互補(bǔ)配對(duì)區(qū),靶DNA序列3′末端的PAM(5′-NGG-3′)為Cas9識(shí)別位點(diǎn),不能包含在sgRNA之中,切割導(dǎo)致靶DNA雙鏈斷裂[37,48-49].雙鏈斷裂后的靶DNA通過(guò)HR或NHEJ途徑修復(fù),以NHEJ為主,該方式較HR出錯(cuò)率更高.修復(fù)過(guò)程將在靶DNA序列引入插入/缺失突變[35,50-51],修復(fù)完成后,CRISPR/Cas9系統(tǒng)將再次作用于那些沒(méi)有引入突變的靶DNA序列[11].利用載體,或通過(guò)與CPP(cell-penetrating peptide)連接/絡(luò)合的方式將Cas9蛋白和sgRNA導(dǎo)入受體細(xì)胞,或直接將編碼Cas9蛋白和sgRNA的mRNA注入受精卵等方法,快速生成靶向突變個(gè)體.CRISPR/Cas9系統(tǒng)在靶向編輯新的基因位點(diǎn)時(shí),無(wú)需重新構(gòu)建核酸內(nèi)切酶,僅需根據(jù)靶基因序列對(duì)sgRNA做少許修改即可,相比于其他基因組編輯技術(shù),靶向突變新基因位點(diǎn)的效率顯著提高[52].CRISPR/Cas9系統(tǒng)不僅可以靶向編輯單個(gè)基因,而且可以組合多條sgRNA同時(shí)完成多個(gè)基因位點(diǎn)的靶向編輯.Cong等[53]基于在細(xì)菌/古細(xì)菌基因組中CRISPR系統(tǒng)基因座的間隔序列排列形式,最先使用單一CRISPR/Cas9系統(tǒng)同時(shí)完成了EMX1和PVALB的靶向編輯,并利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)形成雙鏈斷裂完成了EMX1的大段刪除.Mali等[54]對(duì)人基因組中潛在的sgRNA資源進(jìn)行了估算,發(fā)現(xiàn)約190 kb獨(dú)特的sgRNA 可以靶向約40.5%外顯子.

3CRISPR/Cas9系統(tǒng)在介導(dǎo)基因敲除研究中的應(yīng)用

CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一種最新涌現(xiàn)的基因編輯工具,由于能夠完成RNA導(dǎo)向的DNA識(shí)別及編輯,為構(gòu)建更高效的基因定點(diǎn)修飾技術(shù)提供了全新平臺(tái).除在細(xì)菌中被廣泛使用之外,CRISPR/Cas9系統(tǒng)還被用于人、老鼠、斑馬魚(yú)、果蠅、酵母、線蟲(chóng)和農(nóng)作物細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)基因的刪除、插入、激活或抑制.

3.1CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物基因敲除研究中的應(yīng)用

CRISPR/Cas9系統(tǒng)已在擬南芥、煙草、水稻、玉米、高粱、小麥、甜橙和番茄等多個(gè)植物物種中得到了應(yīng)用.地錢(qián)Marchantiapolymorpha被認(rèn)為是研究陸生植物進(jìn)化的理想模型.Sugano等[55]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)地錢(qián)編碼生長(zhǎng)素應(yīng)答因子1(ARF1)進(jìn)行了定點(diǎn)突變.在該項(xiàng)研究中,地錢(qián)的U6啟動(dòng)子(MpU6-1pro)被用于構(gòu)建針對(duì)ARF1基因設(shè)計(jì)sgRNA序列的表達(dá)載體；而經(jīng)人類密碼子優(yōu)化后的hCas9則被35Spro或自身MpEFpro驅(qū)動(dòng)過(guò)表達(dá).利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將含有hCas9和sgRNA的表達(dá)載體導(dǎo)入地錢(qián)萌芽孢子.通過(guò)1-萘乙酸(NAA)和潮霉素篩選hCas9和sgRNA同時(shí)表達(dá)的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞,并通過(guò)RFLP多態(tài)性分析最終證實(shí)在NAA中存活的地錢(qián)ARF1靶位點(diǎn)存在突變.Feng等[56]利用農(nóng)桿菌侵染方法穩(wěn)定轉(zhuǎn)化擬南芥和水稻,除SPP sgRNA1僅5%之外,突變效率達(dá)26%～84%.Zhang等[57]將CRISPR/Cas9系統(tǒng)用于水稻riceoutermostcell-specificgene5(ROC5),stromalprocessingpeptidase(SPP) 和youngseedlingalbino(YSA)基因編輯.針對(duì)上述目的基因設(shè)計(jì)sgRNA,使用水稻自身的U6RNAs啟動(dòng)子表達(dá)sgRNA.使用的hSpCas9優(yōu)化編碼序列由CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng).為提高轉(zhuǎn)運(yùn)效率,sgRNA和hSpCas9被亞克隆到同一表達(dá)載體中,通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入水稻組織培養(yǎng)中[56].被編輯的基因能夠傳遞到下一代,在第1代水稻中出現(xiàn)了所編輯的目標(biāo)基因的純合體.表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以有效地誘導(dǎo)水稻中目標(biāo)基因的編輯.Zhou 等[35]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在水稻原生質(zhì)體中實(shí)現(xiàn)115～245 kb 長(zhǎng)染色體大片段(包含2～3 個(gè)不同的基因簇)刪除.

3.2CRISPR/Cas9系統(tǒng)在構(gòu)建人類疾病動(dòng)物模型中的應(yīng)用

人類疾病動(dòng)物模型對(duì)病理研究及臨床治療非常重要.CRISPR/Cas9系統(tǒng)是繼鋅指核酸酶(ZFN)、ES 細(xì)胞打靶和 TALEN 等技術(shù)后,又一種可用于定點(diǎn)構(gòu)建基因敲除大、小鼠動(dòng)物的方法,且有效率高、速度快、生殖系轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)及簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn),在許多人類重要疾病動(dòng)物模型構(gòu)建的應(yīng)用前景非常廣闊.Li等[58]使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建了Uhrf2基因敲除小鼠模型,Mc3R和Mc4R雙基因敲除的大鼠和小鼠模型.研究結(jié)果證明通過(guò)向小鼠受精卵中注射編碼CRISPR-Cas系統(tǒng)的mRNA比DNA在胚胎中產(chǎn)生定點(diǎn)突變的效率更高；且不受小鼠遺傳品系限制,能夠?qū)蚪M的大片段DNA進(jìn)行刪除；同時(shí)注射針對(duì)不同基因設(shè)計(jì)的sgRNA序列能夠在同一只小鼠(或大鼠)中產(chǎn)生多個(gè)基因突變.

Yoshimi等[59]將Cas9 mRNA和靶向大鼠毛色相關(guān)的絡(luò)氨酸酶基因(Tyr)的sgRNA顯微注射入Wistar大鼠受精卵雄性原核,PCR擴(kuò)增分析發(fā)現(xiàn)41.2%的Tyr位點(diǎn)表現(xiàn)出大量插入/缺失突變.將Cas9-sgRNA處理后的2細(xì)胞期胚胎轉(zhuǎn)移到代孕母體中,幼鼠DNA序列分析發(fā)現(xiàn)Tyr位點(diǎn)都攜帶插入/缺失突變,并且Tyr位點(diǎn)都是雜合或嵌合式的,說(shuō)明Cas9-sgRNA介導(dǎo)的突變能夠穩(wěn)定地傳遞到下一代.將針對(duì)Tyrc基因的sgRNA、Cas9 mRNA和80 bp的TyrC等位基因的單鏈寡聚脫氧核糖核酸(single stranded oligodeo xynucleotide,ssODN)同時(shí)注入F344大鼠胚胎,結(jié)果發(fā)現(xiàn),7.7%的子代個(gè)體不再是白化皮毛,成為頭部有顏色的非刺鼠.序列分析發(fā)現(xiàn)23.1%的幼鼠的Tyr位點(diǎn)有插入缺失突變,7.7%的幼鼠有精確的單核苷酸多態(tài)性交換.

3.3CRISPR/Cas9系統(tǒng)在人細(xì)胞系基因組編輯中的應(yīng)用

Sakuma等[18]研究表明由Cas9和多個(gè)sgRNA 形成的復(fù)合CRISPR/Cas9系統(tǒng)可同時(shí)編輯多個(gè)靶基因,將經(jīng)過(guò)修改同時(shí)表達(dá)Cas9核酸酶和7個(gè)sgRNA的pX330導(dǎo)入人HEK293T細(xì)胞.PCR分析表明：同時(shí)表達(dá)7個(gè)sgRNA的復(fù)合CRISPR/Cas9系統(tǒng)的誘導(dǎo)突變效率與表達(dá)單個(gè)sgRNA的系統(tǒng)相同.Ramakrishna等[60]在Cas9 的C端添加了1個(gè)半胱氨酸Cys,通過(guò)Cys游離的SH殘基與轉(zhuǎn)膜肽(cell-penetrating peptide,CPP)第1個(gè)氨基形成硫醚鍵(4-maleimidobutyryl-4G9R4L,m9R)連接形成Cas9-m9R；sgRNA和9R(包含1個(gè)Cys,3個(gè)Gly,9個(gè)Arg,4個(gè) Leu和 1個(gè)Cys的CPP)在一定的比例下混合形成帶正電的納米粒子.通過(guò)將Cas9和sgRNA與CPP連接(或混合)促進(jìn)Cas9和sgRNA跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入人HEK293T細(xì)胞、HeLa細(xì)胞和 NCCIT細(xì)胞、皮膚纖細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞對(duì)CCR5基因進(jìn)行突變.

3.4CRISPR/Cas9系統(tǒng)在插入標(biāo)簽基因研究中的應(yīng)用

Cas9對(duì)DNA 雙鏈的切割分別由2個(gè)功能結(jié)構(gòu)域執(zhí)行,1個(gè)結(jié)構(gòu)域突變后的Cas9成為僅能切割DNA 1條鏈的切口酶,通過(guò)引入修復(fù)模板,以極低的突變活性完成同源定向修復(fù),顯著降低了Cas9 切割雙鏈引起的隨機(jī)突變概率[53].Zhang等[61]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)約氏瘧原蟲(chóng)絲氨酸蛋白酶基因Pysera1進(jìn)行編輯,構(gòu)建1個(gè)包含46 bp標(biāo)簽DNA的質(zhì)粒pYC-Pysera1,Pysera1的2個(gè)純合區(qū)域被此DNA序列隔開(kāi).針對(duì)Cas9-sgRNA介導(dǎo)的可能導(dǎo)致突變的靶位點(diǎn),設(shè)計(jì)了2個(gè)sgRNA靶向Pysera1外顯子2的3′端,形成質(zhì)粒pYC-sera1-sgRNA1和pYC-sera1-sgRNA2.通過(guò)電轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒導(dǎo)入P.yoelii17XNL菌株.親本17XNL和轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的約氏瘧原蟲(chóng)基因組DNA的PCR分析表明,在sgRNA1和sgRNA2的指導(dǎo)下,左右2個(gè)純合臂在特定位點(diǎn)成功融合.熒光蛋白或報(bào)告基因標(biāo)記技術(shù)常被用于研究蛋白質(zhì)亞細(xì)胞分布和相互作用,利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠在約氏瘧原蟲(chóng)內(nèi)源基因Py03652中插人熒光蛋白基因gfp,首先構(gòu)建pYC-Py03652-gfp,在Py03652基因開(kāi)放閱讀框的3′端(710 bp)與3′端非編碼區(qū)(779 bp)之間插入gfp基因.Py03652基因編碼早期的轉(zhuǎn)錄膜蛋白.針對(duì)需要插入的熒光蛋白基因,設(shè)計(jì)sgRNA,構(gòu)建載體pYC-Py03652-gfp-sgRNA.轉(zhuǎn)染后,獲得報(bào)告基因與Py03652基因3′末端融合的基因重組寄生蟲(chóng).通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選分析發(fā)現(xiàn),38%的細(xì)胞存在綠色熒光蛋白的表達(dá).

3.5CRISPR/Cas9系統(tǒng)在功能基因研究中的應(yīng)用

基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)發(fā)展而來(lái)的CRISPR干擾(CRISPRi)技術(shù)是一種新的、高度特異性的工具,該技術(shù)能夠在不改變DNA序列的情況下,通過(guò)阻遏轉(zhuǎn)錄的延伸和RNA聚合酶的結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)類似RNAi的效果[62].目前,CRISPRi技術(shù)已經(jīng)被成功地用于細(xì)菌、酵母、小鼠、人類等多種模式生物的功能基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究[19,62].通過(guò)突變使Cas9的2個(gè)核酶區(qū)域失活,形成可以與靶DNA結(jié)合但沒(méi)有核酶活性的缺陷Cas9(dCas9),dCas9在sgRNA的指導(dǎo)下與靶DNA啟動(dòng)子結(jié)合,特異性阻止RNA聚合酶與該啟動(dòng)子序列結(jié)合或作為轉(zhuǎn)錄終止子阻斷RNA聚合酶的繼續(xù)運(yùn)行[63].dCas9與sgRNA復(fù)合體靶向乳糖途徑的調(diào)控基因和結(jié)構(gòu)基因,能夠出現(xiàn)所需要的表型.利用該平臺(tái),在sgRNA的指導(dǎo)作用下,dCas9與轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)合位點(diǎn)相互作用能夠激活基因表達(dá).通過(guò)將特定的轉(zhuǎn)錄激活因子和抑制因子與Cas9復(fù)合體融合,能夠精確地激活或沉默基因表達(dá).如果對(duì)CRISPR轉(zhuǎn)錄因子(Cas9轉(zhuǎn)錄效應(yīng)物區(qū)域融合蛋白)和sgRNA重編程,能夠?qū)Π形稽c(diǎn)的基因表達(dá)產(chǎn)生預(yù)期的影響.順著基因啟動(dòng)子區(qū)域,利用多個(gè)sgRNA靶向多個(gè)位點(diǎn)能夠調(diào)節(jié)這種效果[63].在細(xì)菌細(xì)胞中,這種沉默可以逆轉(zhuǎn)且具有可誘導(dǎo)性和高度特異性,通過(guò)在sgRNA堿基配對(duì)區(qū)域引入1個(gè)或幾個(gè)錯(cuò)配堿基,或與基因不同區(qū)域靶向作用以調(diào)節(jié)抑制效率.多條sgRNA可以同時(shí)調(diào)控多個(gè)基因表達(dá),也可以協(xié)同地控制單個(gè)基因以加強(qiáng)抑制或調(diào)整基因表達(dá)的抑制水平[64].基因治療(gene therapy)指將外源正常基因?qū)氚屑?xì)胞,以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常引起的疾病,以達(dá)到治療目的.Gilbert等[65]利用CRISPRi技術(shù)抑制人HeLa細(xì)胞的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(CD71)和C-X-C趨化因子受體(CXCR4)基因表達(dá).針對(duì)靶基因編碼區(qū)雙鏈設(shè)計(jì)的10個(gè)sgRNA橫跨轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的上、下游500 bp,3/10的sgRNA抑制率達(dá)60%～80%,RNA 測(cè)序表明CRISPRi介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制具有很高的靶向特異性.Feng等[66]通過(guò)電轉(zhuǎn)化將綠色熒光蛋白融合表達(dá)載體U6sgRNA-Cas9-2A-GFP導(dǎo)入人骨肉瘤KHOS和U-2OS細(xì)胞系,結(jié)果顯示CRISPRi技術(shù)可以顯著抑制CDK11蛋白表達(dá).羅斌[67]發(fā)現(xiàn)CRISPRi技術(shù)可以下調(diào)人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中乳酸脫氫酶A(lactate dehydrogenase,LDHA)基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平,抑制癌細(xì)胞增殖.

4CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用的影響因素

4.1脫靶效應(yīng)

CRISPR/Cas9不僅靶向編輯目標(biāo)DNA位點(diǎn),而且也會(huì)切割那些與靶位點(diǎn)序列相同(或高度相似)的其他DNA位點(diǎn),使其產(chǎn)生突變,即脫靶效應(yīng)(off-target effect)[62].脫靶效應(yīng)是基于CRISPR/Cas9的基因編輯技術(shù)所面臨的最主要問(wèn)題.

首先,由于Cas9蛋白對(duì)sgRNA 5′端序列與靶位點(diǎn)間的錯(cuò)配不敏感,其脫靶風(fēng)險(xiǎn)較ZFN和TALEN方法更高.為了提高靶向特異性,研究人員通過(guò)點(diǎn)突變滅活核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域(RuvC-Ⅰ)構(gòu)建了1種僅切割靶DNA單條鏈的突變型Cas9蛋白(Cas9 D10A).為了形成靶DNA雙鏈斷裂,需要2條sgRNA同時(shí)引導(dǎo)Cas9 D10A識(shí)別并切割靶DNA雙鏈的相鄰位置.這種突變后的“雙切口酶”產(chǎn)生雙鏈斷裂效率和野生型Cas9相同,但由于2個(gè)sgRNA 具有加倍的識(shí)別序列長(zhǎng)度,因此可以極大降低脫靶突變,特異性提高50～1 500倍,顯著提高了靶位點(diǎn)的特異性[53-54,62-63].

其次,PAM序列也可影響CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯效率和特異性.CRISPR/Cas9作用于靶DNA序列,不僅依賴sgRNA的指導(dǎo),而且與入侵DNA序列中和crRNA靶序列連接的2～5 nt 的PAM序列有關(guān)[33].不同來(lái)源的Cas9蛋白識(shí)別不同的PAM序列,如：釀膿鏈球菌PAM為NGG,腦膜炎雙球菌的PAM為N-GGNG和 NNAGAAW[62].CRISPR/Cas9在基因組編輯中的特異性與Cas9蛋白識(shí)別的PAM序列長(zhǎng)度有關(guān).一般而言,CRISPR/Cas9脫靶突變率隨PAM序列增長(zhǎng)而降低,其原因主要是不同長(zhǎng)度的PAM序列在基因組中潛在的靶位點(diǎn)數(shù)目不同,如：PAM NGG和NAG在基因組中很可能每8 nt可以發(fā)現(xiàn)1個(gè)靶位點(diǎn),而NGGNG和NNAGAAW則分別要每32 nt和256 nt 才有1個(gè)靶位點(diǎn)[62].延長(zhǎng)PAM序列雖然能夠提高CRISPR/Cas9靶向特異性,但卻限制了靶DNA序列中潛在作用位點(diǎn)數(shù)目.在具體研究中,CRISPR/Cas9系統(tǒng)需要根據(jù)靶基因選擇不同的PAM.參考基因組數(shù)據(jù)將有助于合適的靶位點(diǎn)篩選.

再次,CRISPR/Cas9用量與脫靶效應(yīng)產(chǎn)生相關(guān),雖然減小sgRNA用量可以降低脫靶效應(yīng),但不利于靶基因斷裂.因此在高目標(biāo)效應(yīng)和低脫靶效應(yīng)之間存在一個(gè)最優(yōu)平衡點(diǎn),在實(shí)際應(yīng)用中需要進(jìn)行優(yōu)化.

最后,sgRNA在基因組中潛在互補(bǔ)位點(diǎn)多少與脫靶效應(yīng)有關(guān),每個(gè)基因都有成百上千的位點(diǎn)可以進(jìn)行編輯,通過(guò)選擇潛在互補(bǔ)位點(diǎn)少的區(qū)域設(shè)計(jì)合成sgRNA可以降低脫靶效應(yīng),提高CRISPR/Cas9特異性[62].通過(guò)優(yōu)化sgRNA 設(shè)計(jì)可以提高該系統(tǒng)的成功率和突變效率.為了尋找到最佳的基因組序列設(shè)計(jì)sgRNA,Hsu等[68]建立了一個(gè)Web版的、可以識(shí)別幾乎任何一個(gè)基因計(jì)算機(jī)模型幫助研究人員尋求最佳編輯位點(diǎn).Xiao等[69]報(bào)道了一個(gè)本地版的潛在脫靶位點(diǎn)分析軟件CasOT,該軟件包可以識(shí)別任意基因組或序列中的潛在脫靶位點(diǎn).

4.2sgRNA的設(shè)計(jì)合成和效率

sgRNA的指導(dǎo)效率是限制CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用的另一個(gè)重要因素.一些人工設(shè)計(jì)合成的sgRNA指導(dǎo)效率低下可能與靶DNA位點(diǎn)所處的染色質(zhì)狀態(tài)及sgRNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)等因素有關(guān)[62].RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄生成的mRNA需要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄后加工和修飾過(guò)程,mRNA形成后會(huì)被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì),而Cas9/sgRNA僅僅用于核基因組DNA,目前尚沒(méi)有找到使用RNA聚合酶Ⅱ生成sgRNA的方法.目前體內(nèi)生成sgRNA主要依賴RNA聚合酶Ⅲ、U3snRNA和U6snRNA啟動(dòng)子.由于U3snRNA和U6snRNA作為管家基因,在各種組織中均有表達(dá),無(wú)法特異性地在某種細(xì)胞和組織中產(chǎn)生sgRNA；而且對(duì)很多生物的U3和U6啟動(dòng)子都缺少研究,缺乏商業(yè)化的RNA聚合酶Ⅲ,都在一定程度上限制了基于U3和U6啟動(dòng)子生成sgRNA[62].Gao等[70]設(shè)計(jì)了1個(gè)可以被任何啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的人造基因RGR,該基因最初轉(zhuǎn)錄生成1個(gè)2端具有核酶序列的sgRNA分子,經(jīng)自我催化切割形成成熟的sgRNA分子,之后便可成功地誘導(dǎo)體外和酵母內(nèi)的序列特異性切割.這樣,如果選擇合適的啟動(dòng)子,就會(huì)允許細(xì)胞和組織特異性基因組編輯.Heigwer等[71]報(bào)道的Web版sgRNA設(shè)計(jì)軟件E-CRISP使用序列比對(duì)軟件Bowtie2可評(píng)估脫靶效應(yīng)和靶位點(diǎn)同源性.

4.3CRISPR/Cas9組件轉(zhuǎn)移方式有限

在利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因組靶DNA序列編輯時(shí),如何將Cas9蛋白和sgRNA轉(zhuǎn)運(yùn)至靶細(xì)胞中至關(guān)重要.通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(agrobacterium mediated transformation)使目的基因進(jìn)入植物細(xì)胞,并將其插入到植物細(xì)胞的染色體DNA上,使目的基因的遺傳特性得以穩(wěn)定維持和表達(dá),是將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞應(yīng)用最廣的方法[55].對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞而言,雖然可以通過(guò)顯微注射技術(shù)將Cas9蛋白和sgRNA,或表達(dá)Cas9蛋白和sgRNA的mRNA注射入靶細(xì)胞,但顯微注射每次只能注射1個(gè)細(xì)胞,而且不同類型的靶細(xì)胞和組織轉(zhuǎn)染效率差異顯著[62].Ramakrishna等[60]將Cas9和sgRNA與CPP連接導(dǎo)入人胚胎干細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、HEK293T細(xì)胞、HeLa細(xì)胞和胚胎癌細(xì)胞系.Wagner等[72],Jiang等[73]通過(guò)電轉(zhuǎn)化將編碼sgRNA和Cas9蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)了基因敲除,但電轉(zhuǎn)化效率要取決于細(xì)胞所處生長(zhǎng)期.Gilbert等[65]通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染將sgRNA和Cas9的表達(dá)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞.但慢病毒表達(dá)時(shí)間較慢,熒光表達(dá)所需時(shí)間較長(zhǎng).此外,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只能感染分裂期細(xì)胞,而且容量有限,腺病毒一般不能整合到染色體上,只能進(jìn)行瞬時(shí)感染.因此,在使用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯過(guò)程中仍然面臨可供選擇的范圍有限,今后需要進(jìn)一步加強(qiáng)新的轉(zhuǎn)運(yùn)工具開(kāi)發(fā)以提高轉(zhuǎn)運(yùn)效率.

5結(jié)語(yǔ)和展望

CRISPR/Cas9是繼ZFN和TALEN之后的第3代基因組編輯技術(shù).這些根據(jù)DNA切割酶,即核酸酶開(kāi)發(fā)的基因編輯技術(shù)針對(duì)特定靶基因訂制核酸酶難度極高,而CRISPR/Cas9系統(tǒng)的Cas蛋白不具有特異性,只需合成1個(gè)sgRNA即可實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的特異性編輯.盡管由于發(fā)現(xiàn)時(shí)間較短,在脫靶效應(yīng)、sgRNA設(shè)計(jì)以及組件轉(zhuǎn)運(yùn)等方面存在一些應(yīng)用瓶頸,但CRISPR/Cas9系統(tǒng)組成簡(jiǎn)單,操作方便,價(jià)格低廉,操作周期短,突變效率高,堪稱基因組編輯技術(shù)的一次非常重要的技術(shù)革新[74],在基礎(chǔ)理論研究、綜合生物學(xué)和基因治療等領(lǐng)域研究中具有不可估量的應(yīng)用前景[75].相信通過(guò)科研人員的不懈努力,CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)的效率和特異性都會(huì)進(jìn)一步提高,發(fā)展成為更可靠、方便的基因編輯工具[63],應(yīng)用于農(nóng)作物定向育種、快速闡明基因功能、構(gòu)建人類疾病動(dòng)物模型和基因治療(如血液病、腫瘤和其他遺傳疾病)等多個(gè)領(lǐng)域,快速對(duì)整個(gè)基因組進(jìn)行功能篩選,幫助人們鑒定涉及特定疾病的基因,更好地了解疾病以及開(kāi)發(fā)出新的治療方法,而CRISPR/Cas9 對(duì)誘導(dǎo)人多能干細(xì)胞的基因編輯和未來(lái)人類遺傳疾病的治療具有非常重要的應(yīng)用前景.

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(責(zé)任編輯：趙藏賞)

Research status of novel gene editing technology of CRISPR/Cas9 system

QIAN Leiyang,ZHOU Zhijun,CHANG Yanlin

(Key Laboratory of Invertebrate Systematics and Application of Hebei Province,College of Life Sciences,Hebei University,Baoding 071002,China)

Abstract：Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR) and associated proteins(Cas) comprise the CRISPR/Cas system,which confers adaptive immunity against foreign invading phages,plasmids and other mobile elements in many bacteria and most archaea.On the basis of the species and homology of the Cas protein,CRISPR/Cas systems have been classified into three distinct groups(type Ⅰ～Ⅲ).The component of type Ⅱ CRISPR/Cas9 system is the simplest one,and is well-charactered in resent study.CRISPR/Cas9 system modified by genetic engineering has proven to be an efficient gene-targeting tool in various organisms.Here,the auther review the discovery,components,molecular mechanism,applications,challenges and future prospect of CRISPR/Cas9-mediated genome editing.

Key words:gene editing;CRISPR/Cas9;CRISPRi;interference mechanism;gene therapy

DOI：10.3969/j.issn.1000-1565.2016.01.014

收稿日期：2015-07-02

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31471985);河北省高等學(xué)校青年拔尖人才計(jì)劃項(xiàng)目(BJ2014006)

通信作者：周志軍(1980—),男,山西長(zhǎng)治人,河北大學(xué)副教授,博士,主要從事昆蟲(chóng)分子系統(tǒng)進(jìn)化研究.

中圖分類號(hào)：Q789

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1000-1565(2016)01-0084-10

第一作者：騫蕾陽(yáng)(1990—),女,河北武安人,河北大學(xué)在讀碩士研究生. E-mail:qianleiyanghb@163.com

E-mail:zhijunzhou@163.com