梁小蕊，苗鳳萍，宋銀平,3，郭占勇，季乃云

(1.中國科學院煙臺海岸帶研究所，山東 煙臺 264003；2.海軍航空工程學院，山東 煙臺 264001；3.中國科學院大學，北京 100049)

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海藻內(nèi)生真菌棘孢木霉dl-34中的二萜和甾體化合物

梁小蕊1,2,3，苗鳳萍1，宋銀平1,3，郭占勇1，季乃云1

(1.中國科學院煙臺海岸帶研究所，山東 煙臺 264003；2.海軍航空工程學院，山東 煙臺 264001；3.中國科學院大學，北京 100049)

摘要：采用柱層析、薄層層析、高效液相色譜等方法，對一株海藻內(nèi)生真菌棘孢木霉dl-34的次級代謝產(chǎn)物進行分離純化，得到7個化合物。利用核磁共振、質(zhì)譜和紅外光譜對所得化合物的結構進行鑒定，并結合量子化學計算方法確定了化合物1和2的絕對構型。結果表明，化合物1是一個新的二萜對映體(+)-wickerol A，化合物2是已知的二萜化合物harziandione，化合物3～7是已知麥角甾醇衍生物。生物活性測試結果表明，化合物1、2都有鹵蟲致死活性，化合物1同時具有抗大腸埃希氏桿菌和金黃色葡萄球菌的活性。

關鍵詞：棘孢木霉；二萜；甾體；(+)-wickerol A；harziandione

木霉菌(Trichodermaspp.)是一類獨立生存的對植物病原菌具有拮抗作用的植物益生真菌，其中有一些可作為有效的農(nóng)業(yè)生物防治劑使用[1]。對木霉菌的研究主要集中于對其次生代謝產(chǎn)物進行分離和鑒定，現(xiàn)已得到了很多化合物，如倍半萜烯、二萜、甾體、肽類、二酮哌嗪、蒽醌類等[1]。近年來，海洋來源的木霉菌吸引了眾多天然產(chǎn)物研究者的目光，很多新的具有細胞毒性和抗菌活性的代謝產(chǎn)物被分離鑒定出來[2-5]。然而，很少有人注意到海洋藻類來源的木霉屬種類[6]，特別是棘孢木霉。作者從海洋褐藻馬尾藻中分離出一株棘孢木霉dl-34內(nèi)生真菌，對其次生代謝產(chǎn)物的化學成分進行研究，并測試了部分化合物的生物活性。

1實驗

1.1材料、試劑與儀器

200～300目硅膠粉、GF-254硅膠板，青島海洋化工有限公司；SephadexLH-20凝膠，瑞典烏普薩拉GEHealthcare公司。

除高效液相色譜用色譜級甲醇外，其余試劑均為分析純。

ChirascanCD型圓二色譜儀，英國光物理學有限公司；P-1020型旋光儀、FTIR4100型紅外光譜儀，日本JASCO公司；AvanceⅢ 500型超導核磁共振儀(TMS為內(nèi)標)，美國Bruker公司；AutospecPremierP776型質(zhì)譜儀，美國Waters公司；Agilent1260型高效液相色譜系統(tǒng)(EclipseSB-C18色譜柱，9.4mm×250mm，5μm)，美國Agilent技術有限公司。

1.2方法

1.2.1菌種鑒定與培養(yǎng)

2010年9月從大連海域采集海洋褐藻馬尾藻，對其表面進行消毒處理，從中分離出菌株棘孢木霉dl-34，經(jīng)基因測序，鑒定為Trichodermaasperellum。該序列已提交GenBank數(shù)據(jù)庫，序列號KR023953。菌株保存在中國科學院煙臺海岸帶研究所。

新鮮菌絲體采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)平板培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后在無菌操作下將菌絲體切成小塊，分別放入100個1 L的錐形瓶中，每個錐形瓶中加有300 mL菊芋葡萄糖液體培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基成分如下：菊芋浸出液500 mL·L-1，葡萄糖10 g·L-1，NaNO32 g·L-1，海水500 mL·L-1。室溫25 ℃靜置發(fā)酵30 d。

1.2.2發(fā)酵產(chǎn)物的分離與純化

將100個錐形瓶內(nèi)的菌絲體和發(fā)酵液進行過濾分離。發(fā)酵液用乙酸乙酯萃取，并在40 ℃下減壓蒸餾除掉溶劑，得到14.1 g粗提物。菌絲體干燥，磨成粉狀，用氯仿-甲醇(1∶1，體積比，下同)混合溶劑浸提，提取物再用乙酸乙酯和水萃取，最終得到44.1 g粗提物。用薄層層析(TLC)及高效液相色譜(HPLC)分析，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液和菌絲體的粗提物成分基本相同，因此將兩部分合并，得總粗提物58.2 g。

粗提物進行硅膠柱層析分離，采用石油醚-乙酸乙酯體系梯度洗脫，經(jīng)TLC檢測合并后得到22個組分。石油醚-乙酸乙酯(10∶1)洗脫得到的組分8經(jīng)凝膠Sephadex LH-20柱層析得到8-1和8-2兩個組分。組分8-1進一步用石油醚-乙酸乙酯(10∶1)體系過小硅膠柱得到化合物1(5.4 mg)，組分8-2用石油醚-乙酸乙酯(5∶1)體系過小硅膠柱得到化合物2(15.0 mg)。用石油醚-乙酸乙酯(2∶1)體系洗脫得到的組分13經(jīng)凝膠Sephadex LH-20柱層析(氯仿-甲醇，1∶1)，然后用制備薄層層析(石油醚-乙酸乙酯，2∶1)得到化合物3(3.8 mg)。組分14經(jīng)凝膠Sephadex LH-20柱層析(氯仿-甲醇，1∶1)、HPLC(甲醇-水，9∶1)得到化合物4(2.0 mg)。組分16經(jīng)凝膠Sephadex LH-20柱層析(氯仿-甲醇，1∶1)、HPLC(甲醇-水，9∶1)得到化合物5(4.0 mg)和6(2.7 mg)。組分19經(jīng)HPLC(甲醇-水，2∶3)得到化合物7(5.3 mg)。

1.2.3化合物的結構鑒定

采用IR、1HNMR、13CNMR、EIMS、HREIMS等技術對所得化合物的結構進行鑒定。

1.2.4化合物2和(-)-wickerol A的構象計算

化合物2和(-)-wickerol A的構象搜索用MarvinSketch軟件(2014)完成[7]，不考慮甲基和羥基的旋轉，化合物的幾何構型進一步用Gaussian 09軟件，在氣相條件下、B3LYP/6-31G(d)水平上進行優(yōu)化，得到?jīng)]有虛頻的、能量最低的穩(wěn)定構象[8]。然后采用含時密度泛函理論(TD-DFT)方法，在氣相條件下、B3LYP/6-31G(d)水平上對化合物2優(yōu)化后的構型進行ECD譜計算，圖譜用SpecDic軟件(sigma=0.3)繪制[9]?；衔?-)-wickerol A的比旋光度[α]D在氣相條件下用B3LYP/6-311++G(2d,2p)方法計算。

1.2.5化合物1和2的生物活性測試

參照文獻[6]方法測試化合物1和2對大腸埃希氏桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌活性以及鹵蟲致死活性。

2結果與討論

2.1化合物1～7的13CNMR數(shù)據(jù)(表1)

表1化合物1～7的13CNMR數(shù)據(jù)(125 MHz,δ)

Tab.1　13CNMR Data for compounds 1～7 (125 MHz,δ)

注：a溶劑為氘代丙酮，b溶劑為CDCl3，c溶劑為DMSO-d6。

2.2化合物1～7的結構鑒定

圖1　化合物2和(-)-wickerol A的能量最低構型

化合物2為白色粉末。1HNMR譜顯示有4個甲基單峰，δ：0.98(3H,s,H-17),1.00(3H,s,H-16),1.52(3H,s,H-19)和2.13(3H,s,H-20)；1個甲基雙重峰，δ1.12(3H,d,J=7.2 Hz,H-17)。13CNMR(表1)和DEPT譜顯示20個碳信號，其中5個甲基、5個亞甲基、3個次甲基和7個季碳信號；特別顯示出有2個羰基信號，包括一個共軛羰基δ197.8(C-11)。對上述波譜數(shù)據(jù)進行分析發(fā)現(xiàn)，化合物2是一個二萜化合物，有5個甲基、1個α，β不飽和羰基、1個不共軛羰基，與文獻[11-12]中的化合物harziandione有相同的NMR譜數(shù)據(jù)。為了確定化合物2的絕對構型，測定了其電子圓二色譜(ECD)，譜圖顯示在337 nm(n→π*躍遷)和292 nm(n→π*躍遷)處有2個正Cotton效應，在251 nm(π→π*躍遷)處有一個負Cotton效應。在337 nm和251 nm處的Cotton效應與文獻[6]中的化合物harzianone一致。292 nm處的Cotton效應是由C-3上非共軛的羰基引起的。在氣相條件下采用含時密度泛函理論方法，在B3LYP/6-31G(d)水平上計算了化合物2的ECD譜，如圖2所示。

圖2　化合物2的實驗及計算ECD譜

由圖2可知，計算數(shù)據(jù)與實驗數(shù)據(jù)符合得很好。因此，化合物2的絕對構型定為2S,5R,6R,13S和14S，與文獻[13-14]根據(jù)八區(qū)律推導的結果一致。化合物2的能量最低構型見圖1。

化合物3～7的1HNMR譜均顯示在δ0.5～1.1處有2個甲基單峰和4個甲基雙重峰，在δ3.7～4.1處有1個多重峰，可歸屬為甲氧基，在δ5.1～5.3處的兩個dd峰為反式乙烯基。13CNMR譜(表1)顯示除了化合物6有一個額外的甲氧基單峰，其它化合物的13CNMR譜均顯示28個碳信號。NMR數(shù)據(jù)顯示，化合物3～7是麥角甾醇的衍生物。與文獻NMR數(shù)據(jù)比對結果為，化合物3為過氧化麥角甾醇[15-16]，化合物4為5α，8α-表二氧化麥角甾-6,9(11),22E-三烯-3β-醇[15-17]，化合物5為(22E，24R)-麥角甾-7,22-二烯-6β-甲氧基-3β,5α-二醇[18]，化合物6為啤酒甾醇[16]，化合物7為5α,9α-三羥基麥角甾-7,22-二烯-6-酮[18-19]?；衔?～7的結構如圖3所示。

2.3化合物1和2的生物活性

化合物1和2是比較少見的二萜骨架，其抗菌活性和鹵蟲致死活性結果顯示，化合物1能夠抑制大腸埃希氏桿菌和金黃色葡萄球菌，抑菌圈直徑均為8.0 mm(濃度為每片30 μg)。從長枝木霉中分離出的harzianone對這兩種細菌表現(xiàn)出相似的抗菌活性[6]，但化合物2對這兩種細菌沒有抗菌活性。另一方面，化合物1和2都對鹵蟲和鹵蟲藻有致死活性，半致死濃度LC50值分別為12.0 μg·mL-1和38.2 μg·mL-1?；衔?比harzianone活性弱[6]。

圖3化合物1～7的結構

Fig. 3Structures of compounds 1～7

3結論

首次對海藻來源的棘孢木霉的次生代謝產(chǎn)物進行了研究，從海洋褐藻內(nèi)生真菌棘孢木霉dl-34中分離鑒定了2個二萜化合物和5個麥角甾醇衍生物，其中化合物1是具有罕見結構的新化合物。化合物1、2和(-)-wickerol A的絕對構型通過光譜技術和量子化學計算確定。生物活性測試結果表明，化合物1、2均具有鹵蟲致死活性，化合物1同時具有大腸埃希氏桿菌和金黃色葡萄球菌抗菌活性。棘孢木霉dl-34是首次報道的能夠產(chǎn)生wickerane和harziane二萜的木霉菌株。

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Diterpenes and Steroids from Marine Alga-EndophyticFungusTrichodermaAsperellumdl-34

LIANG Xiao-rui1,2,3,MIAO Feng-ping1,SONG Yin-ping1,3,GUO Zhan-yong1,JI Nai-yun1

(1.YantaiInstituteofCoastalZoneResearch,ChineseAcademyofSciences,Yantai264003,China；2.NavalAeronauticalEngineeringInstitute,Yantai264001,China；3.UniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing100049,China)

Abstract：The bioactive metabolites from a marine brown alga-endophytic Trichoderma asperellum strain (dl-34) were separated and purified by chromatography,TLC and HPLC.Seven kinds of compounds were obtained and their structures were identified by NMR,MS and IR.The absolute conformers of compound 1 and compound 2 were confirmed by quantum chemical calculations.Results showed that,compound 1 was (+)-wickerol A,a new diterpene antipode,and compound 2 was harziandione,a known diterpene,and compounds 3～7 were ergosterol derivatives.Bioactivity experimental results showed that,both compounds 1 and 2 exhibited lethal activity against Artemia salina,and compound 1 also showed antibacterial activity against Escherichia coli and Staphylococcus aureus.

Keywords：Trichoderma asperellum;diterpene;steroid;(+)-wickerol A;harziandione

收稿日期：2016-01-29

作者簡介：梁小蕊(1979-)，女，山東煙臺人，博士，副教授，研究方向：海洋天然產(chǎn)物化學，E-mail：xrliang@yic.ac.cn；通訊作者：季乃云，研究員，E-mail：nyji@yic.ac.cn。

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.05.008

中圖分類號：Q 58

文獻標識碼：A

文章編號：1672-5425(2016)05-0032-05