孟杰 張亮 張春煜

SLIT2在腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及意義

孟杰 張亮 張春煜

目的 探討神經(jīng)遷移蛋白SLIT2蛋白在腎癌中的表達(dá)及其臨床意義。方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測80例腎透明細(xì)胞癌及對應(yīng)的癌旁2cm腎組織中SLIT2蛋白的表達(dá)情況，結(jié)合臨床病例資料分析其臨床病理意義。結(jié)果 （1）在腎透明細(xì)胞癌組織及對應(yīng)的癌旁2cm腎組織中，SLIT2蛋白的陽性表達(dá)率分別為28.8%（23/80）和76.3%（61/80），組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；（2）SLIT2蛋白的表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌組織分級、腫瘤TNM分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），而與腎癌患者的性別、年齡，腫瘤大小無關(guān)。結(jié)論 研究結(jié)果支持SLIT2在腎癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了一定作用，檢測SLIT2蛋白的表達(dá)有助于判定腎透明細(xì)胞癌的生物學(xué)行為。

腎透明細(xì)胞癌；SLIT2；免疫組織化學(xué)

腎癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害人民生命健康，在腎癌的多種亞型中，以腎透明細(xì)胞癌最為常見，約占腎癌總數(shù)的70%～80%[1]。神經(jīng)遷移蛋白SLIT2是近年來發(fā)現(xiàn)的一個腫瘤相關(guān)因子，其在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中的表達(dá)及意義成為研究熱點。本實驗應(yīng)用免疫組化方法檢測了RCCC組織中SLIT2的蛋白表達(dá)情況，分析了 SLIT2的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源 收集遼河油田總醫(yī)院2011年1月～2014年12月間腎癌根治切除的病理標(biāo)本80例，經(jīng)病理醫(yī)師診斷，所有腎癌組織學(xué)類型均為腎透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌。所有患者術(shù)前未作放、化療，年齡31～83歲，中位年齡58歲。80例腎癌中，男50例，女30例；組織核分級：I級35例，II級23例，III級20例，Ⅳ級2例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者42例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者38例；按照國際抗癌聯(lián)盟（UICC）TNM分期：Ⅰ期30例，Ⅱ期16例，Ⅲ期28例，Ⅳ期6例，并取對應(yīng)的80例癌旁2cm腎臟組織，所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，分別做HE染色與免疫組化染色。

1.1.2 試劑 兔抗人單克隆anti-SLIT2抗體（稀釋濃度為1︰75）為武漢博士德公司產(chǎn)品；PV-9000免疫組化試劑盒、DAB顯色劑（購自中衫金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法 免疫組織化學(xué)染色

采用免疫組織化學(xué)PV-9000二步法。組織蠟塊4μm切片后放置70℃的烤箱內(nèi)烘干2h，然后進(jìn)行脫蠟脫水處理。滴加3% H2O230min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶?？乖邷馗邏簾嵝迯?fù)后（95℃～100℃），于室溫下自然冷卻，然后PBS沖洗3次，每次3min。滴加3%的過氧化氫溶液，完全覆蓋組織，室溫下封閉放置20min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，然后用PBS沖洗3次，每次3min。滴加一抗，4℃冰箱過夜；PBS液沖洗3min×3次，滴加試劑1（增強(qiáng)劑），37℃溫箱內(nèi)孵育40min；PBS液沖洗2min×3次，滴加試劑2（辣根酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG多聚體），37℃溫箱內(nèi)孵育30min；PBS液沖洗2min×3次，DAB顯色，蒸餾水沖洗、蘇木素復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。用已知陽性組織切片作為陽性對照，用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。

1.3 結(jié)果判定 SLIT2蛋白定位于胞漿（見圖1），參考相關(guān)文獻(xiàn)對其表達(dá)進(jìn)行評分[2]，以細(xì)胞漿中出現(xiàn)黃至棕黃色顆粒為陽性顯色，以染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例評定陽性表達(dá)。光鏡下每張切片中選取癌細(xì)胞較多的5個高倍視野，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞。染色強(qiáng)度分級如下：無著色為0，淡黃色為1，棕黃色為2，棕褐色為3；陽性細(xì)胞數(shù)分級為：無陽性細(xì)胞為0，陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為1，11%～50%為2，51%～75%為3，≥76%為4。兩項得分相乘結(jié)果≥3為陽性表達(dá)病例。

圖1 SLIT2在腎透明細(xì)胞癌中的陽性表達(dá)（PV法×200）

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。各組間率的比較使用χ2檢驗或校正的χ2檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SLIT2蛋白在腎透明細(xì)胞癌癌和癌旁2cm腎臟組織中的表達(dá)情況 在80例腎透明細(xì)胞癌標(biāo)本中，SLIT2蛋白的陽性表達(dá)率分別為28.8%，癌旁2cm腎臟組織中SLIT2蛋白陽性表達(dá)率為76.3%，2組間有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

2.2 SLIT2蛋白在腎透明細(xì)胞癌的表達(dá)情況及與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 腫瘤分級Ⅰ+Ⅱ組、腫瘤分期Ⅰ+Ⅱ組及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，SLIT2蛋白的表達(dá)量顯著增高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。而SLIT2蛋白的表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌患者的性別、年齡及腫瘤大小無關(guān)。見表2。

表1 SLIT2蛋白在腎透明細(xì)胞癌癌和癌旁2cm腎臟組織中的表達(dá)(n=80)

表2 SLIT2蛋白表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

SLIT是Nusslein Volhard等于1984年在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的分泌型的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，由膠質(zhì)細(xì)胞中線合成，后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)，在果蠅的中央神經(jīng)中也存在該蛋白。哺乳動物體內(nèi)的SLIT包含3種亞型即Slit1、Slit2、Slit3,均在神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá),后二者還存在于其他細(xì)胞中[3]。該基因位于染色體4p15.2上,SLIT2是一組相對分子量為170KD～190KD的細(xì)胞外分泌蛋白。目前SLIT2在腫瘤的研究尚處于探索階段，其對腫瘤的作用也存在爭議。一些研究顯示，SLIT2蛋白在多種腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)。黃小莉[4]等應(yīng)用組織芯片與免疫組化技術(shù)法檢測55例SCC、30例CINⅠ～Ⅱ級、30例CINⅢ級及20例NCE中Slit2蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，隨著宮頸病變惡性程度的提高，SLIT2蛋白的表達(dá)逐漸下降。Dong[5]等通過檢測卵巢癌組織中SLIT2甲基化的情況發(fā)現(xiàn)，與正常卵巢組織相比，卵巢癌組織中，SLIT2甲基化的頻率大大增多，使其在卵巢癌組織中蛋白表達(dá)減少，且該研究還發(fā)現(xiàn)，在早期卵巢癌中，這一現(xiàn)象便可檢測到，提示SLIT2甲基化可以成為檢測卵巢癌發(fā)生的標(biāo)志。Tseng[6]等通過對人類及動物的食道癌組織研究發(fā)現(xiàn)，SLIT2蛋白在食道癌組織中呈低表達(dá)，并與患者預(yù)后密切相關(guān)，提示該基因是一個腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子，并可作為判斷腫瘤患者預(yù)后的新指標(biāo)。然而，也有一些研究顯示出了相反的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)SLIT2在腫瘤組織中表達(dá)增加，提示該基因有促進(jìn)腫瘤生長的作用。王等對多種腫瘤組織中SLIT2蛋白進(jìn)行了檢測，如乳腺癌、腸癌、胃癌等，并與之正常組織相對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在這些惡性腫瘤中，SLIT2蛋白表達(dá)量增高[7]。Latil[8]等采用實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）對48例前列腺癌及7例正常前列腺組織進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在前列癌組織中SLIT1、SLIT2、SLIT3及其受體Robo的表達(dá)都增加。

應(yīng)用免疫組化方法檢測SLIT2蛋白在腎透明細(xì)胞癌組織及癌旁2cm腎臟組織中的表達(dá)情況，探討其在腎癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。實驗結(jié)果顯示，SLIT2蛋白在腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)顯著低于癌旁腎組織中的表達(dá)，提示SLIT2蛋白的表達(dá)缺失可能參與了腎癌的發(fā)生。Ma等[9]通過對腎癌的研究發(fā)現(xiàn)，相比于癌旁配對組織，腎癌中SLIT2蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)水平都顯著下降，甲基化特異性PCR顯示，SLIT2啟動子在腎癌發(fā)生甲基化的頻率大大增加，提示該基因在腎癌組織中由于發(fā)生甲基化，從而使其蛋白表達(dá)下調(diào)。此外，本試驗結(jié)果還顯示，SLIT2蛋白在腫瘤分級Ⅰ+Ⅱ級、腫瘤分期Ⅰ+Ⅱ期及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組表達(dá)量較腫瘤分級Ⅲ+Ⅳ級、腫瘤分期Ⅲ+Ⅳ期及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而SLIT2蛋白的表達(dá)與腎癌患者的性別、年齡、腫瘤大小無關(guān)。這些結(jié)果提示TSG101蛋白的表達(dá)降低可能促進(jìn)了腎癌的發(fā)生，這些結(jié)果也支持TSG101作為一個潛在的抑癌基因在腫瘤發(fā)生、發(fā)展了發(fā)揮了一定作用。

綜上所述，SLIT2基因與腎癌的惡性進(jìn)展有密切聯(lián)系，在其發(fā)展過程中起到重要作用。

[1] 李玉林． 病理學(xué)［M］．北京:人民衛(wèi)生出版社，2005：289．

[2] Mattern J，Koomagi R，Volm M．Biological characterization of Subgroupsof．Squamous cell lung carcinomas[J]．Clin cancer Res，1999，5(6):1459-1463．

[3] Georgas K,Burridge L,Smith K,et al.Assignment of the human slit homologue SLIT2 to human chromosome band4p15.2[J].Cytogenet Cell Genet,1999,86(3-4):246-247.

[4] 黃小莉，曲軍英.Slit2/Robo1在宮頸癌中的表達(dá)及意義[J].中國臨床藥理學(xué)雜志，2015,6(31):429-431.

[5] Dong R,Yu J,Pu H,et al.Frequent SLIT2 promoter methylation in the serum of patients with ovarian cancer［J］.J Int Med Res,2012,40(2):681-686.

[6] Tseng RC,Chang JM,Chen JH,et al.Deregulation of SLIT2-mediated Cdc42 activity is associated with esophageal cancer metastasis and poor prognosis[J].J Thorac Oncol,2015,10(1):189-198.

[7] Wang B,Xiao Y,Ding BB,et al.Induction of tumor angiogenesis by Slit-Robo signaling and inhibition of cancer growth by blocking Robo activity[J].Cancer Cell，2003;4(1):19-29.

[8] Latil A，Chene L，Cochant一Priollet B，et al.Quantification of expression of netrinsSlits and their receptors in human prostate tumors[J].Int J Cancer，2003;103(97):306.

[9] Ma WJ,Zhou Y,Lu D.Reduced expression of Slit2 in renal cell carcinoma[J].Medical Oncology,2013,31（1）：768.

Objective To investigate the expression and the clinical pathological significance of SLIT2 protein expressed in renal clear cell adenocarcinoma (RCCC). Methods The expression of SLIT2 proteins was detected by immunohistochemistry in 80 cases of renal clear cell adenocarcinoma and its adjacent 2cm tissues. Results (1) the SLIT2 positive rates of protein were 28.8% (23/80） and 76.3% (61/80) in renal clear cell adenocarcinoma and matched adjacent 2cm tissues respectively. Significant differences statistically were obtained between the group of renal clear cell adenocarcinoma and the group of adjacent 2cm tissues (P＜0.01). (2) Higher positive rates of SLIT2 protein was found in the group of tumor gradeⅠ+Ⅱ, TNM Ⅰ+Ⅱ and non-lymph node metastasis than that of in the group of tumor grade Ⅲ+Ⅳ, TNM Ⅲ+Ⅳ and lymph node metastasis (P＜0.05), but no significant differences statistically was obtained among the groups of gender age and tumor size. Conclusion It was suggested that SLIT2 might be contribute to the progression of renal clear cell carcinoma and investigation of the expression of SLIT2 proteins might be advantageous to the judgment of biological behaviors in the renal clear cell carcinoma.

Renal clear cell adenocarcinoma; SLIT2; Immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.9.004

遼寧 124010 遼河油田總醫(yī)院 (孟杰 張亮 張春煜)

張春煜 E-mail:2311418579@qq.com