晏華春+馬曉燕+依明?蘇來曼+劉紅嬌+韓煜茹+劉婷婷

摘要：以隨機采集的400只和田羊個體的血樣為材料，利用PCR-SSCP、DNA測序等技術研究分析和田羊KRT35基因的多態(tài)性，并與羊毛長度進行關聯(lián)分析。和田羊KRT35基因具有多態(tài)性，存在3種基因型，即AA、AB和BB，且處于Hardy-Weinberg非平衡狀態(tài)，多態(tài)信息含量（PIC）為0.366 3，屬于中度多態(tài)（0.5>PIC>0.25）。測序結果顯示，與原基因堿基序列相比，KRT35基因編碼區(qū)片段在RT35基因組c.122位置發(fā)生錯義突變T→C。關聯(lián)分析結果表明，和田羊不同基因型之間羊毛長度差異均不顯著。

關鍵詞：和田羊；KRT35基因；多態(tài)性；羊毛長度；關聯(lián)分析

中圖分類號： S826.2

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0028-03

和田羊作為和田地毯產(chǎn)業(yè)鏈中的重要環(huán)節(jié)，其羊毛品質的提高將直接促進地毯質量的全面提升，將有力支撐地方經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展。毛纖維具有高度的組織結構，其中毛纖維的90%是由角蛋白中間絲（keratin intermediate filament，KRT-IF）和角蛋白關聯(lián)蛋白（keratin-associated proteins，KAPs）構成[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，在美利奴羊中，KAP1.1、KAP1.3、K33等KAPs影響羊毛性狀和品質[3]，KAP1-4也影響羊毛性狀[4]，KRT27、KRT85、KRT35、KRT31、KRT38、KAP6.1和KAP4.3等影響毛囊分裂和毛囊結構[5]。遺傳因素涉及綿羊品種及其他重要功能基因，是影響綿羊經(jīng)濟性狀的基本因素[6-7]。所以很多學者普遍通過基因方面的研究，認為多基因對毛絨性狀影響較大，可能存在主效基因，因此當前的研究熱點主要是毛絨纖維的角蛋白中間絲和角蛋白關聯(lián)蛋白相關基因的研究。KRT35基因是角蛋白中間絲蛋白家族之一，本試驗選擇優(yōu)良的異質半粗毛短脂尾和田羊作研究對象，采用PCR、DNA測序等技術對和田羊KRT35基因進行多態(tài)性檢測，并和其對應的羊毛長度進行關聯(lián)性分析，主要為找到改善其羊毛長度分子標記位點，為新疆和田羊經(jīng)濟性狀的選育、品種資源的保存提供一定的遺傳學理論依據(jù)，從而達到對當?shù)剞r(nóng)牧民生活質量的提高。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗樣本的采集 本試驗選擇年齡、個體差異小，健康無病的新疆和田羊400只，作為試驗材料。采集血樣是和田羊頸部靜脈5 mL，用枸櫞酸鈉抗凝，置于-20 ℃長期凍存。

1.1.2 主要藥品和試劑 Taq DNA聚合酶、上下游引物、dNTPs、Marker、Tris平衡酚、6×Loading buffer、10×PCR buffer、EDTA、NaCl、Tris·HCl、SDS、無水乙醇、溴化乙錠、硼酸、二甲苯氰、過硫酸銨、溴酚藍、瓊脂糖、變性劑、聚丙烯酰胺、染色液、超純水。

1.1.3 主要試驗儀器 移液器，ZHJH C1112B型超凈工作臺，BIOFUGE PRIMOR型低溫離心機，IKA MS3型圓周振蕩器，JY04S型凝膠成像儀，Mini-6K型微型離心機，PCR儀，DYCP-31CN型瓊脂糖水平電泳槽，PowerPac Basic型電泳儀，電冰箱，電子天平，微波爐。

1.2 試驗方法

采用常規(guī)的酚/氯仿抽提法提取基因組DNA，溶于TE中，-20 ℃保存?zhèn)溆?。?%～1.5%的瓊脂糖來檢測提取的基因組DNA的效果。根據(jù)KRT35基因在GenBank中的序列，用Primer Premier 5. 0 軟件獨立設計完成引物，由上海生物工程技術有限責任公司合成。F：GGCTCGAAGCTCCATCAC；R：CCGTAGCTGGTAGCAAAGC。

1.2.1 PCR反應條件體系和反應程序 PCR反應條件體系：PCR Green Mixture 10 μL，上游引物（10 pmol/μL）0.6 μL，下游引物（10 pmol/μL）0.6 μL，模板DNA（50 ng/μL）1.5 μL，超純水7.3 μL，總體積20 μL。

PCR反應的程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，退火溫度40 s，72 ℃延伸60s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

PCR產(chǎn)物的SSCP分析方法參考周延清等的方法[8]進行。非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳：取10 μL PCR產(chǎn)物和7 μL變性劑98 ℃變性10 min，然后冰浴30 min，用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠。電泳300 V 50 mA空跑30 min，預跑10 min，180 V電泳15 h后銀染顯色。用凝膠成像系統(tǒng)拍照、分析、判定各種基因型。

1.2.2 測序 選擇基因型不同的樣品，PCR擴增后對PCR原液直接測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本試驗數(shù)據(jù)經(jīng) Microsoft Excel軟件初步處理，并用SPSS 17.0軟件系統(tǒng)進行One-way ANOVA 對不同處理間的處理效應進行方差分析。測定結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 提取DNA結果檢測

本試驗采用酚-氯仿抽提法從和田羊血樣品中提取基因組DNA。圖1是提取DNA在1%的瓊脂糖凝膠中的檢測結果，基因組DNA各泳道都有1條清晰的條帶，無拖尾現(xiàn)象。

2.2 PCR 擴增結果

按照PCR擴增體系，以和田羊血液中提取的DNA作為模板，在PCR儀中擴增得到PCR產(chǎn)物，然后經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠檢測。結果表明擴增片段特異性良好，長度約為279 bp，無引物帶和其他雜帶，可以用于PCR-SSCP分析（圖2）。

2.3 PCR-SSCP檢測結果