耿彬彬+劉姣+郭育強(qiáng)+符少萍+胡新文+郭建春

摘要：根據(jù)木薯細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶基因MeCWINV4已知編碼區(qū)序列與木薯基因組數(shù)據(jù)庫中預(yù)測的MeCWINV4基因序列信息設(shè)計(jì)引物，從木薯基因組DNA中對該基因的潛在啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)測序比對成功獲得1 639 bp序列，其中包含74 bp編碼區(qū)序列和1 565 bp潛在啟動(dòng)子區(qū)序列。用PlantCARE和PLACE軟件分析該序列的順式作用元件，發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子包含CAAT box和TATA box保守元件、大量光反應(yīng)相關(guān)元件與應(yīng)對高低溫脅迫和激素響應(yīng)相關(guān)元件。將MeCWINV4啟動(dòng)子片段取代pVKH表達(dá)載體中的CaMV 35S 啟動(dòng)子與 GUS 連接，構(gòu)建成融合表達(dá)載體 pVKH-CW4-GUS，通過農(nóng)桿菌真空滲透法在煙草葉片中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。結(jié)果表明，該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)了GUS基因在煙草葉片中的表達(dá)。說明MeCWINV4啟動(dòng)子具有啟動(dòng)子活性，可以啟動(dòng)目的基因的轉(zhuǎn)錄，為進(jìn)一步研究該基因的調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：木薯；MeCWINV4；啟動(dòng)子；序列分析；瞬時(shí)表達(dá)

中圖分類號： S533.01；Q785

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0036-05

木薯（Manihot esculenta Crantz）屬大戟科木薯屬，為多年生植物，廣泛栽培于熱帶和部分亞熱帶地區(qū)，塊根富含淀粉，可供食用或用于生產(chǎn)乙醇，是全球近6億人的主要糧食來源[1]，也是中國推廣的可再生能源作物和重要的工業(yè)淀粉原料[2]。

木薯塊根淀粉是由源器官（葉片）通過光合作用制造的光合產(chǎn)物，以蔗糖的形式經(jīng)韌皮部裝載、長距離運(yùn)輸和卸載運(yùn)送到庫器官 （塊根），然后在塊根中由淀粉合成相關(guān)酶催化合成淀粉[3]。但是，木薯塊根中積累的淀粉量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于理論產(chǎn)量，地下部分儲藏的碳水同化物還不足地上部分合成同化物的1/5，提高同化物從源到庫的運(yùn)輸效率對增加木薯塊根淀粉的積累至關(guān)重要。而在木薯淀粉合成積累過程中，對光合產(chǎn)物由“源”到“庫”的裝載、運(yùn)輸和卸載中起主要調(diào)控作用的是蔗糖轉(zhuǎn)化酶。蔗糖轉(zhuǎn)化酶參與了葉片光合作用的調(diào)節(jié)、韌皮部的卸載和庫的建立、貯藏器官中碳水化合物的積累和組成以及細(xì)胞對脅迫的響應(yīng)，并在逆境中起一定作用。蔗糖轉(zhuǎn)化酶根據(jù)其亞細(xì)胞定位，可以分為細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶、液泡轉(zhuǎn)化酶以及細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶[4]。其中，細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶主要參與韌皮部質(zhì)外體卸載時(shí)蔗糖的分解，以保持源—庫之間蔗糖的濃度梯度，從而促使蔗糖順利卸載[5]。筆者所在課題組研究發(fā)現(xiàn)木薯中存在6個(gè)細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶基因，對這些轉(zhuǎn)化酶基因進(jìn)行克隆并在木薯各器官中的表達(dá)模式進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中的細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶MeCWINV4在葉片中表達(dá)微弱，但在塊根韌皮部中表達(dá)量相對較高[6]。由此推測，MeCWINV4基因在塊根韌皮部的組織差異性高表達(dá)可能提示該基因在木薯淀粉合成過程中同化物從源到庫運(yùn)輸時(shí)的韌皮部卸載起著很重要的作用。

基因的表達(dá)調(diào)控，在植物的生長發(fā)育以及應(yīng)答環(huán)境信號過程中起重要作用[7]。啟動(dòng)子在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的起始及表達(dá)程度中起著關(guān)鍵作用。研究啟動(dòng)子的功能序列及其調(diào)控元件對解析基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制具有十分重要的意義[8]。

本研究根據(jù)已知木薯細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶基因MeCWINV4編碼區(qū)序列與木薯基因組數(shù)據(jù)庫預(yù)測信息克隆木薯細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶基因家族中的MeCWINV4啟動(dòng)子序列，通過生物信息學(xué)分析軟件對其上的順式作用元件進(jìn)行初步分析，構(gòu)建植物表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌真空滲透法轉(zhuǎn)化煙草葉片進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，初步鑒定該啟動(dòng)子的活性。為后續(xù)深入研究木薯細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶基因啟動(dòng)子對該基因在淀粉積累過程中的調(diào)控作用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料華南8號木薯與三生煙（Nicotiana tabacum var. samsun NN），采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所試驗(yàn)基地；大腸桿菌（Escherichia coli）菌株DH5α、農(nóng)桿菌菌株GV3101和含有GUS基因的植物表達(dá)載體pVKH-35S-GUS由筆者所在課題組保存。各種工具酶、Marker購自TaKaRa公司；回收純化試劑盒、生化試劑均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR引物合成和測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 木薯基因組DNA提取 采用SDS法[9]提取華南8號木薯組培苗幼苗基因組DNA，取適量DNA用于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 MeCWINV4啟動(dòng)子的克隆及序列分析 根據(jù)已知木薯細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶基因MeCWINV4編碼區(qū)序列（GenBank ID：JQ792172）與木薯基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www.phytozome.net/cassava）中預(yù)測的MeCWINV4基因序列信息設(shè)計(jì)引物。引物序列如下：CW4p-F，GAAAAGGCATCGTCACCATT；CW4P-R，TCAAGCTCAAACACTCCAT。以木薯DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，58 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃充分延伸 10 min。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，再用DNA回收試劑盒純化目的片段，然后將回收產(chǎn)物連接到pMD-19 T-vector simple載體上，通過轉(zhuǎn)化、篩選、菌液PCR，獲得陽性單克隆命名為CW4p-19T。CW4p-19T熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序驗(yàn)證。測序結(jié)果用DNAMAN軟件進(jìn)行比對，比對正確的序列用PlantCARE和PLACE軟件分析該啟動(dòng)子序列，在線預(yù)測順式作用元件。

1.2.3 植物表達(dá)載體pVKH-CW4-GUS的構(gòu)建 將測序正確的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)提取質(zhì)粒，以該質(zhì)粒為模板，添加酶切位點(diǎn)（正向引物中添加SacⅠ酶切位點(diǎn)，反向引物中添加 BamHⅠ 酶切位點(diǎn)）的特異引物（CW4-1F：TAGAGCTCGAAAAGGCATCGTCAC；CW4-1R：TAGGATCCGCTGGTGAGTGCATGT）進(jìn)行PCR擴(kuò)增（下劃線為酶切位點(diǎn)）。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物大小正確后，將目的片段純化回收后與表達(dá)載體pVKH均進(jìn)行Sac Ⅰ和BamHⅠ雙酶切、純化回收，采用T4 DNA連接酶連接，使MeCWINV4啟動(dòng)子區(qū)段定向替換pVKH載體上的CaMV35S啟動(dòng)子。將得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性單克隆，菌液PCR和雙酶切雙重鑒定后，委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)一步測序驗(yàn)證正確后，獲得重組質(zhì)粒命名為pVKH-CW4-GUS。本試驗(yàn)以空載體pVKH-35S-GUS作為陽性對照。

1.2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時(shí)表達(dá) 采用反復(fù)凍融法[10]將空載體pVKH-35S-GUS和pVKH-CW4-GUS重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中，在YEP（1% Yeast Extract、1% Tryptone、0.5% NaCl）+Kana（100 μg/mL）+Rif（50 μg/mL）固體培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)2 d，挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定，篩選出陽性菌株，在50 mL YEP液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)。待D600 nm=0.8～1.0時(shí)，5 000 r/min離心 5 min 收集菌體，用含10 mmol/L MgCl2、200 μmol/L AS（乙酰丁香酮）和10 mmol/L MES（pH值=5.6）的無菌水重懸至D600 nm約為1.0，室溫靜置2 h后備用。用打孔器將煙草葉片打出大小一致的圓形葉盤，浸泡在菌懸液中，然后在真空泵中抽濾30 min，壓強(qiáng)不超過0.085 MPa，取出后平鋪到含有浸濕濾紙的培養(yǎng)皿中，置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。

1.2.5 GUS活性的組織化學(xué)染色分析 將侵染后的煙草葉片置于GUS染液[2 mmol/L X-Gluc，5 mmol/L K3Fe（CN）6，100 mmol/L Na3PO4 緩沖液（pH值=7.0），5 mmol/L K4Fe（CN）6，0.2% Triton X-100，10 mmol/L EDTA]中，確保浸沒葉片，37 ℃ 避光保溫3 d，用70%乙醇進(jìn)行脫色后拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 MeCWINV4啟動(dòng)子的克隆

經(jīng)瓊脂糖電泳檢測后提取的DNA質(zhì)量較好，可用于后續(xù)PCR試驗(yàn)（圖1）。根據(jù)設(shè)計(jì)的引物從DNA中擴(kuò)增得到1段長約1 800 bp的DNA片段，測序分析該片段為1 639 bp的序列（圖2）。CW4p-19T測序后經(jīng)Blast比對發(fā)現(xiàn)，該片段含有的MeCWINV4基因是從ATG起始的74 bp編碼區(qū)序列和ATG上游1 565 bp潛在啟動(dòng)子序列，且該74 bp編碼區(qū)片段與筆者所在的課題組之前克隆的MeCWINV4基因（Accesion NO.JQ792172）相對應(yīng)的全長編碼區(qū)序列同源性達(dá)100%，表明所克隆到的序列為MeCWINV4的啟動(dòng)子序列，序列數(shù)據(jù)提交給GenBank，登錄號為KP164867。

2.2 MeCWINV4 啟動(dòng)子序列的生物信息學(xué)分析

將克隆到的MeCWINV4啟動(dòng)子序列用PlantCARE和PLACE在線軟件進(jìn)行元件預(yù)測分析，分析結(jié)果見圖3、表1，結(jié)果顯示，MeCWINV4啟動(dòng)子不僅含有CAAT box和TATA box保守元件，還存在多種與光反應(yīng)和非生物脅迫相關(guān)的順

式作用元件。（1）光響應(yīng)元件。Box4、Box I、G-Box、GA-motif、GT1 motif、Sp1。（2）脅迫應(yīng)答元件。高溫響應(yīng)元件HSE，低溫響應(yīng)元件LTR，干旱誘導(dǎo)相關(guān)元件MBS，脅迫防御元件TC-rich repeats。（3）激素應(yīng)答元件。脫落酸響應(yīng)元件ABRE，水楊酸響應(yīng)元件SARE，赤霉素響應(yīng)元件GARE-motif，生長素響應(yīng)元件TGA-element等。

2.3 MeCWINV4啟動(dòng)子融合表達(dá)載體的構(gòu)建

2.4 MeCWINV4啟動(dòng)子活性分析

重組載體pVKH-CW4-GUS和空載體pVKH-35S-GUS分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后，進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)分析。結(jié)果顯示，pVKH-CW4-GUS和pVKH-35S-GUS在煙草葉片中都能驅(qū)動(dòng)GUS基因的表達(dá)，煙草葉片被染成藍(lán)色，而陰性對照不能被染色（圖6）。

3 結(jié)論與討論

高等植物中，蔗糖是光合同化物運(yùn)輸?shù)闹饕问絒11]，木薯韌皮部篩管內(nèi)的糖類80%為蔗糖，木薯源器官（葉片）光合作用合成的同化物經(jīng)過韌皮部裝載-運(yùn)輸-卸載到庫器官（塊根）形成淀粉。蔗糖轉(zhuǎn)化酶中細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶是植物源庫器官蔗糖代謝的關(guān)鍵酶，不可逆地將蔗糖分解成葡萄糖和果糖，參與韌皮部質(zhì)外體卸載時(shí)蔗糖的分解，保持源—庫之間蔗糖的濃度梯度，調(diào)節(jié)蔗糖從葉中運(yùn)出的速率來進(jìn)行源庫關(guān)系的建立及調(diào)控[12-14]。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)植物受到生物和非生物脅迫時(shí)，細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶基因被激活或增強(qiáng)表達(dá)，參與一系列防御反應(yīng)。擬南芥根部被病原菌侵染后，根內(nèi)細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶基因表達(dá)量升高，更多的蔗糖運(yùn)輸?shù)角秩静课?，為根?xì)胞抵御病原菌侵染提供碳水化合物[15]。Sonnewald等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)病原菌侵染胡椒葉片后，細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶基因表達(dá)及活性提高，己糖信號形成，誘導(dǎo)病程相關(guān)蛋白（PR）基因表達(dá)，增強(qiáng)葉片對病原菌的防御力[16]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，傷害脅迫[17]、誘導(dǎo)子[18]、病原菌侵染[19]和己糖[20]誘導(dǎo)細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶基因的表達(dá)，乙烯則抑制其表達(dá)[21]。

基因在生物生長發(fā)育過程中根據(jù)生物自身和環(huán)境定時(shí)、定位、定量地特意表達(dá)，很大程度上是通過DNA順式作用元

件與反式作用因子或環(huán)境中光、熱、脅迫等因素的互作來實(shí)現(xiàn)的。其中，啟動(dòng)子的作用尤為關(guān)鍵[22]。轉(zhuǎn)化酶基因能夠被多種脅迫信號誘導(dǎo)表達(dá)，可能是由于這些基因的啟動(dòng)子序列中存在與逆境誘導(dǎo)相關(guān)、參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的順式作用元件[23]。?？∑娴劝l(fā)現(xiàn)，甘蔗酸性轉(zhuǎn)化酶基因SoSAI1上游 417 bp 啟動(dòng)子中含有參與干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點(diǎn)，15%PEG脅迫能誘導(dǎo)甘蔗苗期根和葉片中SoSAIⅠ的表達(dá)[23]；成善漢等研究發(fā)現(xiàn)，通過低溫處理，誘導(dǎo)了馬鈴薯啟動(dòng)子CIP調(diào)控轉(zhuǎn)化酶抑制子St-VIF基因表達(dá)的上調(diào)，從而抑制轉(zhuǎn)化酶的活性[24]。在煙草[25]、擬南芥[26]、大豆[27]等植物中也得到了同樣的驗(yàn)證。

本試驗(yàn)克隆獲得的木薯細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶MeCWINV4基因的1 639 bp啟動(dòng)子除含有CAAT box和TATA box等真核生物啟動(dòng)子基本元件外，還存在大量光反應(yīng)元件如Box4、Box I、G-Box、GA-motif、GT1 motif、Sp1，說明MeCWINV4基因的表達(dá)受到光的調(diào)控，能更高效地在木薯淀粉積累過程中發(fā)揮作用。同時(shí)該啟動(dòng)子上也存在多個(gè)脅迫應(yīng)答元件（高溫響應(yīng)元件HSE、低溫響應(yīng)元件LTR、干旱誘導(dǎo)相關(guān)元件MBS、脅迫防御元件TC-rich repeats）和激素應(yīng)答元件（脫落酸響應(yīng)元件ABRE，水楊酸響應(yīng)元件SARE，赤霉素響應(yīng)元件GARE-motif，生長素響應(yīng)元件TGA-element），暗示該基因的表達(dá)可能受到多種逆境脅迫和激素的調(diào)控。MeCWINV4啟動(dòng)子上這些順式作用元件的預(yù)測結(jié)果可以為后續(xù)的酵母單雜交試驗(yàn)提供理論依據(jù)，也為了解該基因的調(diào)控模式、信號傳遞途徑、生物適應(yīng)環(huán)境機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

煙草瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)證明了所克隆的MeCWINV4啟動(dòng)子能夠啟動(dòng)GUS報(bào)告基因的表達(dá)，具有啟動(dòng)子活性。瞬時(shí)表達(dá)雖然不受基因沉默和基因位置效應(yīng)的影響且轉(zhuǎn)化率高，但為了進(jìn)一步研究MeCWINV4啟動(dòng)子的組織表達(dá)特性和調(diào)控基因表達(dá)模式，還須通過進(jìn)一步穩(wěn)定表達(dá)試驗(yàn)進(jìn)行元件缺失分析和不同誘導(dǎo)條件下該基因及其該啟動(dòng)子活性變化，更深入地分析該基因啟動(dòng)子活性，目前相關(guān)工作正在進(jìn)行中。

參考文獻(xiàn)：

[1]Cruz J L，Mosquim P R，Pelacani C R，et al. Carbon partitioning and assimilation as affected by nitrogen deficiency in cassava[J]. Photosynthetica，2003，41（2）：201-207.

[2]Gu B，Yao Q Q，Li K M，et al. Change in physicochemical traits of cassava roots and starches associated with genotypes and environmental factors[J]. Starch-Starke，2013，65（3/4）：253-263.

[3]劉 姣，胡艷平，周 揚(yáng)，等. 木薯細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶基因MeCWINV1啟動(dòng)子的克隆及其在煙草中的瞬時(shí)表達(dá)分析[J]. 分子植物育種，2014，12（6）：1169-1174.

[4]俞 錁，李志邈，萬紅建，等. 高等植物蔗糖轉(zhuǎn)化酶功能的研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（33）：12815-12818，12822.

[5]Sturm A，Chrispeels M J. cDNA cloning of carrot extracellular beta-fructosidase and its expression in response to wounding and bacterial infection[J]. Plant Cell，1990，2（11）：1107-1119.

[6]Yao Y，Geng M T，Wu X H，et al. Genome-wide identification，3D modeling，expression and enzymatic activity analysis of cell wall invertase gene family from cassava （Manihot esculenta Crantz）[J]. International Journal of Molecular Sciences，2014，15（5）：7313-7331.

[7]Le B H，Cheng C，Bui A Q，et al. Global analysis of gene activity during Arabidopsis seed development and identification of seed-specific transcription factors[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2010，107（18）：8063-8070.

[8]郝迪荻，趙 琳，陳李淼，等. 克隆啟動(dòng)子方法的比較及應(yīng)用[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，41（3）：154-160.

[9]李 靜，尹俊梅，任 羽，等. SDS法提取石斛基因組DNA的研究[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，29（12）：22-26.

[10]Hofgen R，Willmitzer L. Storage of competent cells for agro-bacterium transformation[J]. Nucleic Acids Research，1988，16：9877.

[11]Wind J，Smeekens S，Hanson J. Sucrose：metabolite and signaling molecule[J]. Phytochemistry，2010，71（14/15）：1610-1614.

[12]Kocal N，Sonnewald U，Sonnewald S. Cell wall-bound invertase limits sucrose export and is involved in symptom development and inhibition of photosynthesis during compatible interaction between tomato and Xanthomonas campestris pv. vesicatoria[J]. Plant Physiology，2008，148（3）：1523-1536.

[13]Klann E M，Hall B，Bennett A B. Antisense acid invertase （TIV1） gene alters soluble sugar composition and size in transgenic tomato fruit[J]. Plant Physiology，1996，112（3）：1321-1330.

[14]Sturm A，Tang G Q. The sucrose-cleaving enzymes of plants are crucial for development，growth and carbon partitioning[J]. Trends in Plant Science，1999，4（10）：401-407.

[15]Siemens J，González M C，Wolf S，et al. Extracellular invertase is involved in the regulation of clubroot disease in Arabidopsis thaliana[J]. Molecular Plant Pathology，2011，12（3）：247-262.

[16]Sonnewald S，Priller J P，Schuster J，et al. Regulation of cell wall-bound invertase in pepper leaves by Xanthomonas campestris pv. vesicatoria type three effectors[J]. PloS one，2012，7（12）：e51763.

[17]Zhang L，Cohn N S，Mitchell J P. Induction of a pea cell-wall invertase gene by wounding and its localized expression in phloem[J]. Plant Physiology，1996，112（3）：1111-1117.

[18]Zhang Y L，Zhang A H，Jiang J. Gene expression patterns of invertase gene families and modulation of the inhibitor gene in tomato sucrose metabolism[J]. Genetics and Molecular Research，2013，12（3）：3412-3420.

[19]Hothorn M，van den Ende W，Lammens W，et al. Structural insights into the pH-controlled targeting of plant cell-wall invertase by a specific inhibitor protein[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2010，107（40）：17427-17432.

[20]Roitsch T. Source-sink regulation by sugar and stress[J]. Current Opinion in Plant Biology，1999，2（3）：198-206.

[21]Godt D E，Roitsch T. Regulation and tissue-specific distribution of mRNAs for three extracellular invertase isoenzymes of tomato suggests an important function in establishing and maintaining sink metabolism[J]. Plant physiology，1997，115（1）：273-282.

[22]況守龍，胡廷章. 啟動(dòng)子的克隆和研究方法[J]. 重慶工學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007，21（1）：136-139.

[23]牛俊奇，王愛勤，黃靜麗，等. 甘蔗可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶（SoSAI1）基因的克隆及表達(dá)分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，46（24）：5248-5260.

[24]成善漢，謝從華，柳 俊，等. 馬鈴薯低溫啟動(dòng)子CIP的克隆及其功能鑒定[J]. 貴州科學(xué)，2008，26（1）：19-23.

[25]Fujimoto S Y，Ohta M，Usui A，et al. Arabidopsis ethylene-responsive element binding factors act as transcriptional activators or repressors of GCC box-mediated gene expression[J]. The Plant Cell，2000，12（3）：393-404.

[26]劉文奇，陳旭君，徐曉暉，等. ERF類轉(zhuǎn)錄因子OPBP1基因的超表達(dá)提高煙草的耐鹽能力[J]. 植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào)，2002，28（6）：473-478.

[27]Zhang G Y，Chen M，Li L C，et al. Overexpression of the soybean GmERF3 gene，an AP2/ERF type transcription factor for increased tolerances to salt，drought，and diseases in transgenic tobacco[J]. Journal of Experimental Botany，2009，60（13）：3781-3796.翟立紅，周蘭庭，韓 鵬，等. 玉米Argoanute基因家族的全長cDNA克隆與表達(dá)分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（4）：41-45.