周彪+郭政宏+嚴(yán)亨秀

摘要：藏豬源的芽孢桿菌制劑具有潛在研究應(yīng)用價(jià)值，更好地提取其基因組DNA對(duì)后期研究具有重要作用。采用微波法、酚/三氯甲烷法、改進(jìn)CTAB法、試劑盒法等4種方法提取同一份藏豬糞便DNA，測(cè)定所得DNA含量及純度，然后對(duì)DNA進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增并使用瓊脂糖凝膠電泳法對(duì)比。結(jié)果表明，4種方法均能提取到藏豬糞便的芽孢桿菌基因組DNA，微波法雖然得到最多的DNA，但是其蛋白質(zhì)含量過高，DNA純度最低；試劑盒法提取的DNA純度最高，但是DNA含量太低；綜合比較，改進(jìn)CTAB法DNA得率多且純度高，性質(zhì)穩(wěn)定，擴(kuò)增效果好，價(jià)格低廉，是最優(yōu)提取方法。

關(guān)鍵詞：藏豬；糞便；基因組DNA；提取方法

中圖分類號(hào)： S852.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）04-0093-02

藏豬別稱藏香豬，原產(chǎn)于中國青藏高原海拔2 500～4 300 m 的農(nóng)區(qū)和半農(nóng)區(qū)。藏豬保存了較為純正的品系資源，是唯一能適應(yīng)高原海拔氣候和以放牧為主的豬種，是我國特有世界珍稀的草食性優(yōu)良品種[1]。藏豬肉質(zhì)優(yōu)良，主要源于其食草特性和生活環(huán)境，也與其不同于其他豬種的特殊胃腸道環(huán)境有著密不可分的關(guān)系。芽孢桿菌制劑通常都是以休眠孢子的形式存在，進(jìn)入動(dòng)物腸道后，孢子能在腸道上部迅速萌發(fā)、增殖，并分泌很多種活性很強(qiáng)的消化酶，有助于降解植物性飼料中某些復(fù)雜的碳水化合物，同時(shí)可以消耗大量的氧，維持腸道厭氧環(huán)境，增強(qiáng)腸道對(duì)厭氧益生菌的定植，抑制致病菌生長(zhǎng)，平衡、穩(wěn)定乳酸桿菌，維持腸道微生態(tài)平衡[2-5]。

藏豬來源的芽孢桿菌制劑具有潛在的開發(fā)研究?jī)r(jià)值，提取其基因組DNA在開發(fā)研究中具有重要的意義，理想的基因組DNA獲取方法除了考慮到DNA的產(chǎn)率，還要考慮到盡可能減少DNA的降解及試劑成本等。目前，已經(jīng)有多種提取微生物基因組DNA的方法[6-8]，如微波法、酚/三氯甲烷法、CTAB法、試劑盒法等。為了探究不同方法獲取的基因組DNA對(duì)芽孢桿菌研究的影響，本試驗(yàn)采用4種方法對(duì)樣品進(jìn)行基因組DNA的提取，通過紫外可見分光光度計(jì)、瓊脂糖凝膠電泳分析不同方法得到DNA的產(chǎn)量、純度、穩(wěn)定性，再將獲得的基因組DNA進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增進(jìn)行對(duì)比并評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）裂解液、酚、三氯甲烷、異戊醇、無水冰乙醇、AxyPrep細(xì)菌基因組DNA小量制備試劑盒、瓊脂糖、磷酸鈉緩沖液（pH值7.0）、10%SDS溶液、TAE緩沖液、TE緩沖液、LB液體培養(yǎng)基等。

1.1.2 試驗(yàn)樣品 采集于西藏林芝地區(qū)一牧民家中公藏豬新鮮糞便，-80 ℃液氮保存帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.1.3 主要儀器 PCR擴(kuò)增儀，東勝龍ETC811；高速冷凍離心機(jī)，Thermo；紫外可見分光光度計(jì)，上海成光儀器有限公司；凝膠成像系統(tǒng)，Tanon；電泳儀，Tanon；電泳槽，Tanon；微量移液器，Eppendorf；電子天平，江蘇省常州市宏衡電子儀器廠；渦旋振蕩器，北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司等。

1.2 方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 稱取凍存的糞便樣品5 g于4 ℃冰水或冰盒上解凍，置于50 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液中，并充分渦旋混勻，紗布過濾后，收集濾液并于沸水浴中處理 5 min，吸取1 mL熱處理后的濾液加入到19 mL LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)24 h，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因組DNA的提取

1.2.2.1微波法 （1）微量移液器取1 mL LB菌液于1.5 mL EP管中，12 000 r/min離心2 min，再用PBS洗滌菌體2～3次；（2）棄上清，加500 μL 1×TE吹打混勻，取100 μL于200 μL EP管，12 000 r/min離心2 min；（3）棄上清，加100 μL 1×TE吹打混勻，12 000 r/min離心2 min；（4）棄上清，加100 μL 1×TE吹打混勻，用微波爐（先預(yù)熱1 min）加熱1 min，12 000 r/min 離心2 min；（5）收集上清液，即為所提DNA。

1.2.2.2 酚/三氯甲烷法 （1）微量移液器取1 mL LB菌液于 1.5 mL EP管中，10 000 r/min離心3 min，棄上清；（2）加入 500 μL STE液懸浮，加10 μL蛋白酶K（20 mg/mL），混勻，37 ℃ 恒溫水浴20 min，再加入10% SDS 20 μL，10 mg/mL PKA 20 μL；（3）置于55～65 ℃恒溫水浴中1～3 h；（4）500 μL 酚-三氯甲烷-異丙醇（體積比為25 ∶24 ∶1），下層生成牛奶色，混勻后10 000 r/min離心4 min；（5）上一步后分3層，用剪了頭的槍頭吸取上層DNA，加入異丙醇-三氯甲烷 500 μL，10 000 r/min離心3 min，收集上清；（6）加入30 μL 5 mol/L NaCl，1 000 μL冰無水乙醇，混勻后，冰上靜置10 min至出現(xiàn)白色絲狀物，10 000 r/min離心3 min，棄上清；（7）加入500 μL 70%乙醇，10 000 r/min離心2 min，棄乙醇，風(fēng)干約30 min；（8）加入100 μL 無菌水即為所提DNA。

1.2.2.3 改進(jìn)CTAB法 （1）微量移液器取1 mL LB菌液于1.5 mL EP管中，13 000 r/min離心2 min，棄上清，用0.85% NaCl溶液洗滌2次，加550 μL 1×TE吹打混勻；（2）加8 μL蛋白酶K（20 mg/mL），混勻，37 ℃恒溫水浴30 min，再加40 μL 10% SDS混勻，37 ℃恒溫水浴30 min，再加入100 μL 5 mol/L NaCl混勻，加80 μL CTAB NaCl溶液混勻，65 ℃恒溫水浴10 min；（3）再加入8 μL 10 mg/mL Rnase，37 ℃恒溫水浴 1 h；（4）加入等體積（0.7～0.8 mL）三氯甲烷-異丙醇（體積比為24 ∶1），輕輕振蕩混勻，14 000 r/min離心12 min，分3層，收集上清液，加入等體積酚-三氯甲烷-異丙醇（體積比為25 ∶24 ∶1），輕輕振蕩混勻，14 000 r/min離心 10 min；（5）收集上清液，加入等體積三氯甲烷-異丙醇（體積比為24 ∶1），輕輕振蕩混勻，14 000 r/min離心10 min，收集上清液，加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，混勻，-20 ℃靜置30 min，14 000 r/min離心 10 min，棄上清，加入500 μL 70%乙醇，混勻；（6）14 000 r/min 離心3 min，棄上清，風(fēng)干 15 min，將沉淀溶于60 μL ddH2O中，即為所提DNA。

1.2.2.4 試劑盒法 采用AxyPrep細(xì)菌基因組DNA小量制備試劑盒，具體步驟參見說明書。

1.2.3 基因組DNA質(zhì)量檢測(cè) 分別采用紫外可見分光光度計(jì)法、1%瓊脂糖凝膠電泳法、PCR擴(kuò)增法分析所提取基因組DNA的得率、純度以及大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA得率及純度

對(duì)藏豬糞便進(jìn)行沸水浴處理5 min，只有芽孢桿菌可以存活于沸水浴中，其他細(xì)菌已被殺死。將4種方法所提取的基因組DNA稀釋100倍，用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定DNA得率及純度，每個(gè)樣品DNA測(cè)定3次，取其平均值，得到DNA提取含量、DNA純度和蛋白質(zhì)含量。DNA得率測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)：D260 nm值為1時(shí)等同于50 μg/mL雙鏈DNA，D260 nm/D280 nm比值在1.7～1.9之間，則說明所測(cè)樣品DNA 純度較高；比值低于1.7，則可能有蛋白等雜質(zhì)污染；高于2.0，則樣品DNA很可能已經(jīng)降解。從表1可以看出，DNA得率微波法>改進(jìn)CTAB>試劑盒法>酚/三氯甲烷法；DNA純度試劑盒法>改進(jìn)CTAB>酚/三氯甲烷法>微波法；蛋白含量微波法>改進(jìn)CTAB>試劑盒法>酚/三氯甲烷法。改進(jìn)CTAB法的DNA得率和純度均是第2位；微波法得率最高，但是其蛋白含量最高，導(dǎo)致DNA純度最低；試劑盒法得率居第3位，DNA純度最高且蛋白含量最少；酚/三氯甲烷法得率最低且DNA純度居于第3位。微波法和酚/三氯甲烷法的D260 nm/D280 nm比值均低于170，接近1.0，這2種方法提取的DNA污染較嚴(yán)重，改進(jìn)CTAB法和試劑盒法分別是1.69、176，屬于純度較高的DNA。試劑盒法需要價(jià)格昂貴的試劑盒。綜合考慮以上因素，改進(jìn)CTAB法最適合于藏豬糞便中芽孢桿菌基因組DNA的提取。

2.2 基因組DNA電泳檢測(cè)

1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)結(jié)果（圖1）表明，4種方法提取的基因組DNA分子質(zhì)量均在23 000 bp左右，酚/三氯甲烷法所提DNA拖尾較嚴(yán)重，表明含雜質(zhì)較多，其余3種方法所提基因組DNA較為完整且純度較高，電泳條帶清晰。圖2為基因組DNA在-20 ℃冰箱存放24 h后所得電泳，微波法提取的基因組DNA降解量最多，表明DNA含有太多雜質(zhì)。其他3種方法基因組DNA均有相似程度的降解。

2.3 16S rRNA基因PCR擴(kuò)增后效果

用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物擴(kuò)增所提基因組DNA，使用1% 瓊脂糖電泳法檢測(cè)，以Marker DL2000作為標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量參照，通過凝膠成像系統(tǒng)成像（圖3），4種方法PCR擴(kuò)增效果都較好，擴(kuò)增的片段大小在15 000 bp左右，且干擾性雜帶不多，重現(xiàn)性較好，但微波法、改進(jìn)CTAB法和試劑盒法獲得的條帶較清晰，酚/三氯甲烷法的條帶較模糊，表明微波法、改進(jìn)CTAB法和試劑盒法提取的基因組DNA具有較好的質(zhì)量，所得的 DNA 可作為 PCR 模板進(jìn)行16S rRNA 基因的有效擴(kuò)增，為進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)研究提供材料保障。

3 結(jié)論與討論

微波法只有洗滌、微波振蕩破壁和酚/三氯甲烷抽提3步，相對(duì)于物理法破壁的費(fèi)時(shí)、費(fèi)力和酶法破壁的長(zhǎng)時(shí)間消化處理，微波法具有簡(jiǎn)便、高效、快速和價(jià)廉等特點(diǎn)[9]。雖然微波法能提取到高得率的DNA，但所提DNA中含有太多雜質(zhì)，以致其穩(wěn)定性極差，很可能是因?yàn)槲催M(jìn)行核酸酶消化處理。酚/三氯甲烷抽提方法是目前提取外周血基因組DNA方

法，可除去蛋白質(zhì)和色素物質(zhì)，研究表明，酚/三氯甲烷法可提取高純度的DNA[10]。在本試驗(yàn)中，酚/三氯甲烷法提取的基因組DNA得率最低，DNA純度居于第3位，可能與酶消化細(xì)胞壁時(shí)間不足、萃取不徹底有關(guān)。改進(jìn)CTAB法提取的基因組DNA得率和純度均居第2位，綜合考慮是提取藏豬糞便芽孢桿菌基因組DNA的最優(yōu)方法。CTAB法提取的DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和16S rRNA擴(kuò)增表明，該法提取的DNA蛋白質(zhì)污染少，降解不明顯，產(chǎn)量穩(wěn)定，重復(fù)性好，可做大量提取試驗(yàn)并應(yīng)用于后續(xù)研究。試劑盒法操作簡(jiǎn)單，用時(shí)相對(duì)較短，所得DNA質(zhì)量較為穩(wěn)定，但價(jià)格昂貴，使用次數(shù)有限，不適合作大量基因組DNA提取。不同方法出現(xiàn)的差異可能與不同方法裂解細(xì)菌細(xì)胞的效率及藏豬糞便中特異菌群組成有關(guān)。用4種方法提取同一份樣品DNA的得率和純度差異較大，說明對(duì)腸道菌群研究時(shí)采用不同DNA提取方法會(huì)影響對(duì)菌群多樣性的分析，導(dǎo)致引入一些誤差，因此，在研究不同動(dòng)物腸道菌群時(shí)應(yīng)選擇合適的方法提取DNA以減少菌群分析誤差。

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