胡彥江+張茹琴

摘要：研究了不同光照條件對(duì)花生網(wǎng)斑病菌（Phoma arachidicola Marasas，Pauer & Boerema）生長(zhǎng)、產(chǎn)孢及致病力的影響。結(jié)果表明，在燕麥培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d時(shí)，病原菌在近紫光、全光照條件下的菌落直徑（分別為6.2 cm和 6.3 cm），顯著高于黑暗、光暗交替（12 h-12 h）條件下的菌落直徑（分別為3.9 cm和4.3 cm）。在黑暗或光暗交替（12 h-12 h）條件下培養(yǎng)22 d時(shí)，花生網(wǎng)斑病菌在燕麥、玉米瓊脂或花生葉煎汁培養(yǎng)基上均未產(chǎn)生分生孢子，但在近紫光下，除玉米瓊脂培養(yǎng)基外，在燕麥培養(yǎng)基和花生葉煎汁培養(yǎng)基上均產(chǎn)生大量的分生孢子，濃度分別為3.1×106個(gè)/mL 和7.0×105個(gè)/mL。在近紫光下，花生離體葉片于接種病原菌孢子懸浮液后7 d開(kāi)始發(fā)病，但在黑暗、光暗交替條件下未發(fā)病。因此，近紫光有利于花生網(wǎng)斑病菌菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢及致病。

關(guān)鍵詞：花生網(wǎng)斑病菌；光照；生長(zhǎng)；產(chǎn)孢；致病力

中圖分類號(hào)： S435.652

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）04-0174-03

花生（Arachis hypogaea L.）是一種重要的油料和經(jīng)濟(jì)作物，在世界范圍內(nèi)廣泛種植。其中，中國(guó)是世界上最大的花生生產(chǎn)、消費(fèi)和出口國(guó)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2013年我國(guó)花生種植面積達(dá)4.71×106 hm2[1]。但由于種植面積的增加，花生連作重茬現(xiàn)象也越來(lái)越嚴(yán)重，從而導(dǎo)致各種病害也逐年加重，嚴(yán)重限制了花生產(chǎn)量及品質(zhì)的進(jìn)一步提高[2]。隨著病害控制過(guò)程中農(nóng)藥的大量使用，給花生食品安全及出口也帶來(lái)了極大的隱患[3]。

花生網(wǎng)斑病，又稱云斑病、褐紋病、污斑病，1973年在美國(guó)德克薩斯州首次發(fā)生，1982年首次在我國(guó)山東、遼寧等花生產(chǎn)區(qū)發(fā)現(xiàn)，隨后在陜西、河南等省發(fā)生[4]。該病害是一種主要危害花生葉部的真菌病害，也是近年來(lái)花生上的嚴(yán)重病害之一[2，4]。在花生中后期發(fā)病最重，主要危害葉片，其次危害葉柄和莖部，導(dǎo)致花生生長(zhǎng)后期大量落葉，影響產(chǎn)量，一般可減產(chǎn)10%～20%，嚴(yán)重時(shí)達(dá)30%以上[2，4]。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者就該病害的病原學(xué)[5-7]、發(fā)生條件[8-9]及田間病害流行動(dòng)態(tài)[4]等方面進(jìn)行了研究。Marasas等用發(fā)生學(xué)方法，結(jié)合產(chǎn)孢方式，將該病原菌的無(wú)性階段鑒定為半知菌亞門、球殼孢目、莖點(diǎn)霉屬、花生莖點(diǎn)霉（Phoma arachidicola Marasas，Puaer & Boerema）[5]，我國(guó)李君彥等的鑒定結(jié)果[7]與之一致。該病菌一般以菌絲和分生孢子器在殘葉組織中越冬，病害田間始發(fā)期為6月上旬，高峰期在7月份以后，期間持續(xù)陰雨和生長(zhǎng)后期低溫有利于病害發(fā)展[7]。病害的發(fā)生與花生生育日數(shù)、氣溫和相對(duì)濕度呈正相關(guān)，與降雨量呈負(fù)相關(guān)，其中效應(yīng)最大的為花生生育日數(shù)。因此即使不同年度間溫濕度有所變化，第一次病害高峰期出現(xiàn)時(shí)間基本一致[8]。不同花生品種間網(wǎng)斑病抗性存在一定差異，在遼寧，花生品種四粒紅﹥白沙1016﹥花育20﹥黑花生﹥白花生[4]。

在花生網(wǎng)斑病菌研究過(guò)程中，一株分離自山東省花生研究所萊西試驗(yàn)田的花生網(wǎng)斑病菌，常規(guī)培養(yǎng)時(shí)菌絲生長(zhǎng)緩慢且難以產(chǎn)生分生孢子，成為該病害后續(xù)室內(nèi)研究的瓶頸問(wèn)題。因此，本試驗(yàn)的主要目的是探索光照對(duì)花生網(wǎng)斑病菌菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢及致病力的影響，為花生網(wǎng)斑病后續(xù)研究的展開(kāi)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 光照對(duì)花生網(wǎng)斑病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

將4 ℃冰箱保存的花生網(wǎng)斑病菌，活化后打取直徑5 mm菌餅，接種于燕麥培養(yǎng)基平板中央，分別置于黑暗、光暗交替（2 400 lx，12 h-12 h）、光照（日光燈2 400 lx）、近紫光（8 W×3）下，25 ℃培養(yǎng)。每處理4個(gè)重復(fù)，每重復(fù)1皿。培養(yǎng) 14 d 后，取出培養(yǎng)物，按照十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算平均值。

1.2 營(yíng)養(yǎng)及光照對(duì)花生網(wǎng)斑病菌產(chǎn)孢量的影響

1.2.1 培養(yǎng)基的制作 選用3種產(chǎn)孢培養(yǎng)基，分別為玉米培養(yǎng)基、燕麥培養(yǎng)基和花生葉煎汁培養(yǎng)基。其中，玉米培養(yǎng)基配方：將一定量的自來(lái)水煮沸后，加入100 g玉米粉，攪拌均勻，文火煮沸后再煮1 h。趁熱用4層紗布過(guò)濾，在濾液中加入12 g瓊脂粉，加熱過(guò)程中不斷攪拌至充分熔化后，用自來(lái)水定容至1 000 mL。調(diào)pH值為6.5。燕麥培養(yǎng)基配方：自來(lái)水煮沸后加入30 g燕麥片，文火煮沸后1 h。趁熱用4層紗布過(guò)濾，濾液中加入12 g瓊脂粉并不斷攪拌至瓊脂熔化后，用自來(lái)水定容至1 000 mL。調(diào)pH值為6.5?；ㄉ~煎汁培養(yǎng)基配方：將200 g去皮馬鈴薯塊和31 g洗凈的花生葉片一起文火煮沸30 min。趁熱用4層紗布過(guò)濾，濾液中加入12 g瓊脂粉直至熔化，然后加入20 g葡萄糖，溶解后用自來(lái)水定容至 1 000 mL。調(diào)節(jié)pH值至6.5。

1.2.2 不同光照條件對(duì)花生網(wǎng)斑病菌產(chǎn)孢量的影響 用直徑5 mm的打菌器打取病原菌菌餅，接種于上述3種培養(yǎng)基制成的平板中央（直徑9 cm）后，分別置于黑暗、光暗交替（日光燈2 400 lx，12 h-12 h）、近紫光（波長(zhǎng)340～380 nm，8 W×3）下，于25 ℃恒溫培養(yǎng)。每次試驗(yàn)3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)1皿，共重復(fù)3次。

1.2.3 花生網(wǎng)斑病菌產(chǎn)孢量測(cè)定 接種22 d后，每個(gè)培養(yǎng)皿中加入20 mL無(wú)菌水，靜置30 min后制成孢子懸浮液，用移液槍取20 μL用血球計(jì)數(shù)板對(duì)孢子進(jìn)行計(jì)數(shù)，每處理重復(fù)3次，求平均值。

同時(shí)挑取培養(yǎng)基上的小黑點(diǎn)，制成臨時(shí)水裝切片，在 Olympus 光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲、厚垣孢子、分生孢子器及分生孢子的顏色、形態(tài)及產(chǎn)生情況，用LEICA ICC50 HD攝像顯微鏡拍照。

1.3 光照對(duì)花生網(wǎng)斑病菌離體葉片致病力的影響

致病力測(cè)定選用網(wǎng)斑病菌感病品種白沙1016，室內(nèi)盆栽備用。測(cè)定時(shí)，取長(zhǎng)勢(shì)、大小、生長(zhǎng)位置一致的花生葉片，用自來(lái)水沖洗后，在超凈工作臺(tái)上用無(wú)菌水沖洗3～4次。無(wú)菌條件下將花生葉片置于裝有滅菌濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中（直徑 16 cm），每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)放置1片花生復(fù)葉，用移液器取上述 1 mL 分生孢子懸浮液，滴于花生葉片上，對(duì)照滴等量的無(wú)菌水。將培養(yǎng)皿分別置于黑暗、光暗交替、近紫光條件下、28 ℃恒溫箱培養(yǎng)。注意觀察，記錄葉片發(fā)病時(shí)間及癥狀。每處理3個(gè)重復(fù)，共重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

分別用Microsoft Excel 2007與SAS 8.1數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行繪圖和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 光照對(duì)花生網(wǎng)斑病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

由圖1可知，培養(yǎng)14 d時(shí)，不同光照對(duì)花生網(wǎng)斑病菌菌絲的生長(zhǎng)有極顯著的影響（P<0.01）。其中，在近紫光和全光照（日光）條件下，菌落直徑（6.2 cm、6.3 cm）無(wú)極顯著差異（P>0.01）；在黑暗和光暗交替條件下，菌落直徑（3.9 cm、4.3 cm）也無(wú)極顯著差異（P>0.01）。但是，在近紫光和全光照條件下的菌落直徑與黑暗和光暗交替條件下的菌落直徑有極顯著差異（P<0.01）。這說(shuō)明，在近紫光和全光照條件下，菌絲生長(zhǎng)顯著快于黑暗和光暗交替條件。

2.2 光照對(duì)花生網(wǎng)斑病菌產(chǎn)孢量的影響

花生網(wǎng)斑病菌培養(yǎng)22 d后（表1），在光暗交替（12 h-12 h）和黑暗條件下，在3種培養(yǎng)基上，菌絲無(wú)色，凝集成束時(shí)呈黃色，產(chǎn)生少量黃褐色厚垣孢子，無(wú)分生孢子器產(chǎn)生。在近紫光下，在3種培養(yǎng)基上均產(chǎn)生大量的小黑點(diǎn)——分生孢子器，在燕麥培養(yǎng)基和花生葉煎汁培養(yǎng)基上，有大量分生孢子產(chǎn)生，但在玉米瓊脂培養(yǎng)基上，分生孢子器中未產(chǎn)生分生孢子。在燕麥培養(yǎng)基上，分生孢子大多為橢圓形，單胞，極少數(shù)為雙胞，平均大小為20 μm×12.5 μm。

在燕麥培養(yǎng)基上和花生葉煎汁培養(yǎng)基上，分生孢子濃度分別為3.1×106、7.0×105個(gè)/mL，二者差異極顯著（P<001）。說(shuō)明誘導(dǎo)花生網(wǎng)斑病菌產(chǎn)孢的有利條件為用燕麥培養(yǎng)基，并輔以近紫光照射。

2.3 光照對(duì)花生網(wǎng)斑病菌致病力的影響

在近紫光下，花生葉片于接種后7 d開(kāi)始發(fā)病，病斑網(wǎng)紋狀，與田間自然發(fā)病癥狀相同；至接種后20 d時(shí)，病斑進(jìn)一步擴(kuò)大。但在黑暗、光暗交替條件下，在觀察期內(nèi)，葉片始終未表現(xiàn)癥狀。說(shuō)明近紫光有利于花生網(wǎng)斑病發(fā)生（圖2）。

3 結(jié)論與討論

光對(duì)地球上的生命來(lái)說(shuō)，既是一種基本的能源也是主要的環(huán)境信號(hào)。除植物以外，光的感應(yīng)現(xiàn)象還存在于很多非光孢子；無(wú)分生孢子器產(chǎn)生0 C近紫光玉米培養(yǎng)基菌絲黃褐色，聚集成束；形成極少量的厚垣孢子；有分生孢子器形成，但未見(jiàn)有分生孢子0 C燕麥培養(yǎng)基形成黃褐色厚垣孢子；有分生孢子器及大量分生孢子形成3.1×106 A花生葉汁培養(yǎng)基形成黃褐色厚垣孢子；有分生孢子器及大量分生孢子形成7.0×105 B合作用的生物中[10]?？諝?、光和營(yíng)養(yǎng)缺乏對(duì)真菌孢子發(fā)育都有影響。試驗(yàn)表明，藍(lán)光和近紫光可以調(diào)節(jié)真菌甚至哺乳動(dòng)物等大多數(shù)生物的生理活動(dòng)[11]。光信號(hào)可影響真菌的生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)、新陳代謝及基因表達(dá)等[12]。對(duì)于花生網(wǎng)斑病菌，如果利用常見(jiàn)促孢培養(yǎng)基，如燕麥培養(yǎng)基、玉米培養(yǎng)基，在黑暗條件下培養(yǎng)，即便經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)，該病原菌不能或僅能產(chǎn)生極少量的分生孢子，這成為限制花生網(wǎng)斑病后續(xù)研究的瓶頸問(wèn)題。在本試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)光照對(duì)花生網(wǎng)斑病菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量有顯著影響。在近紫光和全光照條件下，菌絲生長(zhǎng)顯著快于黑暗和光暗交替條件。在近紫光條件下，在燕麥培養(yǎng)基和花生葉煎汁培養(yǎng)基上均能產(chǎn)生大量的分生孢子。這個(gè)結(jié)論與李君彥等認(rèn)為花生網(wǎng)斑病菌“誘發(fā)產(chǎn)孢以使用燕麥瓊脂培養(yǎng)基，輔以近紫光照射效果最佳”的結(jié)論[7]一致。

在花生網(wǎng)斑病菌致病力測(cè)定試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)利用分生孢子懸浮液接種室內(nèi)盆栽花生葉片時(shí)不能或很少能使之發(fā)病，這與王振躍等[13]、李君彥等[7]的試驗(yàn)結(jié)果不同。但盆栽花生在室外自然接種時(shí)卻易于發(fā)病?？紤]到近紫光對(duì)網(wǎng)斑病菌菌絲生長(zhǎng)及誘導(dǎo)產(chǎn)孢的影響，推測(cè)該病菌的致病力可能與一定波長(zhǎng)的光有關(guān)，本研究結(jié)果也印證了這一推想：與黑暗條件、光暗交替條件相比，近紫光照射對(duì)花生網(wǎng)斑病菌的致病力有非常顯著的影響。這個(gè)結(jié)果與胡麗等報(bào)道的“適當(dāng)?shù)慕贤夤猓?2 h光-12 h暗）處理有利于病菌的侵染”[14]一致。

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