周 池，饒力群，楊 華

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，道地藥用植物規(guī)范化栽培與綜合利用湖南省工程實(shí)驗(yàn)室，湖南　長(zhǎng)沙 410128）

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ITS2序列作為青風(fēng)藤DNA條形碼的研究

周 池，饒力群，楊 華

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，道地藥用植物規(guī)范化栽培與綜合利用湖南省工程實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙 410128）

摘 要：采用DNA試劑盒法提取采自不同地區(qū)的青風(fēng)藤及其類似植物的基因組DNA，設(shè)計(jì)通用ITS2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，運(yùn)用生物信息學(xué)軟件對(duì)序列進(jìn)行分析，從而對(duì)青風(fēng)藤及其類似植物進(jìn)行分子鑒定。結(jié)果表明：產(chǎn)地為陜西、貴州、湖北的青風(fēng)藤樣品序列長(zhǎng)度分別為380～437、429～436、434～438 bp，GC含量在54.2%～55.7%，平均GC含量約為55%。青風(fēng)藤及其類似植物的ITS2序列存在較大差異，且平均K2P遺傳距離明顯大于青風(fēng)藤的種內(nèi)平均K2P遺傳距離。這說明內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（ITS2）作為DNA條形碼可準(zhǔn)確地鑒別青風(fēng)藤與其他類似植物，為中藥材的鑒別提供了新途徑。

關(guān)鍵詞：青風(fēng)藤；內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（ITS2）；DNA條形碼；中藥材；鑒別

青風(fēng)藤又名青藤、尋風(fēng)藤，為防己科植物青藤、華防己或清風(fēng)藤科植物清風(fēng)藤等的藤莖。每年夏、秋采割藤莖，曬干即可入藥，具有通絡(luò)、止痛、祛風(fēng)濕之功效，主治風(fēng)濕及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)腫大、肢體疼痛、麻木等癥。青風(fēng)藤是一味具有較高臨床藥用價(jià)值的傳統(tǒng)中藥，隨著風(fēng)濕和類風(fēng)濕病發(fā)病率的不斷上升，該植物藥逐漸受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。

中藥鑒定是研究中藥品種和質(zhì)量、制定中藥標(biāo)準(zhǔn)、尋找和擴(kuò)大藥源的前提和基礎(chǔ)。2010年版的《中華人民共和國(guó)藥典》正式將PCR技術(shù)作為中藥的標(biāo)準(zhǔn)鑒定方法［1］。DNA條形碼（DNA barcode）技術(shù)是分子鑒定的最新發(fā)展，即通過比較一段通用DNA片段，對(duì)物種進(jìn)行快速、準(zhǔn)確地識(shí)別和鑒定，是近年來生物分類和鑒定的研究熱點(diǎn)，在物種鑒定方面顯示了廣闊的應(yīng)用前景［2-4］。

真核生物基因組中，編碼核糖體的基因包括28S rDNA、5S rDNA、18S rDNA和5.8S rDNA 4種，它們?cè)谌旧w上頭尾相連、串聯(lián)排列，相互之間由間隔區(qū)分隔。其中，18S、5.8S和28S rDNA基因組成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單元，三者高度保守，適合于較高等級(jí)水平生物群體間的系統(tǒng)分析，其間的間隔區(qū)為內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal Transcribed Spacer，ITS），包括ITS1及ITS2兩部分，由于進(jìn)化相對(duì)迅速而具多態(tài)性，因而適合于等級(jí)水平較低的系統(tǒng)學(xué)研究，而內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（ITS2）已被提出作為藥用植物鑒定的標(biāo)準(zhǔn)條形碼序列［5-12］。研究通過對(duì)青風(fēng)藤植物及其類似物的基因組提取，擴(kuò)增其ITS2序列，進(jìn)行測(cè)序并運(yùn)用生物信息學(xué)分析，以期為青風(fēng)藤植物的分類鑒定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物樣品 試驗(yàn)采集的植物樣品見表1，通過楊華副教授初步鑒定，樣品分別為防己科植物青風(fēng)藤（Sinomenium acutum）、茜草科植物雞屎藤（Paederia）、茜草科植物鉤藤（Ucaria rhynchophylla）及清風(fēng)藤科植物鄂西清風(fēng)藤（Sabia swinhoei）。采摘樣品新鮮葉片進(jìn)行基因組提取，保存于-80℃超低溫冰箱。從GenBank中篩選3個(gè)物種的6條ITS2作比對(duì)，見表2。

表1 樣品信息

表2 從GenBank獲得的植物ITS2信息

1.1.2 試驗(yàn)試劑 離心柱型植物基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；TransTaq DNA polymerase High Fidelity與dNTPs（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；參考陳士林［13］研究提出的植物ITS2通用引物，正向引物ITS2F為5'-ATGCGATACTTGGT GTGAAT-3'，反向引物ITS3R為5'-GACGCTTCTCCA GACTACAAT-3'（南京金斯瑞生物科技有限公司）。

1.1.3 試驗(yàn)儀器 試驗(yàn)主要儀器有：Biometra PCR儀（德國(guó)耶拿公司）、Gel Logic 212 Pro凝膠電泳成像系統(tǒng)（加拿大Carestream公司）、PowerPac電泳儀（美國(guó)BIO-RAD公司）和Centrifuge 5424型臺(tái)式離心機(jī)（德國(guó)eppendorf公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 取100 mg植物葉片，用80%的乙醇反復(fù)擦拭后放入研缽，加入液氮充分研磨粉碎，按照北京天根生化科技有限公司生產(chǎn)的植物基因組DNA提取試劑盒的步驟提取植物基因組DNA，用凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量，最后儲(chǔ)存于-20℃冰箱備用。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系為50 μL，含有模板DNA 5 μL（40～50 ng），正反引物各2 μL（10 μmol/L），10×TransTaq HiFi buffer 5 μL，dNTPs 4 μL（2.5 μmol/L），TransTaq HiFi DNA polymerase 1μL，加入雙蒸H2O至50 μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，最后降溫到4℃保存。產(chǎn)物交由鉑尚生物技術(shù)有限公司純化并測(cè)序。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 測(cè)序峰圖用軟件CodonCode Aligner V3.0校對(duì)拼接，去除不穩(wěn)定區(qū)和引物區(qū)，從GenBank下載的數(shù)據(jù)則使用隱馬爾可夫模型的注釋方法去除兩端的5.8S和28S區(qū)段，得到ITS2序列［14-15］，將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入生物信息學(xué)軟件MEGA5.10分析比對(duì)并計(jì)算Kimura-2-parameter（K2P）距離，用NJ鄰接法（Neighbor-2-Joining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，利用相似性搜索法（BLAST1）進(jìn)行鑒定分析。利用bootstrap（1 000次）檢測(cè)各分支的支持率。

2 結(jié)果與分析

2.1 相似性搜索法鑒定結(jié)果

在NCBI中使用BLAST方法對(duì)試驗(yàn)樣品的ITS2序列進(jìn)行鑒定和序列驗(yàn)證，結(jié)果顯示試驗(yàn)樣品與防己科植物青風(fēng)藤的相似度達(dá)99%以上，這說明試驗(yàn)藥材樣品確實(shí)來源于防己科青風(fēng)藤。

2.2 試驗(yàn)材料PCR擴(kuò)增及青風(fēng)藤植物ITS2序列分析

利用植物ITS2通用引物對(duì)20個(gè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增得到的ITS2序列長(zhǎng)度范圍在380～438 bp，平均長(zhǎng)度約428 bp，長(zhǎng)度差異并不大（見圖1）。

圖1 樣品DNA的ITS2序列PCR產(chǎn)物電泳圖

對(duì)來自青風(fēng)藤植物的17條帶進(jìn)行測(cè)序，獲得了17條青風(fēng)藤植物的ITS2序列，其序列GC含量在54.2%～55.7%，平均GC含量約為55%，17條青風(fēng)藤ITS2序列間的變異位點(diǎn)在240 bp處，除GZ2樣品變異為T，其他為C（見圖2）；其種內(nèi)的遺傳距離K2P最大為0.01（見圖3）。由此可知，不同產(chǎn)地的青風(fēng)藤植物種內(nèi)的ITS2序列變異極小。

從圖3中還可以看出，類似植物的ITS2序列與青風(fēng)藤植物的ITS2序列比對(duì)有很明顯的差異，他們之間的遺傳距離K2P在0.51～0.97之間（見圖4），遠(yuǎn)大于青風(fēng)藤植物種內(nèi)的遺傳距離。這說明ITS2序列可以用于青風(fēng)藤植物的分子鑒定。

圖2 不同產(chǎn)地青風(fēng)藤ITS2序列變異位點(diǎn)比對(duì)

圖3 青風(fēng)藤與類似植物ITS2序列比對(duì)

圖4 青風(fēng)藤與類似植物的ITS2序列的遺傳距離

2.3 青風(fēng)藤ITS2序列與其類似物ITS2序列的聚類分析

根據(jù)試驗(yàn)獲得的ITS2序列以及從GenBank篩選的序列，通過生物信息學(xué)軟件MEGA5.10構(gòu)建NJ （Neighbor-Joining）系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖5。如圖5所示，所有序列被聚為4大類。其中，防己科青風(fēng)藤（Sinomenium acutum）植物由17條采集自3個(gè)不同地區(qū)的青風(fēng)藤ITS2序列和GenBank篩選的2條ITS2序列聚為一類；2條茜草科植物雞屎藤（Paederia）與鉤藤（Ucaria rhynchophylla）聚為一類；湖南藤本植物園采集的鄂西清風(fēng)藤（Sabia swinhoei）ITS2序列與GenBank篩選的鄂西清風(fēng)藤（Sabia swinhoei）ITS2序列聚為一類；而GenBank篩選的海風(fēng)藤（Piper kadsura）序列單獨(dú)聚為一類。聚類結(jié)果表明，依據(jù)ITS2序列構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹可以將青風(fēng)藤植物與其類似植物很好地區(qū)分開來。

圖5 NJ系統(tǒng)發(fā)育樹（bootstrap 1 000次重復(fù)，顯示支持率≥50%的分支）

3 討 論

近年來，隨著風(fēng)濕和類風(fēng)濕病發(fā)病率的不斷上升，青風(fēng)藤植物受到人們的廣泛關(guān)注，但傳統(tǒng)的形態(tài)分類鑒別并不能完全區(qū)分各種混偽品。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，已有研究通過各種方法對(duì)青風(fēng)藤的遺傳多樣性進(jìn)行分析［16-17］，但在種間、種內(nèi)顯示出的多態(tài)性程度并不完全一致，且各種分子標(biāo)記技術(shù)之間缺乏一定的相互印證?；谶z傳物質(zhì)DNA的條形碼鑒定技術(shù)，具有穩(wěn)定、可靠、不受外界影響的特點(diǎn)，是一種新的分子生物鑒定技術(shù)。

該研究應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)測(cè)定了防己科青風(fēng)藤的ITS2序列。研究結(jié)果表明，ITS2序列在不同物種的個(gè)體間存在豐富的變異，ITS2序列種內(nèi)的K2P遺傳距離比較接近，說明其種類的相似度高，親緣關(guān)系較近；ITS2序列在系統(tǒng)發(fā)育樹中的支持率也較高，說明了采用ITS2序列的鑒定方法能夠從分子角度區(qū)分青風(fēng)藤植物與其他類似植物。

中藥醫(yī)學(xué)一直是中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的重要組成部分，而中藥材原材料的真?zhèn)舞b定一直是中國(guó)中藥材研究人員的一大難題，傳統(tǒng)的基原鑒定、性狀鑒定、顯微鑒定和理化鑒定等方法在某些方面都有局限性。該研究結(jié)果驗(yàn)證了ITS2序列在中藥材中的鑒別能力，對(duì)于實(shí)現(xiàn)中藥材分子水平的快速鑒定具有重要意義，也能為中藥資源在起源和進(jìn)化方面的研究提供參考。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典（一部）［M］. 北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010. 72-73.

［2］ 陳士林，姚 輝，宋經(jīng)元，等. 基于DNA barcoding（條形碼）技術(shù)的中藥材鑒定［J］. 世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2007，（3）：7-12.

［3］ Li D Z，Liu J Q，Chen Z D，et al. Plant DNA barcoding in China［J］. Journal of Systematics and Evolution，2011，49：165-168.

［4］ Li M，Cao H，But P P H，et al. Identification of herbal medicinal materials using DNA barcode［J］. Journal of Systematics and Evolution，2011，49：271-283.

［5］ Chen S L，Yao H，Han J P，et al. Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species［J］. PLOS One，2010，5（1）：e8613.

［6］ 羅 焜，陳士林，陳科力，等. 基于蕓香科的植物通用DNA條形碼研究［J］. 中國(guó)科學(xué)（生命科學(xué)），2010，（4）：342-358.

［7］ 朱英杰，陳士林，姚 輝，等. 重樓屬藥用植物DNA條形碼鑒定研究［J］. 藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010，（3）：376-382.

［8］ Gao T，Yao H，Song JY，et al. Identification of medicinal plants in the family Fabaceae using a potential DNA barcode ITS2［J］. Journal of Ethnopharmacology，2010，130（1）：116-121.

［9］ Pang X H，Song J Y，Zhu Y J，et al. Applying plant DNA barcodes for Rosaceae species identification［J］. Cladistics，2011，27（2）：165-170.

［10］Yao H，Song J Y，Liu C，et al. Use of ITS2 Region as the Universal DNA Barcode for Plants and Animals［J］. PLoS ONE，2010，5（10）：e13102.

［11］Gao T，Yao H，Song J Y，et al. Evaluating the Feasibility of Using Candidate DNA Barcodes in Discriminating Species of the Large Asteraceae Family［J］. BMC Evol Biol，2010，10（2）： 1-7.

［12］Pang X H，Song J Y，Zhu Y J，et al. Using DNA barcoding to identify species within Euphorbiaceae［J］. Planta Med，2010，76（15）：1784-1786.

［13］陳士林，姚 輝，韓建萍，等. 中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則［J］. 中國(guó)中藥雜志，2013，（2）：141-148.

［14］Eddy S R. Profile hidden Markov models［J］. Bioinformatics，1998，14：755-763.

［15］Keller A，Schleicher T，Schultz J，et al.5.8S-28S rRNA interaction and HMM-based ITS2 annotation［J］. Gene，2009，430（1-2）：50-57.

［16］李 松，孫利生，唐 鍇. 青風(fēng)藤及其偽品的鑒別［J］. 首都食品與醫(yī)藥，2015，（13）：57.

［17］李亞玲，葉 云，余德智. 防己及其混偽品的鑒別方法［J］. 國(guó)際中醫(yī)中藥雜志，2012，34（1）：37-41.

（責(zé)任編輯：成 平）

Research of ITS2 Sequences as Caulis Sinomenii DNA Barcode

ZHOU Chi，RAO Li-qun，YANG Hua
（College of Bioscience and Biotechnology， Hunan Agricultural University， Hunan Engineering Laboratory for Good Agricultural Practice and Comprehensive Utilization of Famous-Region Medicinal Plants， Changsha 410128， PRC）

Abstract：Using DNA Kit Method to extract genomic DNA from the Caulis Sinomenii and similar plants in different regions， the design of universal ITS2 primers for PCR amplification and sequencing， using bioinformatics software to analyze the sequence， then carried out the molecular identification to Caulis Sinomenii and similar plants. The results showed that the sample sequence length of Caulis Sinomenii in producing area of Shanxi， Guizhou， Hubei respectively were 380～437， 429～436， 434～438 bp and the GC content in 54.2%～55.7%，average GC content was about 55%. There was a big difference between ITS2 sequences of Caulis Sinomenii and similar plants， the average genetic distance of K2P was significantly greater than the intraspecific average K2P genetic distance. This illustrated the internal transcribed spacer 2 （ITS2） as a DNA barcode can accurately identify Caulis Sinomenii and other similar plants， it provided a new way for the identification of Chinese herbal medicine.

Key words：Caulis Sinomenii； internal transcribed spacer 2 （ITS2）； DNA barcode； Chinese herbal medicine； identify

中圖分類號(hào)：R282.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-060X（2016）05-0001-04

DOI：10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.05.001

收稿日期：2016-03-29

基金項(xiàng)目：湖南省2014年科技創(chuàng)新項(xiàng)目（湘發(fā)改投資［2014］658號(hào)）

作者簡(jiǎn)介：周 池（1991-），男，湖南常德市人，碩士研究生，主要從事生物資源開發(fā)與利用研究。

通訊作者：饒力群