林書典,詹　鋒,潘楚瑛,張　延,劉　穎,詹宇威

(海南省人民醫(yī)院腎病風(fēng)濕科，?？?570311)

可溶性klotho在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的變化及意義

林書典,詹鋒△,潘楚瑛,張延,劉穎,詹宇威

(海南省人民醫(yī)院腎病風(fēng)濕科，?？?570311)

[摘要]目的初步研究可溶性klotho(s-kl)在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)和狼瘡性腎炎(LN)中的變化及其意義。方法收集34例首診首治SLE患者，根據(jù)是否合并LN分為SLE不合并LN組(SLE組，19例)和合并LN組(LN組，15例)，將17例常規(guī)體檢者列為對照組。常規(guī)檢測24 h尿蛋白定量(24 h Upro)、血常規(guī)、血生化指標(biāo)和雙鏈DNA(dsDNA)。采用ELISA法檢測s-kl、25羥基維生素D(25-OH-D)和成纖維細(xì)胞生長因子-23(FGF-23)。對SLE組和LN組患者進(jìn)行SLE疾病活動(dòng)度評分(SLEDAI)，根據(jù)Cockcroft-Gault公式計(jì)算內(nèi)生肌酐清除率(CCr)。比較3組間差異并對相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果在SLE組和LN組中平均動(dòng)脈壓、血常規(guī)、酶學(xué)[肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)]、補(bǔ)體(補(bǔ)體C3和補(bǔ)體C4)及dsDNA與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對照組及SLE組比較，LN組24 h Upro、血脂[總膽固醇(CHOL)，三酰甘油(TG)]和血肌酐(SCr)顯著升高，而血清清蛋白(ALB)和CCr明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 SLE組與對照組s-kl、25-OH-D和FGF-23比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而在LN組中s-kl、25-OH-D及FGF-23血清水平與對照組和SLE組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。LN組患者SLEDAI評分較SLE組評分高(P<0.05)。相關(guān)分析表明，s-kl與25-OH-D、C3及C4存在正相關(guān)關(guān)系，與FGF-23、SLEDAI和dsDNA存在負(fù)相關(guān)關(guān)系(均P<0.05)?；貧w分析提示，s-kl、25-OH-D和FGF-23與SLE活動(dòng)度無明顯關(guān)系。結(jié)論SLE和LN患者體內(nèi)s-kl水平的降低，可能是引起FGF-23升高的關(guān)鍵因素之一，由此進(jìn)一步導(dǎo)致SLE和LN患者維生素D(VitD)缺乏和病情活動(dòng)。

[關(guān)鍵詞]klotho；紅斑性狼瘡，系統(tǒng)性；腎炎；維生素D

klotho是一新發(fā)現(xiàn)的抗衰老基因，主要表達(dá)于大腦脈絡(luò)膜和腎臟組織中，其生物學(xué)影響可達(dá)全身各器官臟器。klotho基因缺失或表達(dá)低下可出現(xiàn)諸多臨床表現(xiàn)，如動(dòng)脈硬化、骨質(zhì)疏松、氧化應(yīng)激、肺氣腫、早衰、不孕不育、免疫功能異常、內(nèi)分泌功能失調(diào)據(jù)和生長發(fā)育遲緩等。系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是導(dǎo)致全身多系統(tǒng)臟器損害的自身免疫性疾病，其臨床表現(xiàn)與kloth基因缺失表型相似，尤其腎臟是其損害的重要器官。研究已證實(shí)，血液中可溶性klotho(soluble klotho，s-kl)主要來源于正常的腎臟組織，隨著腎臟損傷加重和功能衰竭，其表達(dá)的s-kl基因及產(chǎn)物逐漸減少[1-2]，這提示s-kl基因表達(dá)狀況及其生物學(xué)功能特征與狼瘡性腎炎(lupus nephritis，LN)的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，提示s-kl可能參與了LN的發(fā)生發(fā)展。本研究通過檢測普通體檢者及SLE和LN患者體內(nèi)s-kl的變化，初步探討s-kl在SLE及LN中的意義。

1資料與方法

1.1一般資料本研究入選病例為自2013年1月至2014年12月在本院腎病風(fēng)濕科住院的首診首治SLE患者，所有患者均符合1997年ACR SLE分類標(biāo)準(zhǔn)和(或)LN診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，共51例，其中17例因合并其他疾病，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、皮肌炎、慢性病毒性肝炎等，被剔除，其余34例為未合并其他疾病的單純SLE患者納入研究，并進(jìn)行SLE疾病活動(dòng)指數(shù)(SLEDAI)評分。根據(jù)是否合并LN分為SLE不合并LN組(SLE組，19例)和合并LN組(LN組，15例)。選擇同時(shí)期年齡性別匹配，在本院體檢中心進(jìn)行常規(guī)體檢者17例為對照組，對照組納入標(biāo)準(zhǔn)為常規(guī)體檢未發(fā)現(xiàn)高血壓、腎臟疾病和骨骼疾病及其他臟器疾病(如心、肺、腦、肝臟等)，無常見風(fēng)濕免疫病癥狀和體征，血糖、酶學(xué)、肝腎功能、心肌酶、類風(fēng)濕因子、C反應(yīng)蛋白(CRP)、補(bǔ)體及抗核抗體(ANA)和雙鏈DNA(dsDNA)等基本正常者。所有入選對象自本研究開始前4周內(nèi)均未服用激素和免疫抑制劑及影響鈣磷代謝的藥物。本研究獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，參與本研究對象均知情同意。

1.2方法

1.2.1常規(guī)血清學(xué)指標(biāo)檢測納入本研究者，留取24 h尿液采用雙縮脲法檢測24 h尿蛋白定量(24 h Upro)。清晨空腹采靜脈血(2×10 mL)，提取血清置-80 ℃低溫冰箱中保存?zhèn)錂z測。血常規(guī)采用全自動(dòng)血液細(xì)胞學(xué)分析儀檢測，全自動(dòng)生化分析儀檢測肝腎功能、血脂、血糖、酶學(xué)、補(bǔ)體、類風(fēng)濕因子及CPR等。根據(jù)Cockcroft-Gault公式計(jì)算內(nèi)生肌酐清除率(CCr)。ANA和dsDNA分別采用間接熒光免疫法和ELISA法，試劑盒為歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷股份公司。

1.2.2s-kl、25-OH-D及FGF-23檢測血清中s-kl(Immuno-Biological Laboratories公司，日本)、25羥基維生素D(25-hydroxy vitamin D，25-OH-D,北京榮志海達(dá)生物科技有限公司)，成纖維細(xì)胞生長因子-23(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF-23,上海基免生物技術(shù)有限公司)的檢測，均采用ELISA法檢測，按照產(chǎn)品試劑盒說明書操作。

2結(jié)果

2.1納入研究者臨床基本資料比較所有納入本研究的51名研究對象，按照研究設(shè)計(jì)分為對照組(17例)、SLE組(19例)和LN組(15例)。3組在年齡、性別比、體質(zhì)量、肝功能和血糖方面的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在SLE組和LN組中MAP、血常規(guī)(WBC、Hb和PLT)、酶學(xué)(CK和LDH)、補(bǔ)體(C3和C4)及dsDNA與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對照組和SLE組比較，LN組中24 h Upro、血脂(CHOL和TG)和SCr均有顯著升高，而ALB和CCr下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1　3組患者臨床基本資料比較±s)

MAP:平均動(dòng)脈壓；WBC：白細(xì)胞；Hb：血紅蛋白；PLT：血小板；ALT：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；AST：天門冬氨酶氨基轉(zhuǎn)移酶；CK：肌酸激酶；LDH：乳酸脫氫酶；SCr：血清肌酐；CHOL：總膽固醇；TG：三酰甘油；a：P<0.05,與對照組比較;b：P<0.05,與SLE組比較；-：此項(xiàng)無數(shù)據(jù)。

2.2各組s-kl、25-OH-D、FGF-23和SLEDAI評分從表2中可以看出，盡管s-kl、25-OH-D和FGF-23在SLE組與對照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但與對照組比較，SLE組s-kl和25-OH-D有下降,FGF-23有升高的趨勢，而在LN組中s-kl、25-OH-D和FGF-23與對照組和SLE組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并且，LN組SLEDAI評分比SLE組評分更高，病情活動(dòng)更嚴(yán)重(P<0.05)。

表2　3組中s-kl,25-OH-D,FGF-23 及 SLEDAI

a：P<0.05,與對照組比較;b：P<0.05,與SLE組比較；-：此項(xiàng)無數(shù)據(jù)。

2.3s-kl與25-OH-D和FGF-23及與SLE病情活動(dòng)有關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果提示，s-kl與25-OH-D、C3及C4呈正相關(guān)(P<0.05)，與FGF-23、SLEDAI評分和dsDNA呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

表3　s-kl與25-OH-D、FGF-23、C3、C4及

2.4s-kl、25-OH-D和FGF-23與SLEDAI評分的線性回歸分析為了進(jìn)一步了解s-kl、25-OH-D和FGF-23能否預(yù)測SLE活動(dòng)度，作者進(jìn)行了線性回歸分析，從結(jié)果可以看到，s-kl、25-OH-D和FGF-23與SLE活動(dòng)度無依存回歸關(guān)系，三者不能對SLE活動(dòng)度做出預(yù)判。見表4。

表4　s-kl、25-OH-D和FGF-23與SLEDAI評分的

3討論

klotho是一新發(fā)現(xiàn)的抗衰老基因，其表達(dá)缺失或降低可導(dǎo)致一系列表型與慢性腎臟病類似的臨床表現(xiàn)，如動(dòng)脈硬化、骨質(zhì)疏松、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)紊亂、氧化應(yīng)激及生長發(fā)育遲滯和不孕不育等，又因腎臟是klotho基因表達(dá)的主要器官，其在腎臟疾病中的作用日益受到重視。klotho基因是一跨膜蛋白，以兩種形式存在，即膜結(jié)合性klotho(membrane klotho，m-kl)和s-kl。研究認(rèn)為，klotho作為重要的輔助因子，可誘導(dǎo)FGF-23對成纖維細(xì)胞生長因子受體(fibroblast growth factors receptors，F(xiàn)GFRs)及下游信號分子的激活，從而使FGF-23發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。FGF-23是成纖維細(xì)胞生長因子家族成員之一，在骨組織中產(chǎn)生的一種激素樣物質(zhì)，其主要功能是參與維生素D(vitamin D，VitD)的代謝和鈣磷調(diào)節(jié)。

SLE是一種涉及多系統(tǒng)多器官的自身免疫性疾病，腎臟是受累最嚴(yán)重的器官之一。越來越多的研究已經(jīng)證明，SLE與動(dòng)脈粥樣硬化、氧化應(yīng)激、免疫調(diào)節(jié)及代謝紊亂等密切相關(guān)，VitD的缺乏可能是SLE病情活動(dòng)和進(jìn)展的重要因素之一[4]。尤為重要的是，腎臟的受累和激素治療后出現(xiàn)的鈣磷失調(diào)和VitD水平下降，導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松，更是影響患者預(yù)后和生存質(zhì)量的重要因素[5]。目前的研究表明，klotho具有調(diào)節(jié)和抑制上述病理過程的功能，但迄今為止，其在SLE和LN中的作用仍知之甚少。本研究初步研究了s-kl、FGF-23和25-OH-D在SLE和LN的水平。從研究結(jié)果中可以看到，雖然SLE患者與普通體檢者血清中s-kl、FGF-23及25-OH-D水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但SLE患者體內(nèi)s-kl和25-OH-D已有下降，且FGF-23出現(xiàn)上升趨勢，而在LN患者中這一趨勢更加明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。SLE患者由于為了防止病情加重或復(fù)發(fā)而減少日曬，加之腎功能受損及激素的應(yīng)用，導(dǎo)致體內(nèi)VitD代謝障礙，普遍存在VitD缺乏，而SLE患者體內(nèi)的VitD水平低下是與SLE疾病活動(dòng)程度呈顯著負(fù)相關(guān)的[6]。研究還發(fā)現(xiàn)，SLE患者中VitD缺乏癥與自身抗體的產(chǎn)生[7]、糖脂代謝異常、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、骨質(zhì)疏松及疲乏關(guān)系密切，盡管這些觀察結(jié)果有待得到更多試驗(yàn)的驗(yàn)證，但仍能提示VitD水平的低下可能影響SLE患者的長期生存率和病死率。最近的臨床研究表明，補(bǔ)充VitD可以改善SLE患者體內(nèi)免疫紊亂和特異性生物學(xué)指標(biāo)的異常，并且SLE患者對服用較大劑量的ViD3呈現(xiàn)良好的耐受性[8]。

研究已經(jīng)證明，F(xiàn)GF-23是一種由骨組織產(chǎn)生的激素，腎臟是其發(fā)揮生理學(xué)效應(yīng)的重要靶器官之一，參與磷和VitD的代謝調(diào)節(jié)。在FGF-23基因缺陷的小鼠中，存在動(dòng)脈硬化、骨質(zhì)疏松、性腺功能減退、全身器官功能受損等表現(xiàn)，這一現(xiàn)象與SLE患者和klotho基因缺陷的表型特征有明顯相似。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF-23發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)存在一個(gè)反饋環(huán)路，F(xiàn)GF-23可下調(diào)腎臟25羥化D的1α羥化酶表達(dá)，抑制1,23-(OH)2D生成，同時(shí)1,23-(OH)2D也可通過作用于FGF-23啟動(dòng)子上游的VitD反應(yīng)元件(vitamin D response elements,VDRE)增加FGF-23的合成，可能導(dǎo)致VitD抵抗。Lee等[9]和Lai等[10]研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)孢素A可下調(diào)VitD受體表達(dá)，導(dǎo)致VitD抵抗，其在SLE患者體內(nèi)的累積量與血清1,23-(OH)2D水平呈反比，與FGF-23呈正比，提示SLE患者體內(nèi)FGF-23水平的上調(diào)可導(dǎo)致VitD水平的降低。結(jié)合本研究，與普通體檢者比較，SLE和LN患者中FGF-23血清水平上升，而在LN患者中更加顯著(均P<0.05)，由此推測FGF-23可能是影響SLE患者，尤其是LN患者體內(nèi)影響VitD血清水平的關(guān)鍵因素之一。

迄今為止，klotho在腎臟病中的研究已成為熱點(diǎn)，尤其在腎性骨病和慢性腎纖維化中的研究更為深入[11-12]，而klotho在SLE和LN中的研究罕見公開報(bào)道。klotho水平低下與大量蛋白尿和腎功能惡化密切相關(guān)，在本試驗(yàn)LN組患者再次得到驗(yàn)證。研究已證實(shí)，m-kl可與FGFRs結(jié)合形成klotho-FGFRs復(fù)合物，盡管s-kl不直接與FGF-23直接結(jié)合，但血中s-kl水平可反映腎組織中klotho蛋白表達(dá)水平，并能極大地增強(qiáng)FGF-23與klotho-FGFRs復(fù)合物結(jié)合的親和力，從而使FGF-23失去生物學(xué)活性[13]。為了探討s-kl在SLE中的作用，進(jìn)一步的相關(guān)分析提示，s-kl與25-OH-D、C3及C4呈正相關(guān)(P<0.05)，與FGF-23、SLEDAI和dsDNA呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，表明klotho可能也是影響SLE活動(dòng)的因素之一。但回歸分析中并未發(fā)現(xiàn)s-kl、25-OH-D和FGF-23與SLE疾病活動(dòng)度具有依存關(guān)系，提示三者不能對SLE活動(dòng)度做出預(yù)判。

盡管本試驗(yàn)未能直接證明s-kl在SLE發(fā)病中的作用，但結(jié)合本研究結(jié)果和已有文獻(xiàn)資料，作者推測SLE和LN患者體內(nèi)s-kl水平的降低，可能是引起FGF-23升高的關(guān)鍵因素之一，由此進(jìn)一步導(dǎo)致SLE和LN患者VitD缺乏和病情活動(dòng)。

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The role of soluble klotho in patients with systemic lupus erythematosus*

LinShudian,ZhanFeng△,PanChuying,ZhangYan,Liuying,ZhanYuwei

(DepartmentofNephrologyandRheumatology,People′sHospitalofHainanProvince,Haikou,Hainan570001,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the serum concentration of soluble klotho (s-kl) in systemic lupus erythematosus (SLE) and lupus nephritis (LN),and elucidate its role in SLE and LN.MethodsA total of 34 patients，definitely diagnosis as SLE with un-treatment firstly，were enrolled in this study.The patient were divided into two groups,those who complicated with LN were assigned to LN group (15 cases),the others were distributed to SLE group (19 cases).At the same time,17 cases of routine physical examination people were take as control group.24 hours urine of all the cases was collected for examining urinary protein (Upro).Routine hemocyte analysis,serum biochemical parameters and ANA and dsDNA were measured by routine method.ELISA was used to detect s-kl,25-hydroxy vitamin D (25-OH-D) and fibroblast growth factor-23 (FGF-23).Systemic lupus erythematosus disease activity index (SLEDAI) was performed in SLE and LN group,and the creatinine clearance rate(CCr)was calculated according to the Cockcroft-Gault formula.Pearson′s and linear regression were applied to analyisis the correlation of relevant parameters.ResultsAs compared with the control group,there were statistically significant differences in mean arterial pressure,blood routine,creatine kinase (CK) and lactate dehydrogenase (LDH),complement (C3 and C4) and dsDNA in SLE and LN group (P<0.05).The level of Upro/24 h,lipids (CHOL and TG) and creatinine (Scr) in LN group was significantly higher,while serum albumin (ALB) and CCr were obviously lower than those in SLE group and control goup(P<0.05).Difference of s-kl,25-OH-D and FGF-23 in serum were not observed between SLE and control gropu(P>0.05),but the serum level of s-kl,25-OH-D and FGF-23 in LN group were showed a statistical significance when compared with SLE or control group(P<0.05).Meanwhile,the SLEDAI score was higher in LN than in SLE group(P<0.05).Correlation analysis indicted that s-kl exhibited a positive relationship with 25-OH-D,C3 and C4,while showed a negative correlation with FGF-23,SLEDAI and dsDNA(all P<0.05).However,no any correlationt was revealed in regression analysis between the s-kl,25-OH-D,FGF-23 and the lupus activity.ConclusionThe decrease of s-kl maybe one of the pivotal factors that up-regulated the level of FGF-23 in SLE and LN patients,thus lead to the deficiency of vitamin D and lupus activity.

[Key words]klotho;lupus;lupus erythematosus,systemic;nephritis;vitamin D

doi:論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.02.010

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81360118)；海南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(309087)。

作者簡介：林書典(1974-)，副主任醫(yī)師，博士，主要從事免疫性腎病、慢性腎臟病研究。 △通訊作者，E-mail:renal@126.com。

[中圖分類號]R33

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)02-0176-04

(收稿日期：2015-08-22修回日期：2015-09-18)