宋國龍，趙雪芹，孔祥東

（浙江理工大學(xué)，生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310018）

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Ca2+對CdTe量子點(diǎn)復(fù)合絲素蛋白凝膠的影響

宋國龍，趙雪芹，孔祥東

（浙江理工大學(xué)，生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310018）

摘要：本實(shí)驗利用LiBr法溶解絲素并制備其蛋白凝膠，基于CdTe量子點(diǎn)（quantum dots，QDs）本身固有的優(yōu)良光學(xué)性能，通過熒光分光光度計分別測定不加Ca2+時和加入不同濃度的Ca2+時，CdTe量子點(diǎn)與絲素蛋白凝膠復(fù)合過程中熒光強(qiáng)度的變化，該實(shí)驗結(jié)果證明CdTe量子點(diǎn)與絲素蛋白凝膠的復(fù)合需要Ca2+的介導(dǎo)，并且在一定范圍內(nèi)二者結(jié)合強(qiáng)度與Ca2+的加入量呈正相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：CdTe量子點(diǎn)；絲素蛋白凝膠；鈣離子；熒光復(fù)合物

量子點(diǎn)（quantum dots，QDs）是一種納米尺寸的準(zhǔn)零維團(tuán)簇粒徑在1～10 nm之間，由于QDs三個維度的尺寸都在100 nm以下，電子和空穴均被量子限域，造成QDs能帶由連續(xù)能級結(jié)構(gòu)變成分離的能級結(jié)構(gòu)，從而表現(xiàn)出與塊體材料完全不同的光學(xué)特性，如激發(fā)波長范圍寬、發(fā)射波長范圍窄且對稱、量子產(chǎn)率高、熒光壽命長、光學(xué)性能穩(wěn)定等。隨著量子點(diǎn)水相合成法的不斷改進(jìn)，所合成量子點(diǎn)的熒光產(chǎn)率不斷升高，1993年Rajh等［1］第一次實(shí)現(xiàn)了在水相中直接合成巰基甘油修飾的CdTe QDs。Guo等［2］合成的巰基乙酸包覆的CdTe QDs，熒光量子產(chǎn)率高達(dá)50%。Rogach等［3］合成經(jīng)巰基乙酸（Thioglycolic acid，TGA）修飾的CdTe QDs，其熒光量子產(chǎn)率提高到60%。于是，量子點(diǎn)作為離子探針和生物探針在離子檢測與生物成像方面的應(yīng)用得到了進(jìn)一步的發(fā)展。Isarov等［4］對QDs與金屬離子相互作用的機(jī)理進(jìn)行了研究，Cu2+能夠猝滅CdS QDs，推測其猝滅機(jī)理可能是是Cu2+在QDs的表面，被還原為Cu+，產(chǎn)生的Cu+又引起QDs導(dǎo)帶的電子與價帶發(fā)生空穴重組，從而使QDs的熒光猝滅。QDs作為熒光探針標(biāo)記生物體系的構(gòu)思最初是由Alivisatos等［5］提出的，基于QDs熒光的猝滅與恢復(fù)，可以將QDs用于生物成分如胰蛋白酶［6］、淋巴細(xì)胞［7］等的標(biāo)記與成像。

絲素蛋白是從蠶絲中提取的天然高分子纖維蛋白，具有良好的機(jī)械性能和理化性質(zhì)，如良好的柔韌性和抗拉伸強(qiáng)度、透氣透濕性、緩釋性［8］等，并且經(jīng)過不同處理可以得到不同的形態(tài)，如纖維、溶液、粉體、膜［9］以及凝膠［10］等。絲素蛋白溶液可以通過改變濃度［11］、pH值［12］或物理超聲功率［13］等條件轉(zhuǎn)變?yōu)槟z狀態(tài)以及加速絲素蛋白凝膠化的進(jìn)程。本實(shí)驗用Li-Br法制備絲素蛋白水溶液，在經(jīng)過透析濃縮得到絲素蛋白凝膠。將制備的CdTe QDs分別與絲素蛋白凝膠混合，經(jīng)過物理超聲、離心處理之后，再用熒光分光光度計分別測定CdTe QDs/絲素蛋白凝膠復(fù)合物上清與沉淀物的熒光強(qiáng)度來研究CdTe QDs與絲素蛋白凝膠復(fù)合過程。CdTe QDs具有優(yōu)異的熒光性能，其對細(xì)胞的毒性依賴于它的用量［14］，與絲素蛋白凝膠復(fù)合之后也會降低CdTe QDs的毒性［15］。同時，絲素蛋白是一種天然的生物材料，廣泛用于骨組織修復(fù)［16，17］和藥物運(yùn)輸［18，19］，具有良好的生物相容性。通過研究CdTe QDs與絲素蛋白凝膠的復(fù)合，可以整合二者的優(yōu)勢，得到性能更好、應(yīng)用更廣泛的復(fù)合材料。

1　材料與方法

1.1材料

醋酸鎘二水合物，亞碲酸鉀，硼氫化鈉，巰基乙酸，氫氧化鈉，氯化鈣，碳酸鈉，溴化鋰購于上海Aladdin試劑公司。濃鹽酸購于華東醫(yī)藥股份有限公司。去離子水由Milipore純水儀制備。

1.2方法

1.2.1CdTe QDs的制備［20］

量取濃度為4 mM的醋酸鎘溶液50 mL置于圓底燒瓶中，并用1 M NaOH溶液調(diào)節(jié)pH在10.5～11.0之間并進(jìn)行持續(xù)攪拌，反應(yīng)5 min；加入18 μL TGA，并用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH在10.5～11.0之間，反應(yīng)5 min；量取濃度為0.8 mM的K2TeO3溶液50 mL以及80 mg NaBH4加入體系之中，維持pH在10.5～11.0之間，持續(xù)反應(yīng)5 min；將圓底燒瓶置于油浴鍋中，調(diào)節(jié)溫度為120℃進(jìn)行冷凝回流反應(yīng)，每隔15 min進(jìn)行取樣保存；用無水乙醇離心洗滌至上清液在紫外燈下無熒光，分離出沉淀，將沉淀放入凍干機(jī)內(nèi)冷凍干燥后，保存待用。

1.2.2絲素蛋白凝膠的制備［21］

用0.5 wt%Na2CO3水溶液精練繭層2次，每次30 min，精練溫度98℃，浴比為1∶100。

精練后用蒸餾水充分洗凈，自然干燥，得到絲素蛋白纖維。用9.3 M的LiBr溶液溶解絲素蛋白纖維，溶解溫度為60℃，浴比為1∶5，將混合溶液置于磁力攪拌器上溶解6 h。將溶解后的得到的溶液經(jīng)過紗布過濾之后，灌入透析袋（截留分子量12000～14000）中，在流水中透析3 d。取出透析袋放在支架上用小風(fēng)扇過夜風(fēng)吹濃縮得到絲素蛋白凝膠。

1.2.3CdTe QDs/絲素蛋白復(fù)合物的制備

本實(shí)驗所用的CdTe QDs在冷凝回流時間45 min后，經(jīng)過F-4500熒光分光光度計的三維掃描測得該CdTe QDs的最大激發(fā)波長為362 nm，最大發(fā)射波長為530 nm。

取500 μL 2 mg/mL絲素蛋白凝膠，加入100 μL 2 mM CdTe QDs；超聲處理30 min，然后10 000 rpm離心3 min，收集上清，重懸沉降物，再離心兩次同時收集上清，最后加入500 μL去離子水重懸沉淀物，利用熒光分光光度計檢測三次離心的上清以及最后的沉淀物重懸液的熒光強(qiáng)度。

取500 μL 2 mg/mL絲素蛋白凝膠，加入50 μL 2 mM CdTe QDs；然后向每只離心管中各加入50 μL不同濃度的Ca2+：濃度梯度為1 mM、10 mM、100 mM。超聲處理30 min，然后10000 rpm離心3 min，收集離心的上清并且用去離子水重懸沉淀物。利用F-4500熒光分光光度計檢測上清以及最后的沉淀物重懸液的熒光強(qiáng)度。

2　結(jié)果與分析

2.1不含Ca2+時，絲素蛋白凝膠與CdTe QDs的復(fù)合過程的熒光光譜圖

圖1　CdTe QDs與絲素蛋白凝膠復(fù)合過程的熒光光譜圖Figure 1 Fluorescence spectrum of the recombination process of CdTe QDs and SF gel

凝膠復(fù)合過程的熒光強(qiáng)度變化情況如圖1所示。由圖1可知，CdTe QDs與絲素蛋白凝膠復(fù)合過程中三次離心收集的上清以及最后沉降物的重懸液，經(jīng)過熒光分光光度計檢測它們的熒光強(qiáng)度分別為319.4，20.4，0，0。從該熒光光譜圖可以看出，前兩次離心所得上清的熒光強(qiáng)度從319.4急劇衰減至20.4，說明溶液中的CdTe QDs絕大部分都沒有與絲素蛋白凝膠結(jié)合，而是游離在上清之中；經(jīng)過第三次離心，沉淀物的熒光強(qiáng)度降低至0，這說明CdTe QDs不能與絲素蛋白凝膠復(fù)合，至少是不能穩(wěn)定的結(jié)合在一起。

2.2加入不同濃度的Ca2 +后，絲素蛋白凝膠與CdTe QDs的復(fù)合過程的熒光光譜圖

加入不同濃度的Ca2+之后，CdTe QDs與絲素蛋白凝膠的復(fù)合過程上清的熒光強(qiáng)度變化如圖2所示。由圖2可知，CdTe QDs與絲素蛋白凝膠的混合體系中，不加入Ca2+時以及加入三種不同濃度的Ca2+后，利用熒光分光光度計檢測它們的離心所得上清的熒光強(qiáng)度分別為166.5，162.3，10.65，0，混合體系上清中熒光強(qiáng)度的變化情況與加入Ca2+的濃度高低呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性。加入Ca2+后，其可以介導(dǎo)CdTe QDs與絲素蛋白凝膠形成復(fù)合物，該復(fù)合物隨離心作用而與上清液分離。Ca2+能夠介導(dǎo)CdTe QDs與絲素蛋白凝膠之間的結(jié)合，并且在一定范圍內(nèi)Ca2+的加入量與二者結(jié)合強(qiáng)度呈正相關(guān)性。

圖2　加入不同濃度的Ca2+之后CdTe QDs與絲素蛋白凝膠的復(fù)合過程上清的熒光光譜圖Figure 2 Fluorescence spectrum of supernate in the recombination process of CdTe QDs and SF gel with different concentration Ca2+solution

圖3　加入不同濃度的Ca2+之后CdTe QDs與絲素蛋白凝膠復(fù)合過程中沉淀物重懸后的熒光光譜圖Figure 3 Fluorescence intensity of resuspending precipitate in the recombination process of CdTe QDs and SF gel

加入不同濃度的Ca2+之后，CdTe QDs與絲素蛋白凝膠復(fù)合過程中沉降物重懸后的熒光強(qiáng)度變化情況如圖3所示。CdTe QDs與絲素蛋白凝膠混合體系中加入三種不同濃度的Ca2+后得到的沉淀物重懸液經(jīng)過熒光分光光度計檢測它們的熒光強(qiáng)度分別為33.95，1.85，0。從該熒光光譜圖可以看出，沉淀物重懸液中CdTe QDs熒光強(qiáng)度的變化由強(qiáng)到弱，該變化趨勢與加入Ca2+濃度的變化呈現(xiàn)正相關(guān)性。該實(shí)驗結(jié)果與CdTe QDs和絲素蛋白凝膠復(fù)合過程上清中所檢測到的熒光強(qiáng)度變化情況一致，排除了實(shí)驗過程中CdTe QDs熒光強(qiáng)度淬滅因素的干擾，從兩個方面確定了CdTe QDs和絲素蛋白凝膠的復(fù)合過程需要Ca2+的介導(dǎo)。其原因推測是CdTe QDs經(jīng)過巰基乙酸修飾，表面帶有負(fù)電荷，絲素蛋白也呈現(xiàn)負(fù)電性，加入Ca2+之后打破了CdTe QDs與絲素蛋白凝膠之間的電荷斥力的壁壘，架起了二者復(fù)合的橋梁。

3　結(jié)論

本實(shí)驗研究了CdTe QDs與絲素蛋白凝膠的復(fù)合過程以及Ca2+濃度對該過程的影響作用。結(jié)果表明：CdTe QDs與絲素蛋白凝膠的復(fù)合需要Ca2+的介導(dǎo)，否則二者無法結(jié)合；CdTe QDs與絲素蛋白凝膠的結(jié)合強(qiáng)度與加入Ca2+的濃度有關(guān)，Ca2+濃度越高，二者的復(fù)合程度越好。隨著Ca2+濃度的提高，CdTe QDs與絲素蛋白凝膠之間的結(jié)合程度加強(qiáng)。該實(shí)驗解決了CdTe QDs與絲素蛋白凝膠之間不能復(fù)合的問題，CdTe QDs與絲素蛋白凝膠的復(fù)合可以整合二者的優(yōu)勢，有利于進(jìn)一步拓展絲素蛋白凝膠在藥物載體、防偽標(biāo)記等方面的應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

［1］Rajh T，Micic O I，Nozik A J. Synthesis and characterization of surface- modified colloidal Cadmium Telluride quantum dots［J］. Journal of Physical Chemistry，1993，97 （46）：11999～12003.

［2］Guo J，Yang W，Wang C. Systematic study of the photoluminescence dependence of thiol-capped CdTe nanocrystals on the reaction conditions［J］. Journal of Physical Chemistry B，2005，109（37）：17467～17473.

［3］Rogach A L，F(xiàn)ranzl T，Klar TA，et al. Aqueous synthesis of thiol-capped CdTe nanocrystals：State-of-the-art［J］. Journal of Physical Chemistry C，2007，111（40）：14628～14637.

［4］Isarov A V，Chrysochoos J. Optical and photochemical properties of nonstoichiometric Cadmium Sulfide nanoparticles：Surface modification with Copper（ii）ions［J］. Langmuir，1997，13（12）：3142～3149.

［5］Bruchez M，Moronne M，Gin P，et al. Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels［J］. Science，1998，281（5385）：2013～2016.

［6］Zhang H，Sun P，Liu C，et al. L-cysteine capped CdTe-CdS Core-shell quantum dots：Preparation，characterization and immuno- labeling of HeLa cells［J］. Luminescene，2011，26（2）：86～92.

［7］Dong W，Ge X，Wang M，et al. Labeling of BSA and imaging of mouse T-lymphocyte as well as mouse spleen tissue by L-glutathione capped CdTe quantum dots［J］. Luminescence，2010，25（1）：55～60.

［8］Khalid A，Mitropoulos A N，Marelli B，et al. Doxorubicin loaded nanodiamond-silk spheres for fluorescence tracking and controlled drug release［J］. Biomedical Optics Express，2015，7（1）：132～147.

［9］Wang Y，Kim H J，Vunjak-Novakovic G，et al. Stem cellbased tissue engineering with silk biomaterials［J］. Biomaterials，2006，27（36）：6064～6082.

［10］Kundu B，Rajkhowa R，Kundu S C，et al. Silk fibroin biomaterials for tissue regenerations［J］. Advanced Drug Delivery Reviews，2013，65（4）：457～470.

［11］Motta A，Migliaresi C，F(xiàn)accioni F，et al. Fibroin hydrogels for biomedical applications：preparation，characterization and in vitro cell culture studies［J］. Journal of Biomaterials Science- Polymer Edition，2004，15（7）：851～864.

［12］Guziewicz N，Best A，Perez-Ramirez B，et al. Lyophilized silk fibroin hydrogels for the sustained local delivery of therapeutic monoclonal antibodies［J］. Biomaterials，2011，32（10）：2642～2650.

［13］Wu X，Hou J，Li M，et al. Sodium dodecyl sulfate-induced rapid gelation of silk fibroin［J］. Acta Biomaterialia，2012，8（6）：2185～2192.

［14］Sun Y Y，Hu M，F(xiàn)an C H，et al. The cytotoxicity of CdTe quantum dots and the relative contributions from released cadmium ions and nanoparticle properties［J］. Biomaterials，2010，31（18）：4829～4834.

［15］Soenen S J，Demeester J，Smedt S C D，et al. The cytotoxic effects of polymer-coated quantum dots and restrictions for live cell applications［J］. Biomaterials，2012，33 （19）：4882～4888.

［16］Kasoju N，Bora U. Silk Fibroin in Tissue Engineering［J］. Advanced Healthcare Materials，2012，1（4）：393～412.

［17］Mottaghitalab F，Hosseinkhani H，Shokrgozar M A，et al. Silk as a potential candidate for bone tissue engineering ［J］. Journal of Controlled Release，2015，215：112～128.

［18］Germershaus O，Werner V，Kutscher M，et al. Deciphering the mechanism of protein interaction with silk fibroin for drug delivery systems［J］. Biomaterials，2014，35（10）：3427～3434.

［19］Esther W，Merkle H P，Lorenz M. Silk fibroin as a vehicle for drug delivery applications.［J］. Journal of Controlled Release，2010，150（2）：128～41.

［20］Wu S L，Dou J，Zhang J and Zhang S F. A simple and economical one- pot method to synthesize high- quality water soluble CdTe QDs［J］. Journal of Materials Chemistry，2012，22（29）：14573～14578.

［21］Cho H J and Um I C. The effect of dissolution condition on the yield，molecular weight，and wet- and electro-spinnability of regenerated silk fibroins prepared by LiBr aqueous solution［J］. International Journal of Industrial Entomology，2010，20（2）：99～105.

Effect of Ca2+on Recombination of CdTe QDs and Silk Fibroin Gel

SONG Guo-long，ZHAO Xue-qin，KONG Xiang-dong
（College of Life Sciences，Zhejiang Sci-Tech University，Hangzhou 310018，China）

Abstract：In this research，silk fibroin（SF）gel is prepared by silk fibroin dissolved in LiBr solution. We take advantage of quantum dots（QDs）itself inherent outstanding optical properties to determine the fluorescence intensity change of the recombination process of CdTe（Cadmium Telluride）QDs and SF gel by fluorescence spectrophotometer，without Ca2+and with different concentration Ca2+solution，respectively. This research proved that the recombination of CdTe QDs and SF gel is mediated by Ca2+，and showed a positive correlation with the addition of Ca2+in a certain range.

Key words：CdTe quantum dots；silk fibroin gel；calcium ion；fluorescence complex

中圖分類號：S886

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0258-4069［2016］01-016-04

基金項目：國家自然科學(xué)基金（51272236）；浙江理工大學(xué)521人才培養(yǎng)計劃（1610032521302）

作者簡介：宋國龍（1989-），男，碩士，主要從事生物材料與藥物載體方面的研究。E-mail：sgl19890325@163.com

通信作者：孔祥東，男，博士，教授。E-mail：kongxiangdong@gmail.com