徐衛(wèi)國，楊少君,王宇鵬,劉　云,張世偉,徐　洪,賈純亮,孫　紅,劉和亮

(1.河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤外科，河北唐山 063000;2.天津市北辰醫(yī)院腫瘤科　300400;3.河北省廊坊市中醫(yī)院內(nèi)科　065000;4.浙江省富陽市人民醫(yī)院腫瘤外科　311400;5.河北聯(lián)合大學(xué)醫(yī)學(xué)研究實驗中學(xué)，河北唐山 063000;6.河北省唐山市人民醫(yī)院胃腸外科　063000;7.河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，河北唐山 063000)

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胃癌組織中NRP-1的表達與臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性*

徐衛(wèi)國1，楊少君1,王宇鵬2,劉云3,張世偉4,徐洪5,賈純亮6,孫紅7,劉和亮5

(1.河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤外科，河北唐山 063000;2.天津市北辰醫(yī)院腫瘤科300400;3.河北省廊坊市中醫(yī)院內(nèi)科065000;4.浙江省富陽市人民醫(yī)院腫瘤外科311400;5.河北聯(lián)合大學(xué)醫(yī)學(xué)研究實驗中學(xué)，河北唐山 063000;6.河北省唐山市人民醫(yī)院胃腸外科063000;7.河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，河北唐山 063000)

[摘要]目的檢測胃癌組織中神經(jīng)纖毛蛋白-1(NRP-1)的表達,分析其與胃癌臨床病理特征之間的關(guān)系，探討其對判斷胃癌預(yù)后的價值。方法回顧性分析168例胃癌患者的臨床病理資料及預(yù)后情況,采用免疫組化法檢測癌組織及相對正常組織NRP-1的表達，研究NRP-1的表達與臨床病理及預(yù)后之間的關(guān)系。結(jié)果(1)NRP-1在胃癌組織中表達高于相對正常組織(66.7% vs.8.33%，P<0.05)。(2)NRP-1的表達與腫瘤大小、細(xì)胞分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)(P<0.05)。(3)NRP-1高表達的患者的生存期短于低表達的患者(中位生存期28個月vs.64個月，P<0.05)。(4)COX比例風(fēng)險模型進行多因素分析表明，NRP-1的表達為影響胃癌預(yù)后的獨立危險因素(P<0.05)。結(jié)論(1)NRP-1在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用，與胃癌的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。(2)NRP-1高表達提示預(yù)后不良。(3)NRP-1有望作為判斷胃癌生物學(xué)行為和預(yù)后的參考指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞]胃腫瘤;預(yù)后；神經(jīng)纖毛蛋白-1

胃癌是最常見的消化道腫瘤之一，在全世界居惡性腫瘤死亡率第2位[1]。我國胃癌的患病率及死亡率均明顯高于世界平均水平[2]。由于早期胃癌缺乏典型的臨床癥狀，臨床確診的胃癌病例多為進展期胃癌[3]。導(dǎo)致患者死亡的原因多為腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，而血液轉(zhuǎn)移及淋巴管轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的重要途徑。神經(jīng)纖毛蛋白-1(neuropilin-1,NRP-1)于1995年首次被Fujisawa等[4]發(fā)現(xiàn)并命名。后被證明NRP-1可與神經(jīng)軸突導(dǎo)向因子Semaphorin3A(Sema3)結(jié)合，在神經(jīng)發(fā)育過程起作用[5]。近來研究表明，NRP-1還可作為血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的受體，表達于腫瘤細(xì)胞，參與腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[6]。本文通過觀察胃癌組織中NRP-1的表達與臨床病理及預(yù)后的關(guān)系，進一步判斷NRP-1在胃癌預(yù)后中的影響。

1資料與方法

1.1一般資料收集河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院2005年1月至2010年12月行胃癌手術(shù)的168例患者(所有患者術(shù)前均未接受腫瘤相關(guān)治療,術(shù)后均未行放療、二次手術(shù)及生物免疫治療)的臨床病理資料，包括患者性別、年齡、發(fā)病部位、腫瘤大小、細(xì)胞分化程度、浸潤深度、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及是否行圍術(shù)期化療,并對上述患者行電話、書信隨訪。觀察終點為總生存期(overall survival,OS)，定義為確診胃癌時間至最后因癌腫引起死亡的時間。到隨訪截止時間2014年12月30日，168例患者中，6例失去聯(lián)系方式，12例死于其他疾病。168例胃癌病例中，男101例，女67例。年齡28～82歲，中位年齡54歲，60歲以下者98例，60歲及以上者70例。腫瘤原發(fā)部位：上部58例，中部72例，下部38例。原發(fā)腫瘤最大直徑大于5 cm者116例，小于或等于5 cm者52例。腫瘤細(xì)胞分化程度：高分化32例，中分化42例，低分化94例。腫瘤浸潤深度：侵及黏膜及黏膜下者19例，侵及肌層者57例，侵及漿膜及漿膜外者92例。無區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者26例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移1～7個者95例，大于7個者47例。行圍術(shù)期化療者104例，未行者64例。采用美國癌癥聯(lián)合會標(biāo)準(zhǔn)(第7版)對病理行TNM分期：Ⅰ期27例，Ⅱ期34例，Ⅲ期107例。

1.2切片來源及處理收集上述168例患者的術(shù)后癌組織及相對正常組織(距離瘤體5 cm以上[7])。各取組織標(biāo)本經(jīng)脫水，甲醛固定，二甲苯透明，蠟塊包埋，5 μm每層連續(xù)切片，用于免疫組化檢測NRP-1在胃癌組織中的表達。病理標(biāo)本及臨床資料的收集均由醫(yī)學(xué)倫理委員會討論通過。

1.3儀器與試劑免疫組化試劑盒及二抗購于北京中杉金橋公司，兔抗人NPR-1單克隆抗體購于巴傲德生物公司。主要儀器有光學(xué)顯微鏡等。

1.4實驗方法采用免疫組化染色法檢測168例胃癌組織中NRP-1 的表達。實驗均嚴(yán)格按照說明操作，采用PBS液為一抗行陰性對照實驗。

1.5免疫組化結(jié)果判定參照文獻[8]中的方法，對NRP-1的表達以陽性細(xì)胞百分率和染色強度得分總和進行判定。隨機選取5個高倍鏡視野(×400)：(1)陽性細(xì)胞數(shù)目低于5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，>50%為3分。(2)無染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩項相加，0分為陰性(-)，1～2分為弱陽性(+)，3～4分為中等陽性(++)，5～6分評為強陽性(+++)。兩項相加大于或等于3分為高表達，<3分為低表達。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。兩組間及多組間非等級資料差異采用χ2檢驗；多組間等級資料的比較，采用Mann-Whitney U法；生存分析采用Kaplan-Meier法，組間差異采用log-rank法檢驗；采用COX比例風(fēng)險回歸模型評估影響預(yù)后因子的獨立性。檢驗水準(zhǔn)α=0.05(雙側(cè))。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1胃癌組織中NRP-1蛋白水平的表達NRP-1表達于胃癌癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，染色為淡黃色至棕褐色為陽性表達，無特異染色者為陰性(圖1)。168例胃癌組織中，112例免疫組化結(jié)果評定為高表達，比率為66.7%；相對正常組織中，14例高表達，比率為8.33%，胃癌組織中NRP-1的陽性表達高于相對正常組織(χ2=121.956,P=0.000)。

A：正常組織中NRP-1的陽性表達;B：高分化腺癌中NRP-1的陽性表達;C：低分化腺癌組織中NRP-1的陽性表達;D:PBS代替一抗的陰性對照。

圖1胃癌組織及相對正常組織中NRP-1免疫組化染色結(jié)果

2.2胃癌組織中NRP-1的蛋白表達水平與臨床病理特征之間的關(guān)系將168例患者臨床病理資料與NRP-1表達情況進行統(tǒng)計學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)NRP-1的蛋白表達水平與腫瘤大小、細(xì)胞分化程度、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)(P<0.05)，而與患者性別、年齡及發(fā)病部位無關(guān)(P>0.05)，見表1。

2.3胃癌組織NRP-1的表達與預(yù)后的關(guān)系

2.3.1Kaplan-Meier法評定NRP-1的表達與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系168例胃癌患者的中位生存期為37個月，NRP-1低表達的患者中位生存期64個月，NRP-1高表達的患者中位生存期為28個月，log-rank檢驗表明組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=29.150,P=0.000)，見圖2。

2.3.2COX多因素分析本實驗組建立COX比例風(fēng)險模型，納入的臨床病理因素包括性別、年齡、發(fā)病部位、腫瘤大小、細(xì)胞分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、NRP-1的表達、TNM分期、是否行圍術(shù)期化療。進行多因素分析表明，TNM分期(95%CI 4.238～16.704，P=0.000)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(95%CI 2.046～4.767，P=0.000)、腫瘤浸潤深度(95%CI 1.001～2.027，P=0.049)、NRP-1的表達水平(95%CI 1.006～1.989，P=0.046)、圍術(shù)期化療(95%CI 0.390～0.939，P=0.025)是影響本組胃癌患者預(yù)后的獨立危險因素。性別、年齡、發(fā)病部位、腫瘤大小、細(xì)胞分化程度均不是影響本組胃癌患者預(yù)后的獨立危險因素(P>0.05)，見表2。

表1　胃癌組織中NRP-1的表達與臨床病理特征之間的關(guān)系

發(fā)病部位*：將胃的大、小彎等分3份，連接其對應(yīng)點，上1/3為上部，中1/3為中部，下1/3為下部。

圖2　NRP-1的表達與胃癌患者生存的關(guān)系

表2　168例胃癌患者COX比例風(fēng)險模型多因素分析結(jié)果

3討論

多項研究已經(jīng)證明NRP-1表達于多種惡性腫瘤細(xì)胞以及腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞[9]，如前列腺癌[10]、乳腺癌[11]、結(jié)直腸癌[12-13]、肝癌[14]等。NRP-1的表達在癌組織較為顯著，在癌旁及正常組織表達水平下降或不表達[15]。NRP-1作為VEGF的受體之一與VEGF-165結(jié)合，促進腫瘤血管的生成及腫瘤的增殖，從而參與腫瘤的生長、侵襲及轉(zhuǎn)移[16]。

本研究通過免疫組化方法檢測胃癌組織中NRP-1蛋白表達水平，同時分析相關(guān)的臨床病理數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)NRP-1的表達與腫瘤大小、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、細(xì)胞分化程度相關(guān)，與既往的報道基本一致[17-18]，表明NRP-1與胃癌的發(fā)生及發(fā)展過程相關(guān)。隨著腫瘤的直徑增大，胃周區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的增多，NRP-1的表達水平增高(P<0.05)，表明NRP-1可能參與了胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移；隨著臨床TNM分期的進展，NRP-1的表達發(fā)生變化(P<0.05)，說明NRP-1的表達與胃癌的惡性行為相關(guān)。

既往研究中曾證明，NRP-1和惡性腫瘤的預(yù)后有關(guān)，主要通過影響腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力及細(xì)胞敏感性影響預(yù)后生存[19-20]，可能成為腫瘤治療的新型靶點。Cheng等[21]應(yīng)用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)及免疫組化法檢測膀胱癌中的NRP-1的基因水平及蛋白水平的表達，經(jīng)多因素分析得出NRP-1的表達是影響膀胱癌預(yù)后的獨立因素。Osada等[22]也提出NRP-1的高表達提示神經(jīng)膠質(zhì)瘤的預(yù)后不良，且NRP-1的表達比VEGF的表達更能促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長及轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞中NRP-1蛋白水平高表達的患者中位生存期28個月，而低表達的患者中位生存期64個月，提示NRP-1的高表達者預(yù)后不良。本研究中建立的COX比例風(fēng)險模型多因素分析顯示TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度、圍術(shù)期化療為影響胃癌預(yù)后的獨立危險因素(P<0.05)，與既往研究基本一致[23-24]。本研究觀察到本組胃癌患者中NRP-1的表達是影響胃癌預(yù)后的獨立危險因素(P<0.05)，提示NRP-1的高表達水平與胃癌的臨床轉(zhuǎn)歸呈負(fù)相關(guān)。

綜上所述，筆者認(rèn)為NRP-1的表達與胃癌的部分臨床及病理特點相關(guān)，有望成為判斷預(yù)后的觀察指標(biāo)之一，且可能成為胃癌藥物治療的新型靶點。但本研究僅應(yīng)用免疫組化方法對NRP-1的蛋白水平進行分析，其基因?qū)W及分子影響機制尚不完全明確，有待進一步研究。

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Expression of NRP-1 in gastric cancer tissue and its correlation with clinicopathological characteristics and prognosis*

Xu Weiguo1,Yang Shaojun1,Wang Yupeng2,Liu Yun3,Zhang Shiwei4,Xu Hong5,Jia Chunliang6,Sun Hong7,Liu Heliang5

(1.Department of Oncologic Surgery,Affiliated Hospital of Hebei United University,Tangshan,Hebei 063000,China; 2.Department of oncology,Tianjin Beichen Hospital,Tianjin 300400,China; 3.Department of Internal Medicine,Langfang Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine, Langfang,Hebei 065000,China;4.Department of Oncologic Surgery,Fuyang Municipal People′s Hospital,Hangzhou,Zhejiang 310000,China;5.Hebei United University,Tangshan,Hebei 063000,China; 6.Department of Gastrointestinal Surgery,Tangshan Municipal People′s Hospital,Tangshan,Hebei 063000,China; 7.Department of Pathology,Basic Medical College,Hebei United University,Tangshan,Hebei 063000,China)

[Abstract]ObjectiveTo detect the expression of NRP-1 in gastric cancer tissue,to analyze its relationship with clinicopathological features,and to explore its value in judging the prognosis of gastric cancer.MethodsThe clinical pathologic data and prognosis situation in 168 cases of gastric cancer were retrospectively analyzed.The expression of NRP-1 in gastric cancer tissue and normal tissue was detected by the immunohistochemical method.The relationship between the expression of NRP-1 with the clinicopathological features and prognosis was investigated.Whether NRP-1 serving as a reference indicator for judging the prognosis of gastric cancer was evaluated.Results(1) In 168 cases,the NRP-1 expression in gastric cancer tissue was higher than that in normal tissue (66.7% vs. 8.33%,P<0.05).(2) The NRP-1 expression was related with the tumor size,differentiation degree,infiltrative depth,lymph node metastasis and TNM stage(P<0.05).(3)The median survival time in the patients with high NRP-1 expression was shorter than that in the patients with low NRP-1 expression (P<0.05).(4) The multiple factor analysis by COX proportional hazard model showed that the NRP-1 expression was an independent risk factor for the prognosis of gastric cancer(P<0.05).Conclusion(1)NRP-1 plays an important role in the incidence and development process of gastric cancer and its expression is closely related with the malignant biological behavior of gastric cancer.(2)The high NRP-1 expression prompts poor prognosis.(3)NRP-1 may be expected to be regarded as one of the indexes for judging the biologic behaviors and prognosis of gastric cancer.

[Key words]gastric neoplasms;prognosis;neuropilin-1

doi:論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.08.014

* 基金項目：河北省科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計劃(10276115D)。

作者簡介：徐衛(wèi)國(1966-),博士，主任醫(yī)師，主要從事腫瘤臨床與基礎(chǔ)方面的研究。

[中圖分類號]R735.2

[文獻標(biāo)識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)08-1049-04

(收稿日期：2015-09-17修回日期：2016-01-12)