楊立軍

(承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，河北承德 067000)

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基質(zhì)金屬蛋白酶-2及Bax在人腦膠質(zhì)瘤中的表達及意義

楊立軍

(承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，河北承德 067000)

[摘要]目的觀察人腦組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)和Bax的表達，并探討二者的臨床應用價值。方法收集該院人腦膠質(zhì)瘤患者腦組織標本50例及腦創(chuàng)傷內(nèi)減壓術(shù)中切除的腦組織標本20例，采用Western blot和免疫組織化學染色法測定腦組織中MMP-2和Bax的表達，并探討二者在膠質(zhì)瘤中的相關(guān)性。結(jié)果MMP-2在膠質(zhì)瘤腦組織中的表達高于正常腦組織(P<0.05)，在膠質(zhì)瘤Ⅰ～Ⅱ，Ⅲ～Ⅳ級中的陽性表達率分別為26.92%，70.83%(P<0.05)；Bax在腦膠質(zhì)瘤中的表達量低于正常腦組織，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，在膠質(zhì)瘤Ⅰ～Ⅱ，Ⅲ～Ⅳ級中的陽性表達率分別為76.95%、25.0%(P<0.05)。且人腦膠質(zhì)瘤中MMP-2和Bax的表達呈負相關(guān)(r=-0.587，P<0.01)。結(jié)論Bax蛋白表達在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中起著抑制作用，且與MMP-2蛋白呈負相關(guān)，二者聯(lián)合檢測可為膠質(zhì)瘤的診斷提供判斷指標。

[關(guān)鍵詞]人腦膠質(zhì)瘤；基質(zhì)金屬蛋白酶；Bax

膠質(zhì)瘤(glioma)是人顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，占據(jù)顱腦腫瘤的35%～60%左右，呈侵襲性生長，其手術(shù)切除復發(fā)率高，預后差[1-2]。盡管隨著神經(jīng)外科手術(shù)治療、基因治療、免疫治療及各種化療放療技術(shù)的發(fā)展，膠質(zhì)瘤仍不能被完全治愈，其預后生存期不到1年[3]。膠質(zhì)瘤細胞無限制的惡性增殖是導致機體惡病質(zhì)的主要原因，而遷移、侵襲則是膠質(zhì)瘤細胞發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的基礎，是引起病情惡化的主要因素，因此探討針對膠質(zhì)瘤侵襲性生長相關(guān)蛋白在膠質(zhì)瘤中的表達具有重要意義[4]。Bax是目前公認的參與細胞凋亡調(diào)控作用的最常見抑癌蛋白，是線粒體膜上的一種促凋亡蛋白，在多種腫瘤中低表達，且與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而與膠質(zhì)瘤的關(guān)系報道較少[5]。同時金屬基質(zhì)蛋白酶(MMP)通過對細胞外基質(zhì)(ECM)的降解可促進癌細胞對周圍組織的浸潤，MMP-2能降解血管基底膜和細胞外基質(zhì)中的Ⅳ型膠原成分，使腫瘤細胞突破結(jié)構(gòu)屏障，與腫瘤內(nèi)血管生成、侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)。因此本研究應用Western blot和免疫組織化學鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶連接染色法(SP)測定人腦膠質(zhì)瘤腦組織中MMP-2和Bax的表達，探討二者與人腦膠質(zhì)瘤惡性程度的相關(guān)性，為人腦膠質(zhì)瘤的臨床治療和預后提供判斷指標。

1資料與方法

1.1材料收集本院外科手術(shù)切除的腦膠質(zhì)瘤組織標本50例，其中男29例，女21例，平均年齡35歲，按WHO 2000年神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標準，50例標本分為Ⅰ級11例，Ⅱ級15例，Ⅲ級9例，Ⅳ級15例。另取20例腦創(chuàng)傷內(nèi)減壓術(shù)中切除的腦組織標本作為正常對照。腫瘤組織均經(jīng)活組織病理診斷證實，均為單一腫瘤，無并發(fā)肝、腎疾病，均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意。

1.2主要試劑兔抗人MMP-2，Bax單克隆抗體購自Epitomics公司，SP法免疫組織化學試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗，ECL超敏發(fā)光試劑盒，BCA試劑盒，RIPA裂解液購自碧云天生物研究所。

1.3Western blot測定腦組織中MMP-2和Bax的表達RIPA裂解液裂解組織并收獲蛋白。根據(jù)BCA試劑盒對蛋白濃度進行測定。蛋白樣品上樣，十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠電泳2～3 h，濕法轉(zhuǎn)膜30～50 min。一抗孵育，4 ℃過夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次，每次5 min；二抗室溫孵育1～2 h。漂洗3次，每次5 min，滴加ECL曝光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用“Quantity One”軟件對各抗體條帶灰度值進行統(tǒng)計。

1.4免疫組織化學染色法測定腦組織中MMP-2和Bax的表達10%甲醛溶液固定組織，石蠟包埋，切片，抗原修復，室溫冷卻30 min，PBS沖洗2次，一抗室溫孵育，PBS沖洗2次，二抗(1∶100)37 ℃孵育，PS洗滌2次，DAB溶液顯色后沖洗、復染、脫水、透明、樹膠封片。以PBS液代替一抗作為陰性對照。

1.5結(jié)果判斷MMP-2和Bax蛋白染色陽性主要定位于細胞質(zhì)，采用半定量計分法判定，高倍鏡下隨機選擇10個視野，分別計算500個腫瘤細胞。切片中陽性細胞小于5%為0分，6%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，≥75%為4分；染色深度以無陽性細胞為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色或棕褐色為3分，免疫反應的總得分為陽性細胞百分率與免疫染色強度總得分的乘積。

1.6統(tǒng)計學處理采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行分析，Western blot結(jié)果采用t檢驗，免疫組織化學染色法結(jié)果采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1免疫組織化學染色檢測MMP-2和Bax在腦膠質(zhì)瘤腦組織和正常腦組織中的表達MMP-2在正常腦組織中不表達，在人腦膠質(zhì)瘤中陽性表達率為64.0%，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；Bax在正常腦組織中及人腦膠質(zhì)瘤中陽性表達率分別為60.0%及54.0%，差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1，圖1、圖2。

A：正常腦組織，B：腦膠質(zhì)瘤腦組織。

圖1MMP-2在腦膠質(zhì)瘤腦組織和正常腦組織中的表達(×200)

2.2Western blot檢測MMP-2和Bax在腦膠質(zhì)瘤腦組織和正常腦組織中的表達MMP-2在正常腦組織中和腦膠質(zhì)瘤腦組織中蛋白灰度值分別為(0.09±0.00)及(1.58±0.31)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表2、圖3。Bax在正常腦組織中和腦膠質(zhì)瘤腦組織中蛋白灰度值分別為(2.34±0.29)及(2.19±0.29)，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2、圖4。

A：正常腦組織，B：腦膠質(zhì)瘤腦組織。

圖2Bax在腦膠質(zhì)瘤腦組織和正常腦組織中的表達(×200)

表1　MMP-2和Bax在腦膠質(zhì)瘤腦組織和正常腦組織中的表達[n(%)]

**:P<0.01,與正常腦組織比較。

圖3　Western blot檢測MMP-2在腦膠質(zhì)瘤腦組織和正常腦組織中的表達

圖4　Western blot檢測Bax在腦膠質(zhì)瘤腦組織和正常腦組織中的表達

表2　MMP-2和Bax在腦膠質(zhì)瘤腦組織和正常腦組織中表達的相對值

**：P<0.01，與正常腦組織比較。

2.3免疫組化檢測MMP-2和Bax在各種類型腦組織中的表達MMP-2在Ⅰ～Ⅱ，Ⅲ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤中的陽性率分別為26.92%，70.83%；Bax在Ⅰ～Ⅱ，Ⅲ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤中的陽性率分別為76.95%，25.0%，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖5、圖6、表3。推測Bax在膠質(zhì)瘤中起抑制作用，MMP-2在膠質(zhì)瘤起促進作用。

A：Ⅰ～Ⅱ級腦膠質(zhì)瘤組織，B：Ⅲ～Ⅳ腦膠質(zhì)瘤組織。

圖5免疫組化檢測MMP-2在不同級別膠質(zhì)瘤腦組織中的表達(×100)

2.4MMP-2和Bax表達的相關(guān)性經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，人腦膠質(zhì)瘤腦組織中MMP-2和Bax表達呈負相關(guān)(r=-0.587，P<0.01)。

A：Ⅰ～Ⅱ級腦膠質(zhì)瘤組織，B：Ⅲ～Ⅳ腦膠質(zhì)瘤組織(×200)。

圖6免疫組化檢測Bax在不同級別膠質(zhì)瘤腦組織中的表達

表3　免疫組化檢測MMP-2和Bax在各種類型腦組織中的表達[n(%)]

**：P<0.01，與Ⅰ～Ⅱ級腦膠質(zhì)瘤組織比較。

3討論

膠質(zhì)細胞瘤是起源于神經(jīng)膠質(zhì)細胞的腫瘤，是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤。在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，膠質(zhì)瘤細胞的正常凋亡過程被抑制，導致膠質(zhì)瘤細胞持續(xù)不斷地進行分裂與增殖。同時已有研究證實在腫瘤中檢測細胞凋亡相關(guān)基因的表達可成為腫瘤診斷和預后判斷的有效手段[6]。其中Bcl-2家族是被研究得最多的一類細胞凋亡相關(guān)基因。Bax是Bcl-2家族中促凋亡基因，當細胞內(nèi)Bcl-2表達過多，與Bax形成二聚體，使膠質(zhì)瘤細胞凋亡趨勢減弱，打破了細胞增殖與凋亡的平衡，使細胞數(shù)目不斷增加，從而表現(xiàn)出生長優(yōu)勢，成為膠質(zhì)瘤形成的重要基礎。因而探討B(tài)ax在膠質(zhì)瘤中的表達具有重要意義，所以本試驗通過Western blot和免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)Bax在人腦膠質(zhì)瘤腦組織中表達低于正常組織，雖差異無統(tǒng)計學意義，但有一定趨勢。而與Bax在其他腫瘤中的低表達具有顯著性差異不同，可能是由于檢測的樣本不同，組織來源不同，樣本的年齡、性別差異有關(guān)。林英等[7]的研究顯示：在Ⅰ～Ⅱ、Ⅲ～Ⅳ級人膠質(zhì)瘤中，Bax的表達陽性細胞率逐漸下降。本實驗也驗證了此觀點，但隨著病理分級的提高，其表達量也逐漸下降。說明隨著膠質(zhì)瘤病理級別的升高，Bax表達量下降，Bax含量能一定程度上反映膠質(zhì)瘤的惡性程度。同時進一步結(jié)合已報道文獻：在組織特異性啟動子和缺氧誘導元件的調(diào)控下Bax的過表達是針對膠質(zhì)瘤的有效基因治療手段[8]。Tra-8 抗人DR2單抗聯(lián)合Bax過表達能顯著抑制體外膠質(zhì)瘤細胞生長及體內(nèi)U251細胞移植瘤的生長[9]。說明膠質(zhì)瘤中Bax的過表達能顯著誘導膠質(zhì)瘤凋亡。進一步腺病毒轉(zhuǎn)染Bax到D54 MG膠質(zhì)瘤細胞中，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合化療能顯著抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖及克隆生長[10]。說明膠質(zhì)瘤中Bax的過表達能提高化療的敏感性，進一步刺激膠質(zhì)瘤細胞凋亡。從而說明Bax在膠質(zhì)瘤中起抑制作用，當其過表達有可能可以提高化療的敏感性或直接抑制膠質(zhì)瘤的增殖。

膠質(zhì)瘤的侵襲性是膠質(zhì)瘤遠處轉(zhuǎn)移的基礎，可以使膠質(zhì)瘤邊界模糊，給手術(shù)帶來困難，是患者腫瘤復發(fā)，治療困難，預后欠佳的主要原因。在膠質(zhì)瘤侵襲過程中，瘤細胞與細胞外基質(zhì)表面受體結(jié)合后誘導宿主細胞產(chǎn)生MMPs，局部降解細胞外基質(zhì)，腫瘤細胞通過缺失的細胞外基質(zhì)向周圍組織浸潤，產(chǎn)生腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。其中MMP-2不僅可以降解細胞外基質(zhì)中的明膠Ⅳ型膠原等，有利于膠質(zhì)瘤細胞沿著受損的基底膜向周圍浸潤，還可以通過新生毛細血管促進膠質(zhì)瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移，是惡性膠質(zhì)瘤浸潤和侵襲的標志。因而探討MMP-2在膠質(zhì)瘤中的表達具有重要意義，所以本試驗通過Western blot和免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)MMP-2在人腦膠質(zhì)瘤中表達高于正常組織，與吳紅芳等[11]，Sun等[12]的研究結(jié)果一致，說明MMP-2與膠質(zhì)瘤的發(fā)生有關(guān)。本文研究中亦發(fā)現(xiàn)Ⅲ～Ⅳ級人腦膠質(zhì)瘤腦組織中MMP-2顯著高于Ⅰ～Ⅱ級，且其差異均有統(tǒng)計學意義，與陳廣等[13]，Kong等[14]的試驗結(jié)果一致：MMP-2蛋白及mRNA在Ⅲ～Ⅳ級中的表達高于Ⅰ～Ⅱ級，與膠質(zhì)瘤的惡性程度及進展呈正相關(guān)。說明MMP-2跟人腦膠質(zhì)瘤病理分級有一定關(guān)系。同時Kesanakurti等[15]的研究證實具有侵襲性的膠質(zhì)瘤細胞分泌大量的MMP-2，其侵襲能力，膠質(zhì)瘤惡性程度與MMP-2的表達量呈正相關(guān)。且有研究證實通過siRNA干擾MMP-2的表達，能顯著抑制膠質(zhì)瘤細胞的侵襲能力[16]。從而說明MMP-2在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中起促進作用，并與膠質(zhì)瘤的高侵襲能力密切相關(guān)，抑制MMP-2表達可能一定程度上遏制膠質(zhì)瘤的侵襲程度。

同時在本研究中，經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，人膠質(zhì)瘤腦組織中MMP-2和Bax表達負相關(guān)，結(jié)合已報道的Bax及MMP-2啟動子共轉(zhuǎn)染到人肝癌細胞SNU475中，可顯著促進癌細胞凋亡并抑制癌細胞侵襲[17]。推測出使Bax過表達及MMP-2低表達并轉(zhuǎn)染到體外膠質(zhì)瘤細胞株中可一定程度上遏制膠質(zhì)瘤的增殖及侵襲。

綜上所述，Bax在人腦膠質(zhì)瘤中起抑制作用，MMP-2在人腦膠質(zhì)瘤中起促進作用，二者都是判斷膠質(zhì)瘤惡性程度，病理分級的有效指標，聯(lián)合檢測或靶向治療可一定程度上改善膠質(zhì)瘤的惡性程度。

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doi:·經(jīng)驗交流·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.08.023

作者簡介：楊立軍(1968-),學士，副主任醫(yī)師,主要從事顱內(nèi)腫瘤研究。

[中圖分類號]R739.4

[文獻標識碼]B

[文章編號]1671-8348(2016)08-1074-04

(收稿日期：2015-09-30修回日期：2015-11-26)