柳桂萍++++++張育++++++王雯雯++++++劉家歡++++++許金鑫

[摘要] 目的 研究金雀異黃素（Gen）對(duì)Ⅱ型膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠發(fā)病的預(yù)防作用。 方法 24只大鼠隨機(jī)分為三組：空白對(duì)照組、模型對(duì)照組及Gen預(yù)防用藥組，每組8只。在造模前，預(yù)先給予Gen預(yù)防用藥組大鼠胃內(nèi)灌注Gen 1周，使用Ⅱ型膠原建立模型對(duì)照組及Gen預(yù)防用藥組的CIA模型。觀察關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）評(píng)分及關(guān)節(jié)腫脹度；通過免疫組化檢測(cè)微血管密度（MVD），評(píng)估關(guān)節(jié)滑膜的血管新生情況；應(yīng)用免疫印跡法檢測(cè)炎性細(xì)胞因子（IL-1β、TNF-α）和血管新生相關(guān)調(diào)節(jié)因子（VEGF、MMP-1、MMP-2、MMP-9）的表達(dá)。 結(jié)果 CIA大鼠造模成功。與模型對(duì)照組比較，Gen預(yù)防用藥組大鼠炎性反應(yīng)較輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。與模型對(duì)照組相比，Gen預(yù)防用藥組大鼠血清中IL-1β、TNF-α的表達(dá)明顯降低（P < 0.05）。與模型對(duì)照組相比，Gen預(yù)防用藥組大鼠血清中VEGF表達(dá)降低，關(guān)節(jié)滑膜新生血管的形成減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。預(yù)防性使用Gen能夠降低CIA大鼠血清中MMP-1、MMP-2、MMP-9表達(dá)，與模型對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 Gen能夠通過調(diào)節(jié)CIA大鼠體內(nèi)炎性細(xì)胞因子，抑制血管新生相關(guān)調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，阻止軟骨及骨的進(jìn)一步破壞，對(duì)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病起到一定的預(yù)防作用。

[關(guān)鍵詞] 金雀異黃素；滑膜微血管密度；基質(zhì)金屬蛋白酶

[中圖分類號(hào)] R593.22 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）11（b）-0025-05

[Abstract] Objective To investigate the prevention effects of Genistein （Gen） in collagen Ⅱ induced arthritis （CIA） rats. Methods 24 rats were randomly divided into three groups and each group contained 8 rats： blank control group， model control group and Gen prevention group. Before establishing the CIA rat model， the rats in Gen prevention group were given Gen by gavage for one week. The rats in model control group and Gen prevention group were given collagen Ⅱ to induce CIA model. Arthritis index scores and swell arthrosis were observed in CIA rats. Immunohistochemistry assay was used to examine microvascular density （MVD）， for further evaluation of angiogenesis in the synovial membrane of the joint. Western blot was used to detect the expression of inflammatory factors （IL-1β， TNF-α） and angiogenesis related regulatory factors （VEGF， MMP-1，MMP-2， MMP-9）. Results The CIA model was successfully constructed. In Gen prevention group， the inflammatory reaction of rats was lighter than model control group， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. Compared with the model control group， the expressions of IL-1β and TNF-α in serum of Gen prevention group were significantly decreased （P < 0.05）. Compared with the model control group， the expression of VEGF in serum and the number of new blood vessels in synovium of Gen prevention group were decreased， and the differences were statistically significant （P < 0.05）. Compared with model control group， taken Gen as a prevention could reduce the expression of MMP-1， MMP-2， MMP-9 in serum of CIA rats， and had statistical differences （P < 0.05）. Conclusion Gen plays a certain preventative role in developing of rheumatoid arthritis. The mechanism may function by regulating the inflammatory factors， inhibiting the expression of angiogenesis related regulatory factors and restricting the further destruction of cartilage and bone.

[Key words] Genistein； Microvessel density； Matrix metalloproteinase

風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）的主要病理特點(diǎn)是在炎性環(huán)境中受各種炎性細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的刺激，關(guān)節(jié)成纖維樣滑膜細(xì)胞（FLS）顯著增殖和微血管新生[1-2]，并進(jìn)一步產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、蛋白溶解酶類及前列腺素等物質(zhì)，破壞關(guān)節(jié)軟骨及骨結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形及功能障礙[3]。如能在發(fā)病早期及時(shí)進(jìn)行有效的干預(yù)，則對(duì)RA的病情控制具有重要意義。筆者前期工作發(fā)現(xiàn)，金雀異黃素（Gen）能夠調(diào)節(jié)RA成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)，抑制其增殖，并能降低Ⅱ型膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞分泌IL-1β、TNF-α等炎性細(xì)胞因子[4-6]。本研究應(yīng)用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察Gen對(duì)CIA大鼠發(fā)病的預(yù)防作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的雌性SD大鼠（清潔級(jí)），4周齡，體重為（120±20）g，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（蘇）2007-0001。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

雞Ⅱ型膠原、完全弗氏佐劑、二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；Gen純品（純度≥99%）購于上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；IL-1、TNF-α、VEGF、MMP-1、MMP-2、MMP-9抗體，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗購于美國CST公司；其余試劑均為進(jìn)口分裝或市售分析純。

1.3 藥物的配制

參照文獻(xiàn)[4]配制Ⅱ型膠原乳劑及Gen混懸液。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物模型的建立

1.4.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 24只大鼠隨機(jī)分成三組：空白對(duì)照組、模型對(duì)照組及Gen預(yù)防用藥組，每組8只大鼠。Gen預(yù)防用藥組大鼠在造模前1周開始每天胃內(nèi)灌注Gen混懸液1 mL?？瞻讓?duì)照組以及模型對(duì)照組大鼠每天灌注等量羧甲基纖維素鈉。

1.4.1.2 造模 模型對(duì)照組和Gen預(yù)防用藥組大鼠左后足趾皮下注射0.1 mL Ⅱ型膠原乳劑，并于3周后在尾根部進(jìn)行多點(diǎn)加強(qiáng)注射，空白對(duì)照組注射等量的注射用水。

1.4.2 動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)

關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）評(píng)分及關(guān)節(jié)腫脹度測(cè)定，參照文獻(xiàn)[4]。

1.4.3 免疫組化檢測(cè)

在給藥4周后處死所有大鼠，常規(guī)病理學(xué)及免疫組化法檢測(cè)滑膜炎癥及血管新生，參照文獻(xiàn)[7]用Mouse Anti-CD31標(biāo)記滑膜微血管，進(jìn)行滑膜微血管密度（MVD）測(cè)定。

1.4.4 免疫印跡（Western blot）法檢測(cè)

造模4周后處死大鼠，心臟采血5 mL，分離血清，參照文獻(xiàn)[8]檢測(cè)Gen預(yù)防性用藥后CIA大鼠血清炎性因子（IL-1β、TNF-α）、血管新生相關(guān)調(diào)節(jié)因子（VEGF、MMP-1、MMP-2、MMP-9）表達(dá)的變化。每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠造模后一般情況

造模組大鼠造模后當(dāng)天后肢注射部位開始出現(xiàn)肢體腫脹，隨后發(fā)現(xiàn)對(duì)側(cè)和前肢關(guān)節(jié)也出現(xiàn)了腫脹，以后肢關(guān)節(jié)腫脹更為明顯，部分大鼠關(guān)節(jié)表面皮膚充血且有關(guān)節(jié)活動(dòng)障礙。造模組大鼠與空白對(duì)照組大鼠相比，精神萎靡，進(jìn)食減少，運(yùn)動(dòng)遲緩，體重增長(zhǎng)減慢，毛發(fā)缺少光澤。

2.2 三組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較

AI評(píng)分結(jié)果顯示，空白對(duì)照組大鼠無關(guān)節(jié)炎性反應(yīng)，從造模后1周開始，模型對(duì)照組的AI評(píng)分均明顯高于空白對(duì)照組（P < 0.05）；從第3周開始Gen預(yù)防用藥組AI評(píng)分低于模型對(duì)照組（P < 0.05），見圖1。分析足肢腫脹程度結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹于造模后開始增加，模型對(duì)照組于第3周達(dá)到高峰，Gen預(yù)防用藥組于第2周達(dá)到高峰，以后逐漸降低。見圖2。

2.3 各組大鼠血清中IL-1β、TNF-α表達(dá)比較

模型對(duì)照組大鼠IL-1β、TNF-α的表達(dá)均明顯高于正常對(duì)照組（P < 0.05），Gen預(yù)防用藥組IL-1β、TNF-α的表達(dá)均明顯低于模型對(duì)照組（P < 0.05），但仍高于空白對(duì)照組大鼠（P < 0.05）。見圖3。

2.4 各組大鼠血清中VEGF表達(dá)比較

研究發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠VEGF表達(dá)明顯升高（P < 0.05），Gen能明顯抑制CIA大鼠血清中VEGF表達(dá)（P < 0.05），但仍高于空白對(duì)照組。見圖4。

2.5 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜免疫組化結(jié)果及MVD比較

采用Mouse Anti-CD31標(biāo)記關(guān)節(jié)滑膜組織中的內(nèi)皮細(xì)胞，計(jì)數(shù)大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中單位密度的微血管數(shù)（圖5～6）。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，模型對(duì)照組大鼠關(guān)節(jié)滑膜中的微血管數(shù)目明顯多于空白對(duì)照組（P < 0.05）；Gen預(yù)防用藥組大鼠的關(guān)節(jié)滑膜微血管數(shù)目仍高于空白對(duì)照組，但明顯低于模型對(duì)照組（P < 0.05）。

2.6 各組大鼠血清中MMP-1、MMP-2、MMP-9表達(dá)比較

研究發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠MMP-1、MMP-2、MMP-9的表達(dá)均明顯升高（P < 0.05）；而Gen預(yù)防用藥組大鼠血清中MMP-1、MMP-2、MMP -9的表達(dá)水平明顯低于模型對(duì)照組，但仍高于空白對(duì)照組（P < 0.05）。見圖7。

3 討論

Gen是大豆中生物活性最強(qiáng)的異黃酮之一，現(xiàn)已證實(shí)Gen可用于預(yù)防和治療多種疾病[9-12]。TNF-α、IL-1β是RA發(fā)生的重要炎性細(xì)胞因子。TNF-α和IL-1β相互協(xié)同下促進(jìn)RA關(guān)節(jié)滑膜組織增生；誘導(dǎo)關(guān)節(jié)成纖維樣滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生膠原酶和前列腺素E2；增加血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)，促使血管生成；影響糖蛋白的代謝，抑制骨形成，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型對(duì)照組大鼠與空白對(duì)照組相比，其血清中IL-1β、TNF-α的表達(dá)明顯增高（P < 0.05）；預(yù)防性給予Gen干預(yù)后，IL-1β、TNF-α表達(dá)明顯降低，但并未恢復(fù)到正常水平，提示Gen能夠通過部分調(diào)節(jié)CIA大鼠體內(nèi)炎癥因子的表達(dá)而預(yù)防RA的發(fā)病。

血管新生失去控制是RA滑膜增生以及關(guān)節(jié)軟骨侵蝕的主要因素。研究表明，VEGF能促進(jìn)新生血管的生成[14]。Yi等[15]研究證實(shí)，RA患者血清、關(guān)節(jié)滑膜組織和滑膜液中VEGF含量與疾病活動(dòng)度具有相關(guān)性。RA病程中VEGF可誘導(dǎo)關(guān)節(jié)滑膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，引起關(guān)節(jié)滑膜血管新生及血管翳形成，并能通過增加毛細(xì)血管的通透性而促進(jìn)炎性物質(zhì)的滲出。新生血管形成的過程中首先是毛細(xì)血管內(nèi)皮下基底膜被MMPs等物質(zhì)降解，提示MMP-1、MMP-2、MMP-9在促進(jìn)RA關(guān)節(jié)滑膜血管新生的過程中發(fā)揮重要作用[16-18]。關(guān)節(jié)滑液及滑膜組織中過量表達(dá)的MMP-1、MMP-2、MMP-9可通過降解關(guān)節(jié)軟骨成分直接參與RA關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的分解，最終導(dǎo)致骨結(jié)構(gòu)破壞[19]。Sbardella等[20]研究表明，測(cè)定血清中MMPs含量可以間接反映關(guān)節(jié)滑液中MMPs的變化情況。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：Gen預(yù)防用藥組大鼠滑膜組織中的MVD明顯多于空白對(duì)照組（P < 0.05），但與模型對(duì)照組比明顯減少（P < 0.05）；Gen預(yù)防性干預(yù)后，可以明顯抑制CIA大鼠血清中VEGF表達(dá)（P <0.05）；且CIA大鼠血清中MMP-1、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平明顯減低（P < 0.05）。這表明Gen可以通過下調(diào)CIA大鼠體內(nèi)的VEGF、MMP-1、MMP-2、MMP-9的表達(dá)抑制關(guān)節(jié)滑膜血管新生，并可直接阻止關(guān)節(jié)軟骨及骨的破壞以達(dá)到防止RA的發(fā)病的目的。

綜上所述，預(yù)防性應(yīng)用Gen能夠下調(diào)炎性細(xì)胞因子（TNF-α和IL-1β）的表達(dá)；下調(diào)血管新生相關(guān)調(diào)節(jié)因子（VEGF和MMP-1、MMP-2、MMP-9）的表達(dá)而抑制關(guān)節(jié)滑膜的血管新生，阻止關(guān)節(jié)軟骨及骨的破壞，對(duì)RA的發(fā)病有一定的預(yù)防作用。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 孫艷，安永潼，尹蓓珮，等.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中血管新生調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)及其藥物研究啟發(fā)[J].中國免疫學(xué)雜志，2014，30（8）：1148-1151.

[2] Cooles FA，Isaacs JD. Pathophysiology of rheumatoid arthritis [J]. Curr Opin Rheumatol，2011，23（3）：233-240.

[3] Hot A，Zrioual S，Lenief V，et al. IL-17 and tumour necrosis factor α combination induces a HIF-1α-dependent invasive phenotype in synoviocytes [J]. Ann Rheum Dis，2012，71（8）：1393-1401.

[4] 許金鑫，張育，張學(xué)增，等.金雀異黃素對(duì)CIA大鼠炎癥及細(xì)胞因子影響的研究[J].實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志，2010，14（19）：1-5.

[5] 張育，張學(xué)增，沈維干，等.金雀異黃素對(duì)CIA大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖、凋亡及其機(jī)制的研究[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2011，27（8）：1161-1165.

[6] 高波，張育，馬莉，等.金雀異黃素對(duì)Ⅱ型膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素1β和腫瘤壞死因子α的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2009，7（7）：636-641.

[7] 許金鑫，張育，張學(xué)增，等.金雀異黃素抗Ⅱ型膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜血管新生的研究[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2011，9（2）：186-193.

[8] 何斌，張學(xué)增，張育，等.基于FLS細(xì)胞ERK信號(hào)通路機(jī)制的THD抗CIA作用[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2012，32（13）：1021-1027.

[9] Vitale DC，Piazza C，Melilli B，et al. Isoflavones：estrogenic activity，biological effect and bioavailability [J]. Eur J Drug Metab Pharmacokinet，2013，38（1）：15-25.

[10] Reiter E，Reiter E，Beck V，et al. Isoflavones are safe compounds for therapeutical applications-evaluation of in vitro data [J]. Gynecol Endocrinol，2009，25（9）：554-580.

[11] Farina HG，Pomies M，Alonso DF，et al. Antitumor and antiangiogenic activity of soy isoflavone genistein in mouse models of melanoma and breast cancer [J]. Oncol Rep，2006，16（4）：885-891.

[12] Yamashita Y，Hishinuma M，Shimada M. Activation of PKA，p38 MAPK and ERK1/2 by gonadotropins in cumulus cells is critical for induction of EGF-like factor and TACE/ADAM17 gene expression during in vitro maturation of porcine COCs [J]. J Ovarian Res，2009，2（1）：20.

[13] Dayer JM. The pivotal role of interleukin-1 in the clinical manifestations of rheumatoid arthritis [J]. Rheumatology，2003，42（2）：3-10.

[14] Ng EW，Adamis AP. Targeting angiogenesis，the underlying disorder in neovascular age-related macular degeneration [J]. Can J Ophthalmol，2005，40（3）：352-368.

[15] Yi JP，Wu YZ，Yu N，et al. VEGF Gene Polymorphisms Affect Serum Protein Levels and Alter Disease Activity and Synovial Lesions in Rheumatoid Arthritis [J]. Med Sci Monit，2016，22：316-324.

[16] Klein T，Bischoff R. Physiology and pathophysiology of matrix metalloproteases [J]. Amino Acids，2011，41（2）：271-290.

[17] Gaye C，Oliver FG，Charlotte B，et al. Early joint erosions and serum levels of matrix metalloproteinase 1，matrix metalloproteinase 3，and tissue inhibitor of metalloproteinases 1 in rheumatoid arthritis [J]. Arthritis Rheum，2001，44（10）：2263-2274.

[18] Li G，Zhang Y，Qian Y，et al. Interleukin-17A promotes rheumatoid arthritis synoviocytes migration and invasion under hypoxia by increasing MMP2 and MMP9 expression through NF-κB/HIF-1α pathway [J]. Mol Immunol，2013，53（3）：227-236.

[19] Xing R，Jin Y，Sun L，et al. Interleukin-21 induces migration and invasion of fibroblast-like synoviocytes from patients with rheumatoid arthritis [J]. Clin Exp Immunol，2016，184（2）：147-158.

[20] Sbardella D，F(xiàn)asciglione GF，Gioia M，et al. Human matrix metalloproteinases：an ubiquitarian class of enzymes involved in several pathological processes [J]. Mol Aspects Med，2012，33（2）：119-208.