王　豐， 鄭　鳴， 鄭培嬋， 吳麗賢， 王　慧

(1福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福州　350004； 2福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理系； *通訊作者，E-mail: zming_1956@163.com)

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鈣調(diào)蛋白小亞基Capn4在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)CNE2細(xì)胞增殖的影響

王豐1， 鄭鳴2*， 鄭培嬋2， 吳麗賢2， 王慧2

(1福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福州350004；2福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理系；*通訊作者，E-mail: zming_1956@163.com)

摘要：目的研究鈣調(diào)蛋白小亞基Capn4在鼻咽癌病理組織及鼻咽癌細(xì)胞CNE2中的表達(dá)，并觀察Capn4對(duì)順鉑作用后細(xì)胞增殖的改變。方法收集153例鼻咽癌組織及30例非癌鼻咽組織的石蠟標(biāo)本，所有患者均未進(jìn)行放化療，免疫組化法檢測(cè)Capn4在鼻咽癌組織及非鼻咽癌組織中的表達(dá)；選取鼻咽癌細(xì)胞CNE2與293T細(xì)胞在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，Western blot法檢測(cè)不同細(xì)胞中Capn4蛋白表達(dá)水平；構(gòu)建shRNA下調(diào)Capn4表達(dá)的CNE2細(xì)胞并以Western blot法驗(yàn)證；MTT法檢測(cè)順鉑作用下，shRNA下調(diào)Capn4的鼻咽癌細(xì)胞增殖改變。結(jié)果Capn4在鼻咽癌組織中的表達(dá)顯著高于正常鼻咽組織(P<0.001)，在鼻咽癌細(xì)胞系中表達(dá)明顯高于293T細(xì)胞；shRNA確實(shí)下調(diào)Capn4在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)；DNA損傷藥物順鉑作用下，下調(diào)Capn4表達(dá)的鼻咽癌細(xì)胞CNE2較之未下調(diào)的CNE2細(xì)胞增殖受抑制(P<0.05)結(jié)論Capn4在鼻咽癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，下調(diào)Capn4表達(dá)能抑制順鉑作用后的細(xì)胞增殖。

關(guān)鍵詞：Capn4；鼻咽癌；順鉑；shRNA

鼻咽癌是起源于鼻咽上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，在東南亞地區(qū)和中國南方有極高的發(fā)病率。鈣調(diào)蛋白Calpain是Ca2+依賴的半胱氨酸蛋白水解酶家族。至今，Calpain在人類已鑒定14個(gè)家族成員，大部分成員與細(xì)胞黏附相關(guān)，參與細(xì)胞的伸展、遷移、增殖、細(xì)胞周期的的調(diào)控和凋亡等。Capn4(又稱為CapnS1)是Calpain蛋白的一個(gè)小分子調(diào)節(jié)亞基，在調(diào)節(jié)Calpain的穩(wěn)定性和活性中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1]。最近的研究報(bào)道，Capn4在肝細(xì)胞癌、肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌和腎透明細(xì)胞癌中高表達(dá)，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄參與腫瘤的發(fā)生[2,3]。本研究擬探討Capn4在鼻咽癌病理組織與細(xì)胞中的表達(dá)，構(gòu)建shRNA以下調(diào)Capn4的表達(dá)，研究順鉑作用后細(xì)胞增殖的改變。

1材料與方法

1.1組織標(biāo)本

收集福州總醫(yī)院以及廣州總醫(yī)院1999-2010年切除的鼻咽癌組織及正常鼻咽組織石蠟標(biāo)本，共計(jì)153例鼻咽癌組織及30例非癌鼻咽組織。所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)。鼻咽癌組織中，男性104例，女性49例，年齡29-83歲，中位年齡53歲，所有患者均未進(jìn)行放化療。

1.2細(xì)胞株和主要試劑

人鼻咽癌細(xì)胞CNE2購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，人腎上皮細(xì)胞293T細(xì)胞購自我校細(xì)胞動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。兔抗人Capn4多克隆抗體購自LifeSpan公司，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體購自中杉生物公司。免疫組化試劑盒購自中杉生物公司。Hyclone RPMI 1640培養(yǎng)基和Hyclone胎牛血清均購于Thermo Scientific。順鉑由Hospira公司生產(chǎn)，每50 ml含順鉑50 mg。慢病毒質(zhì)粒pGC-LV、包裝質(zhì)粒pHelper 1.0和pHelper 2.0購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司。MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽]購置于美國Sigma公司，用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋成5 g/L，存儲(chǔ)液,小劑量分裝，-20 ℃避光儲(chǔ)存。

1.3免疫組織化學(xué)檢測(cè)Capn4在鼻咽癌病理組織中的表達(dá)

按SP試劑盒說明書操作，取石蠟切片按程序脫蠟至水，3%H2O2孵育30 min，滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性；微波抗原修復(fù)，山羊血清封閉，加兔抗人Capn4多克隆抗體一抗，稀釋度為1∶1 000；4 ℃冰箱過夜后加羊抗兔IgG二抗，加酶標(biāo)記物，DAB 顯色，光鏡下觀察；梯度乙醇脫水、封閉。陰性對(duì)照一抗滴加PBS，余相同。

依據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)判定標(biāo)準(zhǔn)，在顯微鏡下觀察組織切片的染色輕度和染色細(xì)胞的比率；染色強(qiáng)度判定：無染色記為0，弱陽性記為1，中等陽性記為2，強(qiáng)陽性記為3；陽性細(xì)胞數(shù)比率判定：<1%記為0，1%-25%記為1，26%-50%記為2，51%-75%記為3，>75%記為4；再根據(jù)染色輕度的得分與陽性細(xì)胞比率的得分乘積判定各切片的染色結(jié)果：陰性(得分0-1)，低表達(dá)(得分2-6)，高表達(dá)(得分7-12)。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)

CNE2細(xì)胞和293T細(xì)胞采用含0.1的胎牛血清RPMI1640，青霉素(100 000 IU/L)和鏈霉素(50 mg/L)，在37 ℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.5Western blot檢測(cè)Capn4表達(dá)

細(xì)胞在37 ℃、5%CO2，條件下培養(yǎng)，細(xì)胞豐度達(dá)80%時(shí)提取細(xì)胞總蛋白。PBS清洗、胰酶消化、離心5 min，收集細(xì)胞。加入200 μl裂解液和1 μl蛋白酶抑制劑，室溫混勻10 min，4 ℃，離心15 min，取上清液備用。利用Brandford方法測(cè)蛋白濃度。10%SDS凝膠電泳分析。電泳完畢后將膠上蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜。PVDF膜經(jīng)封閉液處理并在Tris緩沖鹽(TBS)充分洗滌后，加入1∶1 000稀釋的兔抗人Capn4抗體4 ℃雜交過夜。TBS洗膜數(shù)次后加入堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗溶液，4 ℃孵育1 h后，洗滌，曝光顯色記錄結(jié)果。同時(shí)檢測(cè)β-肌動(dòng)蛋白作為蛋白定量的內(nèi)標(biāo)。

1.6構(gòu)建shRNA載體轉(zhuǎn)染CNE2抑制Capn4表達(dá)

根據(jù)Genbank中Capn4基因已知序列按siRNA序列設(shè)計(jì)原則，應(yīng)用Ambion公司網(wǎng)上在線設(shè)計(jì)工具設(shè)計(jì)，并將選出的siRNA序列進(jìn)行BLAST搜索，作同源性分析以保證序列的特異性，最后確定3個(gè)區(qū)段。根據(jù)Capn4 cDNA序列構(gòu)建表達(dá)Capn4 mRNA特異的，含綠色熒光蛋白基因(EGFP)的shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒CAPNS1-RNAi。CAPNS1-RNAi作用的三個(gè)靶序列分別為5′-CCACAGAACTCATGAACAT-3′(CAPNS1-RNAi89)、5′-AGGCCATATACAAACAGTT-3(′CAPNS1-RNAi90)及5′-ATGTTCCGTGCCTTCAAAT-3′(CAPNS1-RNAi91)，陰性對(duì)照CON207作用的靶序列為5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。利用包裝質(zhì)粒pHelper 1.0和pHelper 2.0轉(zhuǎn)染CNE2細(xì)胞，并用Western blot法測(cè)Capn4的表達(dá)情況。

1.7MTT法檢測(cè)順鉑對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用

取對(duì)數(shù)生長期的鼻咽癌細(xì)胞CNE2(陰性對(duì)照CON207載體轉(zhuǎn)錄作為對(duì)照組)和慢病毒下調(diào)Capn4表達(dá)的CNE2Capn4(-)(為實(shí)驗(yàn)組)，按5×107/L接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔180 μl。實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組均分別加入不同濃度的藥物20 μl，另設(shè)背景對(duì)照,每組設(shè)3個(gè)平行孔，37 ℃培養(yǎng)24 h。加入5 g/L的MTT溶液,每孔20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心棄上清，加入150 μl DMSO，微量振蕩儀振蕩10 min，立即用酶標(biāo)儀在570 nm波長處測(cè)吸光度(OD值)。根據(jù)吸光度計(jì)算細(xì)胞生長抑制率IC50，細(xì)胞生長抑制率(%)=(對(duì)照組OD-實(shí)驗(yàn)組OD)/對(duì)照組OD×100%。以藥物濃度為橫軸,抑制率為縱軸繪制細(xì)胞增殖抑制量效關(guān)系曲線。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1Capn4在鼻咽癌組織中的表達(dá)

為了驗(yàn)證Capn4在鼻咽癌組織中及正常鼻咽組織中的表達(dá)差異，收集了153例鼻咽癌和30例非癌鼻咽石蠟組織進(jìn)行免疫組化檢查分析，結(jié)果提示Capn4在鼻咽癌細(xì)胞中主要是定位于胞質(zhì)，少數(shù)位于胞核中(見圖1)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)Capn4在鼻咽癌組織與非癌組織中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，見表1)。

2.2Capn4在鼻咽癌細(xì)胞CNE2中的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，Capn4在鼻咽癌細(xì)胞CNE2中表達(dá)量高于293T細(xì)胞，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖2)。

A.不表達(dá)的非癌鼻咽組織　　B.低表達(dá)的非癌鼻咽組織　　C.中表達(dá)的鼻咽癌組織　　D.高表達(dá)的鼻咽癌組織 圖1　免疫組化分析Capn4在非癌鼻咽組織及鼻咽癌組織中的表達(dá) (20×20)Figure 1　Expression of Capn4 in human nasopharyngeal carcinoma tissues and non-tumor nasopharyngeal tissues by immunohistochemistry (20×20)

表1免疫組化檢測(cè)Capn4在鼻咽癌組織及非癌鼻咽組織中的表達(dá)例(%)

Table 1Expression of Capn4 in nasopharyngeal carcinoma and non-tumor tissuescases(%)

組別nCapn4表達(dá)低表達(dá)高表達(dá)χ2P非癌的鼻咽組織3028(93.3) 2(6.7)10.82<0.001鼻咽癌組織15381(52.9) 72(47.1)

圖2　Western blot分析Capn4在鼻咽癌細(xì)胞CNE2及293T細(xì)胞中表達(dá)Figure 2　Protein level of Capn4 in CNE2 cells and 293T cells by Western blot

2.3構(gòu)建三株shRNA載體轉(zhuǎn)染CNE2細(xì)胞下調(diào)Capn4表達(dá)并Western blot驗(yàn)證

三株shRNA載體(CAPNS1-RNAi90,CAPNS1-RNAi89,CAPNS1-RNAi91)構(gòu)建成功并轉(zhuǎn)染CNE2，均下調(diào)Capn4在CNE2中的表達(dá)，其中CAPNS1-RNAi89下調(diào)Capn4表達(dá)最顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見圖3)。

2.4順鉑處理后細(xì)胞增殖改變

轉(zhuǎn)入空載體(CON207)的CNE2與shRNA下調(diào)Capn4表達(dá)后的CNE2細(xì)胞共同運(yùn)用不同濃度的順鉑處理48 h后,下調(diào)Capn4表達(dá)的CNE2細(xì)胞增殖明顯受抑制(見圖4)，IC50值采用GraphPad Prism5軟件進(jìn)行方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3討論

鼻咽癌是我國南方常見的惡性腫瘤。其發(fā)病原因與遺傳易感性、種族背景、EB病毒感染、飲食習(xí)慣和環(huán)境等多種因素密切相關(guān)[4]。Calpain是Ca2+依賴半胱氨酸蛋白水解酶[5]。目前Calpain在鼻咽癌中的作用尚無文獻(xiàn)報(bào)道，最近的研究報(bào)道Capn4在肝細(xì)胞癌和肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞癌中高表達(dá)，而且Capn4表達(dá)程度與患者的預(yù)后密切相關(guān)。干擾Capn4的表達(dá)能夠顯著降低肝細(xì)胞癌和肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞癌的細(xì)胞侵襲和遷移能力[6,7]。由此，推測(cè)Capn4在轉(zhuǎn)移癌的細(xì)胞遷移和黏附中發(fā)揮一定的作用，其在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展過程中是否發(fā)揮類似的作用尚不清楚。

與CNE2細(xì)胞比較，*P<0.05，**P<0.01圖3　Western blot分析三株shRNA下調(diào)Capn4在CNE2中的表達(dá)Figure 3　Expression of Capn4 after transfected with shRNA by Western blot

圖4　MTT法分析在CNE2細(xì)胞及shRNA下調(diào)Capn4表達(dá)的CNE2細(xì)胞中運(yùn)用順鉑后細(xì)胞增殖Figure 4　The proliferation of CNE2 cells and Capn4 knockdown CNE2 cells determined by MTT

本研究首先收集了152例鼻咽癌組織和30例非癌鼻咽組織進(jìn)行免疫組化染色，統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析顯示：Capn4在鼻咽癌組織中的表達(dá)明顯高于非癌鼻咽組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用Western blot探測(cè)性研究Capn4在鼻咽癌細(xì)胞CNE2中的表達(dá)情況，結(jié)果也提示Capn4在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)顯著要高于正常人腎上皮細(xì)胞294T。這些結(jié)果提示Capn4可能與鼻咽癌的惡性表型相關(guān)并在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定的作用。

順鉑是臨床常用的鼻咽癌化療藥物[8]，它是一種細(xì)胞毒藥物，不僅能殺傷腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤細(xì)胞修復(fù)損傷，當(dāng)它與放射治療何用，還具有放療增敏的作用。順鉑作為細(xì)胞周期非特異性化療藥物可將氯解離成雙矛狀，與DNA雙鏈上的堿基形成交叉連接，引起DNA鏈間、鏈內(nèi)或蛋白質(zhì)DNA交聯(lián)[9]。本研究進(jìn)一步構(gòu)建了shRNA以下調(diào)Capn4表達(dá)并運(yùn)用Western blot法驗(yàn)證。MTT法檢測(cè)在不同濃度的順鉑作用48 h后，轉(zhuǎn)入空載體的CNE2細(xì)胞和敲除Capn4的CNE2細(xì)胞相比，后者的細(xì)胞增殖明顯受抑制，說明Capn4參與順鉑損傷后鼻咽癌細(xì)胞的DNA損傷過程，并可能抑制了DNA損傷后癌細(xì)胞的修復(fù)過程。

損傷DNA的分子機(jī)制不盡相同，常見的DNA損傷類型有單鏈斷裂，雙鏈斷裂等[10]。在DNA的損傷中，雙鏈斷裂是最嚴(yán)重的，主要通過HR和NHEJ進(jìn)行修復(fù)。DNA修復(fù)能力異常激活和增強(qiáng)是導(dǎo)致鼻咽癌細(xì)胞對(duì)DNA損傷劑耐藥的重要分子基礎(chǔ)；相反，修復(fù)缺陷則使腫瘤對(duì)其高敏感。尋找DNA修復(fù)抑制劑成為抗腫瘤研究領(lǐng)域的一項(xiàng)新熱點(diǎn)。因此，干擾鼻咽癌細(xì)胞DNA修復(fù)很可能增敏基于DNA損傷的鼻咽癌放化療作用。Calpain也可通過維持去泛素化酶USP1穩(wěn)定性的方式影響細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性。USP1-UAF1是DNA損傷反應(yīng)的一種關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，去泛素化酶USP1通過與UAF1(U2核糖核蛋白顆粒輔助因子1)結(jié)合，對(duì)兩種關(guān)鍵的DNA修復(fù)蛋白FANCD2-ub及PCNA-ub進(jìn)行去泛素化而調(diào)控DNA修復(fù)。敲除了USP1、UAF1以及二者都敲除的雞DT40細(xì)胞表現(xiàn)了對(duì)化學(xué)交聯(lián)劑、喜樹堿、聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(PARP)抑制劑的高度敏感性，提示USP1/UAF1復(fù)合物促進(jìn)了同源重組(HR)介導(dǎo)的DAN雙聯(lián)斷裂的修復(fù)[11]。通過免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)USP1去泛素化酶與Capn4(即CAPNS1)相互結(jié)合并相互作用，通過單細(xì)胞電泳(彗星實(shí)驗(yàn))發(fā)現(xiàn)在敲除Capn4的MEFs細(xì)胞中，經(jīng)UV照射后不論是DNA損傷應(yīng)答還是DNA損傷修復(fù)均受抑制，提示伴隨Capn4的抑制，PCNA超泛素化與UV照射后DNA損傷修復(fù)缺陷有關(guān)[12]。Capn4參與上述哪條損傷通路，是否影響細(xì)胞周期蛋白尚待進(jìn)一步研究。對(duì)Capn4的抑制可能成為鼻咽癌放化療后抑制DNA損傷修復(fù)的重要因素。

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Expression of Capn4 in nasopharyngeal carcinoma and its effect on proliferation of CNE2

WANG Feng1, ZHENG Ming2*, ZHENG Peichan2, WU Lixian2, WANG Hui2

(1CollegeofIntegrativeMedicine,FujianUniversityofTCM,Fuzhou350004,China;2DepartmentofPharmacology,FujianMedicalUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:zming_1956@163.com)

Abstract：ObjectiveTo investigate the expression of Capn4 in nasopharyngeal carcinoma(NPC) tissues and nasopharyngeal carcinoma cells(CNE2), and explore its effect on proliferation after treated with cisplatin in CNE2 cells.MethodsThe expression level of Capn4 protein was detected in archived paraffin-embedded NPC tumor(n=153) and non-tumoral nasopharyngeal specimens(n=30) by immunohistochemical staining. The protein levels of Capn4 in CNE2 and 293T cells were examined by Western blot. The Capn4 knockdown cells using shRNA was constructed in CNE2 cells and further identified by Western blot. The proliferation of knockdown Capn4 cells were determined by MTT after treated with cisplatin.ResultsThe expression levels of Capn4 in NPC samples were significantly higher than that of non-tumoral tissues (P<0.001), and the expression levels of Capn4 were significantly higher in CNE2 cells than in 293T cells. The shRNA inhibited Capn4 expression in CNE2 cells. The proliferation was inhibited in Capn4 knockdown CNE2 cells after treated with cisplatin compared to normal CNE2 cells(P<0.05).ConclusionThe expression levels of Capn4 in tissues and cell lines of NPC are significantly higher than in normal nasopharyngeal tissues and 293T cells. Capn4 knockdown may inhibit the cell proliferation after treated with cispaltin.

Key words:Capn4;nasopharyngeal carcinoma;cisplatin;shRNA

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81572662)

作者簡介：王豐，女，1979-02生，博士，講師，E-mail：fangfei1931@126.com

收稿日期：2016-02-25

中圖分類號(hào)：R739.62

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007-6611(2016)05-0434-05

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.05.008