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口腔鱗狀細(xì)胞癌中PLK1蛋白表達(dá)與中心體擴(kuò)增

2016-06-16 12:04李世靈于燕妮
關(guān)鍵詞:微管免疫組化口腔

李世靈 蔡 揚(yáng) 于燕妮

(1 貴州省貴陽(yáng)市婦幼保健院病理科 貴陽(yáng) 550003;2 貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 貴州貴陽(yáng) 550004)

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口腔鱗狀細(xì)胞癌中PLK1蛋白表達(dá)與中心體擴(kuò)增

李世靈1蔡揚(yáng)2#于燕妮2

(1貴州省貴陽(yáng)市婦幼保健院病理科貴陽(yáng)550003;2貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院貴州貴陽(yáng)550004)

摘要:目的:探討口腔鱗狀細(xì)胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma,OSCC)中保羅樣激酶-1(Polo-Like Kinase 1,PLK1)蛋白表達(dá)與中心體擴(kuò)增之間的相關(guān)性。方法:采用免疫組化SABC法檢測(cè)10例正??谇火つず?7例OSCC中PLK1蛋白和γ-微管蛋白的表達(dá)情況,并分析兩者之間的相關(guān)性。結(jié)果:PLK1蛋白和γ-微管蛋白在正??谇火つそM和OSCC組中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為0.0%(0/10)、70.2%(33/47)和0.0%(0/10)、76.6%(36/47),PLK1蛋白和γ-微管蛋白表達(dá)在正??谇火つそM和OSCC組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.05;Spearman相關(guān)分析顯示,OSCC組織中PLK1蛋白與γ-微管蛋白表達(dá)之間正相關(guān),r=0.305,P<0.05。結(jié)論:PLK1蛋白過(guò)表達(dá)可能是中心體擴(kuò)增的潛在機(jī)制之一,PLK1蛋白過(guò)表達(dá)導(dǎo)致中心體擴(kuò)增及細(xì)胞惡性增殖在OSCC發(fā)生中可能起一定的作用。

關(guān)鍵詞:口腔鱗狀細(xì)胞癌;保羅樣激酶-1;γ-微管蛋白;中心體擴(kuò)增

基因不穩(wěn)定是人類腫瘤發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié),染色體不穩(wěn)定性(Chromosome Instability,CIN)作為基因不穩(wěn)定的形式之一,是腫瘤細(xì)胞一個(gè)非常顯著的共同特征性表現(xiàn)。中心體異常被認(rèn)為是染色體不穩(wěn)定形成的潛在原因之一而與腫瘤發(fā)生有關(guān)。目前,中心體擴(kuò)增可見人類大多數(shù)腫瘤中,其中也包括口腔鱗狀細(xì)胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma,OSCC)[1],但其擴(kuò)增機(jī)制仍不清楚。有研究提示保羅樣激酶-1(Polo-Like Kinase 1,PLK1)異常與中心體擴(kuò)增、染色體不穩(wěn)定及細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)[2~3]。γ-微管蛋白作為一個(gè)典型的中心體核心蛋白,對(duì)于細(xì)胞周期的調(diào)控發(fā)揮很大重要[4]。我們通過(guò)采用免疫組化SABC法檢測(cè)OSCC中PLK1蛋白和γ-微管蛋白的表達(dá)情況,初步探討兩者之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1臨床病理資料選取2000~2007年貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科臨床活檢或手術(shù)切除標(biāo)本,包括:經(jīng)患者知情同意自阻生齒拔除時(shí)切除的正常牙齦黏膜組織10例、口腔黏膜上皮非典型增生組織29例(輕度14例,中度10例,重度5例)、OSCC組織47例(高分化33例,中分化11例,低分化3例;伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者31例,無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者16例;按2002 年WHO國(guó)際抗癌聯(lián)盟制定的腫瘤分期標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ期和Ⅱ期共9例,Ⅲ期和Ⅳ期共38例)。病人術(shù)前均未接受任何手術(shù)或化、放療治療。所有組織均經(jīng)病理檢查確診。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑與方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)試劑鼠抗人PLK1單克隆抗體(購(gòu)自美國(guó)Santa公司,SC-17783),鼠抗人γ-微管蛋白單克隆抗體(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,GTU-88),免疫組化SABC試劑盒、抗原修復(fù)液及DAB顯色試劑盒(均購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)方法所有組織均經(jīng)10%福爾馬林液固定后,制成蠟塊并切片,切片用APES溶液制成的膠片撈片,通過(guò)二甲苯脫臘,梯度酒精水化后,將切片置于修復(fù)液中(pH6.0,0.01 mol枸櫞酸鹽緩沖液),高壓熱修復(fù)3 min,待冷卻后用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗2次,5 min/次,滴加一抗(PLK1蛋白和γ-微管蛋白工作液稀釋度分別為1∶100和1∶200),在室溫孵育120 min;PBS液沖洗,滴加二抗,在室溫下孵育30 min,PBS液沖洗,最后用DAB顯色后蘇木素復(fù)染10 s,流水沖洗,梯度酒精脫水后封片。每批染色同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照:以已知陽(yáng)性標(biāo)本為陽(yáng)性對(duì)照,以PBS液取代一抗作為陰性對(duì)照。免疫組化結(jié)果由兩位資深病理科醫(yī)師獨(dú)立判定取均值。

1.3結(jié)果判斷PLK1蛋白以細(xì)胞漿或細(xì)胞核著黃色顆粒或團(tuán)塊為陽(yáng)性染色,γ-微管蛋白以胞漿著黃色顆?;驁F(tuán)塊為陽(yáng)性染色。隨機(jī)選取上皮或腫瘤區(qū)的5個(gè)不同區(qū)域,觀察5個(gè)400倍高倍視野,計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、陽(yáng)性細(xì)胞百分率和評(píng)定顯色強(qiáng)度,依照陽(yáng)性細(xì)胞百分率<5%,5%~25%,25%~50%,50%~75%,>75%分別得0、1、2、3、4分;依照顯色強(qiáng)度未著色、淺黃色、棕黃色、棕褐色分別得0、1、2、3分,兩項(xiàng)得分相乘,并取5個(gè)高倍視野得分的平均值。按照分?jǐn)?shù)分為4個(gè)等級(jí):0~3為陰性(-),4~6為低表達(dá)(+),7~8為中表達(dá)(++),9分以上為高表達(dá)(+++)。(+)、(++)和(+++)的病例均歸為陽(yáng)性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件,進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、Fisher's確切概率法和Spearman相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1PLK1蛋白在正??谇火つそM織和OSCC中的表達(dá)情況PLK1蛋白在正??谇火つそM中未見陽(yáng)性表達(dá),在OSCC組中的陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)為70.2% (33/47),中、高表達(dá)共28例。PLK1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率在OSCC組顯著高于正??谇火つそM,P<0.05。見圖1~圖2。

圖1 PLK1蛋白在正??谇火つそM織中的陰性表達(dá)(SABC×400)

圖2 PLK1蛋白在口腔鱗癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)(SABC×400)

2.2γ-微管蛋白在正??谇火つそM織和OSCC中的表達(dá)情況γ-微管蛋白在正常口腔黏膜上皮基底層僅見極少數(shù)基底細(xì)胞胞漿陽(yáng)性著色,按標(biāo)準(zhǔn)判為陰性表達(dá);而在OSCC組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為76.6%(36/47),陽(yáng)性細(xì)胞以中、高度表達(dá)為主呈大量散在分布,有的甚至滿布視野。γ-微管蛋白表達(dá)在正常口腔黏膜組與OSCC組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.05。見圖3~圖4。

圖3 γ-微管蛋白在正??谇火つそM織中的陰性表達(dá)(SABC×1000)

圖4 γ-微管蛋白在口腔鱗癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)(SABC×1000)

2.3PLK1與γ-微管蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性Spearman相關(guān)分析顯示,OSCC組織中PLK1蛋白表達(dá)與γ-微管蛋白表達(dá)之間正相關(guān),r=0.305,P<0.05。見表1。

表1 口腔鱗癌組織中PLK1與γ-微管蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性分析(例)

3 討論

中心體異??杀憩F(xiàn)為中心體數(shù)目擴(kuò)增、結(jié)構(gòu)異常、中心粒周圍物質(zhì)聚集過(guò)多、中心體蛋白的異常磷酸化、無(wú)粒中心體、微管成核能力增強(qiáng)等[4]。中心體由中心粒和中心粒周圍物質(zhì)(Pericentriolar Materia,PCM)兩部分組成,目前的相關(guān)研究提示中心體上恒定存在的蛋白(也即核心蛋白,指的是在用各種方法解聚微管之后它們的中心體定位并不會(huì)受影響)并不多,而γ-微管蛋白就是一個(gè)典型的中心體核心蛋白[5],主要以γ-微管蛋白環(huán)式復(fù)合體(γ-Tubulin Ring Complex,γ-TuRC)和γ-微管蛋白小復(fù)合體(γ-Tubulin Small Complex,γ-TuSC)兩種形式存在,γ-TuRC和γ-TuSC能與一些γ-微管蛋白復(fù)合體結(jié)合蛋白結(jié)合,錨定在微管組織中心參與微管成核起始。研究發(fā)現(xiàn),向微管蛋白溶液中加入γ-TuRC,能夠引起微管蛋白的聚集,微管成核能力隨著γ-TuRC的濃度的增加呈線性增長(zhǎng)[6]。Iemura K等[7]研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)Western blot方法測(cè)定細(xì)胞中γ-微管蛋白的平均含量可以用來(lái)評(píng)價(jià)中心體擴(kuò)增情況。本研究應(yīng)用免疫組化的方法以γ-微管蛋白的單克隆抗體在OSCC細(xì)胞中的表達(dá)情況來(lái)評(píng)價(jià)中心體擴(kuò)增情況,發(fā)現(xiàn)其結(jié)果與盧紅等[8]應(yīng)用免疫熒光方法檢測(cè)OSCC組織中中心體擴(kuò)增情況相似。

中心體上除了γ-微管蛋白等核心蛋白之外還存在隨著細(xì)胞周期的改變而被中心體核心蛋白直接或間接招募到中心體上的一些調(diào)控因子,PLK1就是這些眾多調(diào)控因子之一[9]。PLK1是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶,是細(xì)胞周期相關(guān)事件包括雙極紡錘體形成、染色體分離和中心體成熟的重要調(diào)控因子[10~11]。大量研究發(fā)現(xiàn),PLK1在許多惡性腫瘤中呈高表達(dá),并與腫瘤的某些生物學(xué)行為密切相關(guān)[12~13],提示PLK1可能在惡性腫瘤轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究中,正常口腔黏膜組織未見PLK1蛋白陽(yáng)性表達(dá),而在OSCC中其陽(yáng)性表達(dá)率為70.2%(33/47),以中、高度表達(dá)為主。本研究及相關(guān)報(bào)道說(shuō)明,PLK1過(guò)表達(dá)確實(shí)普遍存在于實(shí)體腫瘤組織中,包括OSCC組織[14]。

癌細(xì)胞中過(guò)量的中心體可能導(dǎo)致染色體的錯(cuò)誤分類及破壞,形成非整倍體性染色體,可導(dǎo)致腫瘤抑制基因的丟失,活化致癌基因[15],故認(rèn)為中心體可能是癌癥形成的驅(qū)動(dòng)力量而非結(jié)果,而PLK1對(duì)中心體成熟的必要性可能是其致癌作用的一種機(jī)制。中心體成熟實(shí)際上是γ-TuRC和其他的PCM向中心體聚集的過(guò)程。γ-TuRC的形成依賴于PLK1,但其完整的機(jī)制還并不清楚。有報(bào)道稱[16],作為γ-TuRC成員之一的Nedd1的磷酸化可能起到了重要的作用。Nedd1首先被CDK磷酸化,形成于一個(gè)與PLK1結(jié)合的區(qū)域,然后PLK1相繼磷酸化Nedd1的另外4個(gè)位點(diǎn),促進(jìn)其與γ-tubulin的結(jié)合,以此決定γ-TuRC在中心體的募集。Yamamoto Y等[17]發(fā)現(xiàn),發(fā)生PLK1過(guò)表達(dá)的膀胱癌與沒(méi)有發(fā)生PLK1過(guò)表達(dá)的膀胱癌相比較,前者更易發(fā)生中心體擴(kuò)增。本研究發(fā)現(xiàn),在OSCC組織中,PLK1陽(yáng)性表達(dá)與γ-微管蛋白表達(dá)之間正相關(guān),r=0.305,P<0.05,推測(cè)PLK1過(guò)表達(dá)可能通過(guò)直接調(diào)控中心體組分或?qū)χ行捏w相關(guān)蛋白磷酸化作用失調(diào),而引發(fā)OSCC中心體擴(kuò)增,從而導(dǎo)致異常紡錘體極形成和染色體分離錯(cuò)誤,最終導(dǎo)致OSCC的形成。

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·臨床研究·

PLK1 Protein Expression and Centrosome Amplification in Oral Squamous Cell Carcinoma

LI Shi-ling1,CAI Yang2#,YU Yan-ni2
(1 Department of Pathology,Maternal and child health-care hospital of Guiyang City,Guiyang,Guizhou 550003;2 The Affiliated Hospital of Guiyang Medical College,Guiyang,Guizhou 550004)

Abstract:Objective: To study the correlation between polo-like kinase 1 protein expression and centrosome amplification in oral squamous cell carcinoma. Methods: The expressions of PLK1 and γ-tubulin proteins in 10 cases of normal oral mucosa and 47 cases of oral squamous cell carcinoma were investigated by SABC method,and analyzed the correlation between them. Results: Rate of positive expression of Plk1 protein and γ-tubulin in normal oral mucosa group and OSCC group were 0%(0/10),70.2%(33/47)and 0%(0/10),76.6%(36/47)respectively,and differences of Plk1 protein and γ-tubulin expression between OSCC group and normal oral mucosa group were statistically significant,P<0.05. Spearman correlation analysis showed that the expression of PLK1 protein in OSCC tissue was positively correlated with the expression of gamma tubulin,r=0.305,P<0.05. Conclusion: Over-expression of PLK1 protein may be a potential mechanism of centrosome amplification,while PLK1 protein leads to centrosome amplification and cell proliferation may play a role in the occurrence of OSCC expression.

Key words:Oral squamous cell carcinomas;Polo-like kinase 1(PLK1);γ-Tubulin protein;Centrosome amplification

#通信作者:蔡揚(yáng),Email:caiyang85@163.com

中圖分類號(hào):R780.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B

doi:10.13638/j.issn.1671-4040.2016.03.002

收稿日期:(2016-02-21)

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