王鈺明　趙　峰　張　虎　張宏福

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193)

仿生消化法評(píng)定豬飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的研究進(jìn)展

王鈺明趙峰*張虎張宏福

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193)

摘要：基于體外酶法的仿生消化技術(shù)評(píng)定豬飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值已被丹麥、荷蘭、法國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家所認(rèn)同，但該技術(shù)仍未脫離傳統(tǒng)方法以水解活性無(wú)法重復(fù)的胰液素為模擬消化液酶源，以“三角瓶+搖床”為全手工測(cè)試工具的研究思路。因此，在酶法的創(chuàng)新上，模擬消化液制備的生物學(xué)背景與標(biāo)準(zhǔn)化，以及建立規(guī)范化的體外模擬消化工具一直是該研究領(lǐng)域的核心與難點(diǎn)。本文綜述了國(guó)內(nèi)外豬模擬消化技術(shù)的最新研究進(jìn)展，并對(duì)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在此方面的研究成果進(jìn)行了總結(jié)和介紹。

關(guān)鍵詞：豬；模擬消化；仿生消化系統(tǒng)

飼料養(yǎng)分的生物學(xué)效價(jià)是確定飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)及優(yōu)化飼料配方的主要決策依據(jù)，也是動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究最為基礎(chǔ)的參數(shù)。因此，如何準(zhǔn)確、快速地測(cè)定飼料養(yǎng)分的生物學(xué)效價(jià)一直是業(yè)界共同關(guān)注的焦點(diǎn)。自20世紀(jì)50年代以來(lái)，人們?cè)谕ㄟ^(guò)模擬動(dòng)物體內(nèi)的酶促反應(yīng)過(guò)程以實(shí)現(xiàn)對(duì)飼料有效能及氨基酸消化率的估測(cè)方面進(jìn)行了許多有益嘗試。目前，通過(guò)酶法測(cè)定豬飼料的消化能值已逐漸被丹麥、荷蘭、法國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家所認(rèn)同，并成為其新型飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)的核心技術(shù)[1-3]。然而，現(xiàn)有酶法仍采用Boisen等[4]的方法與手段，存在模擬消化液酶活無(wú)法重復(fù)、模擬消化過(guò)程具有較大的隨意性與不穩(wěn)定性、缺乏專用的自動(dòng)化測(cè)試工具等弊端。針對(duì)上述問(wèn)題，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在前人研究工作的基礎(chǔ)上系統(tǒng)研究了豬消化液的組成成分，建立了模擬消化液制備的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，實(shí)現(xiàn)了模擬消化液活性的可重復(fù)與規(guī)范化。在此基礎(chǔ)上，研制了一套用于全自動(dòng)模擬豬胃、小腸、大腸消化的仿生消化系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了仿生消化方法的“自動(dòng)化、儀器化和操作規(guī)范化”。隨著該方法的進(jìn)一步發(fā)展與完善，本技術(shù)有望為我國(guó)豬飼料養(yǎng)分營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的評(píng)定提供高效的研究手段。

1國(guó)外豬模擬消化液制備的研究進(jìn)展

在飼料的體外模擬消化中，有些研究者直接將畜禽體內(nèi)的腸液或胰液作為體外模擬消化的消化液，如日本學(xué)者Furuya等[5]建立的胃蛋白酶-豬小腸液法，L?wgren等[6]建立的胃蛋白酶-豬十二指腸液-回腸液-糞提取液法。這些方法雖然在消化酶的來(lái)源、種類上與動(dòng)物體內(nèi)接近，但是小腸液的制備比較復(fù)雜，不同批次小腸液在組成上相差較大而難以重復(fù)，因此，近年鮮見(jiàn)關(guān)于此方法的進(jìn)一步發(fā)展。基于上述問(wèn)題，Boisen等[7]提出了用胃蛋白酶、胰液素、碳水化合物酶分別模擬豬的胃液、小腸液、大腸液的技術(shù)思路，并建立了通過(guò)酶水解有機(jī)物估測(cè)豬飼料消化能的模擬消化操作方法[4,8-9]。然而，此方法中飼料有機(jī)物的體外消化率與體內(nèi)消化率的偏差因飼料種類不同有較大變異(差值在5%～25%之間)[4]，通過(guò)有機(jī)物的體外消化率估測(cè)豬消化能(digestible energy，DE)值的精度并不高于以中性洗滌纖維估測(cè)DE值的精度[10]，而且該方法并不適用于所有飼料DE值的估測(cè)[11]。

與Boisen等[7]的技術(shù)體系類似，Regmi等[12]采用胃蛋白酶、胰液素、纖維素酶模擬豬胃腸道各段的消化液，而且各階段模擬消化液的配制、消化時(shí)間等參數(shù)與Boisen等[7]的方法有較大區(qū)別。由此可見(jiàn)，在前人以胃蛋白酶、胰液素等為消化酶源的體外模擬消化體系中，各種消化酶的總活性、消化時(shí)間等基礎(chǔ)參數(shù)的設(shè)置僅以滿足飼料底物的完全水解來(lái)確定[13]，具有較大的隨意性。因此，這些體外模擬消化技術(shù)完全脫離動(dòng)物的實(shí)際消化生理。此外，該方法所使用的胰液素是一種含有多種消化酶的復(fù)合物，不同批次的胰液素在酶學(xué)組成上是不同的，無(wú)法實(shí)現(xiàn)體外模擬腸液的重復(fù)。由此可見(jiàn)，現(xiàn)有的飼料體外模擬消化技術(shù)無(wú)論從理論上還是生產(chǎn)實(shí)踐中仍有許多關(guān)鍵技術(shù)尚未解決。豬飼料在消化道中主要進(jìn)行酶的化學(xué)性消化，其水解的介質(zhì)為胃液和腸液，因此在體外模擬消化中我們首先需要確定模擬消化液組成的生理學(xué)依據(jù)。模擬消化液與體內(nèi)消化液的水解特性有多大差異？如何實(shí)現(xiàn)模擬消化液在組成上的完全重復(fù)？弄清這些問(wèn)題對(duì)建立仿生消化法評(píng)定飼料養(yǎng)分的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值具有重要意義。

2國(guó)外豬模擬消化裝置的研究進(jìn)展

2.1基于三角瓶密閉系統(tǒng)的模擬消化器

根據(jù)豬的消化生理學(xué)特性，體外模擬消化裝置的設(shè)計(jì)可分為靜態(tài)模擬和動(dòng)態(tài)模擬。目前，在飼料常規(guī)養(yǎng)分(能量、蛋白質(zhì))的模擬消化上，多采用以三角瓶作為模擬消化器的靜態(tài)模擬法(簡(jiǎn)稱三角瓶法)[3-4,12]。該過(guò)程中，將10～50 mL消化液置于100 mL三角瓶中，由水浴搖床提供酶促反應(yīng)的溫度和模擬胃腸道的蠕動(dòng)，后續(xù)消化階段消化液的加入和pH的調(diào)節(jié)都是通過(guò)人工操作的方式進(jìn)行。通過(guò)總結(jié)1990—2010年間各國(guó)學(xué)者采用的三角瓶法模擬豬飼料的消化過(guò)程發(fā)現(xiàn)：1)不同研究者在水浴搖床的性能(溫控精度、混合強(qiáng)度)、三角瓶?jī)?nèi)消化液pH的變異范圍上都無(wú)明確的規(guī)范[13]；2)在實(shí)際操作中，小腸消化階段開(kāi)始前首先以NaOH調(diào)節(jié)緩沖液pH至中性，然后再往三角瓶中加入模擬小腸液，從而使得小腸液被稀釋，這與食糜在小腸的消化介質(zhì)為小腸液的客觀事實(shí)相悖；3)在以三角瓶作為密閉消化器的情況下，水浴搖床回旋混合時(shí)總有部分飼料樣品粘貼于三角瓶瓶壁而難以與消化液充分接觸，此外不同類的飼料粘貼程度不同且不同三角瓶間貼壁殘留的樣品同樣差異較大，然而該因素對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響程度鮮見(jiàn)相關(guān)報(bào)道；4)在水解產(chǎn)物對(duì)酶促反應(yīng)的影響上，三角瓶作為模擬消化器與外界不存在物質(zhì)交換，由于酶促反應(yīng)的飼料底物與水解產(chǎn)物共處一個(gè)溶液中，隨著反應(yīng)過(guò)程的進(jìn)行出現(xiàn)明顯的產(chǎn)物抑制反應(yīng)過(guò)程的現(xiàn)象，而這一現(xiàn)象與動(dòng)物體內(nèi)水解產(chǎn)物的及時(shí)吸收大相徑庭；5)現(xiàn)有三角瓶法通常采用過(guò)濾的方法分離酶水解物與消化殘?jiān)黐3-5,12]，在本實(shí)驗(yàn)室的前期研究中發(fā)現(xiàn)無(wú)論是國(guó)產(chǎn)定量分析濾紙還是進(jìn)口濾紙(Whatman 531)經(jīng)過(guò)布氏漏斗抽濾后濾紙自身均有重量損失，然而該因素對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響難以精確控制。綜合上述變異因素，從Clunies等[14]的試驗(yàn)結(jié)果可得出三角瓶法在胃消化期、小腸消化期的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差分別高達(dá)4.86%和6.63%。由此可見(jiàn)，傳統(tǒng)的靜態(tài)三角瓶法存在著操作過(guò)程復(fù)雜、工具不規(guī)范、酶促反應(yīng)中食糜與消化液混合不充分、水解產(chǎn)物抑制酶促反應(yīng)的速度與平衡、水解物與未水解物的分離方法難以定量等核心技術(shù)問(wèn)題。因此，欲在現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)上創(chuàng)新豬飼料養(yǎng)分模擬消化工具，首先應(yīng)逐一解決上述問(wèn)題。

2.2動(dòng)態(tài)模擬消化裝置

針對(duì)靜態(tài)模擬消化裝置的種種弊端，動(dòng)態(tài)模擬消化系統(tǒng)的研制逐漸被發(fā)達(dá)國(guó)家所重視。這些裝置主要由自制模擬消化器、消化液分泌系統(tǒng)、緩沖液pH自動(dòng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)等模塊組成，能部分實(shí)現(xiàn)模擬消化液的動(dòng)態(tài)分泌、消化條件理化參數(shù)的周期變化。如20世紀(jì)80年代加拿大學(xué)者Gauthier等[15]研制了用于模擬飼料蛋白質(zhì)在豬小腸內(nèi)消化吸收的裝置，泰國(guó)瑪希隆大學(xué)Promchan等[16]設(shè)計(jì)了動(dòng)態(tài)連續(xù)透析系統(tǒng)用于模擬微量元素在豬胃腸道內(nèi)的消化吸收。這2個(gè)裝置在設(shè)計(jì)上非常類似，其特點(diǎn)是以透析袋模擬腸壁的吸收功能，以水浴提供恒定的溫度，由專門的攪拌器或回旋震蕩模擬小腸的蠕動(dòng)，通過(guò)蠕動(dòng)泵往消化器中緩慢輸入緩沖液模擬腸系膜毛細(xì)血管的理化環(huán)境，促使酶促反應(yīng)往正方向進(jìn)行。該裝置與三角瓶法相比的優(yōu)點(diǎn)是水解產(chǎn)物對(duì)消化液環(huán)境的改變較少，水解產(chǎn)物與未水解產(chǎn)物經(jīng)由透析袋自動(dòng)分離。但該裝置的缺點(diǎn)是自動(dòng)化程度較低，蠕動(dòng)泵、水浴搖床的啟停及消化液的注入都需要通過(guò)人工手動(dòng)操作；其次是攪拌器設(shè)計(jì)成垂直攪拌，透析袋呈自然垂直或水平放置，缺乏專門的固定支撐裝置，這使得飼料樣品與消化液的混合難以充分，試驗(yàn)結(jié)束后透析袋內(nèi)未水解殘?jiān)霓D(zhuǎn)移有較大困難(若分析透析液中水解產(chǎn)物的濃度又可能會(huì)遇到樣品濃縮、緩沖液蒸發(fā)或體積變化引起的測(cè)試誤差)；模擬消化過(guò)程完成后，沒(méi)有專門針對(duì)殘留在透析袋內(nèi)的部分水解產(chǎn)物的清洗過(guò)程。

隨著現(xiàn)代自動(dòng)控制技術(shù)、人機(jī)交互技術(shù)的發(fā)展，近年來(lái)國(guó)際上在單胃動(dòng)物模擬消化裝置的研制上也逐步向全自動(dòng)程控的方向發(fā)展。如1995年荷蘭TNO食品和營(yíng)養(yǎng)研究所研制的豬胃-小腸消化仿生系統(tǒng)通過(guò)電腦自動(dòng)控制可模擬胃的排空、小腸的蠕動(dòng)和吸收及消化液的分泌。然而，該系統(tǒng)的設(shè)計(jì)初衷是用于胃腸道微生物生長(zhǎng)、藥理代謝等方面的研究，并且由于該裝置的消化道設(shè)計(jì)比較長(zhǎng)容易造成食糜堵塞及無(wú)法徹底排空等弊端，在飼料養(yǎng)分消化率測(cè)定時(shí)重復(fù)性較差，與體內(nèi)測(cè)值也相差較大[17]。我國(guó)臺(tái)灣中興大學(xué)研制的豬胃動(dòng)態(tài)消化系統(tǒng)能模擬采食后胃液pH、胃蛋白酶分泌的階段性變化，從而達(dá)到測(cè)定胃內(nèi)飼料蛋白質(zhì)消化率的目的[18]。該裝置在胃消化器的設(shè)計(jì)上基本上套用Gauthier等[15]的設(shè)計(jì)，但在自動(dòng)控制技術(shù)上利用美國(guó)LabView(Ver. 6.1)軟件通過(guò)電腦對(duì)蠕動(dòng)泵、攪拌器、pH計(jì)的啟停實(shí)行自動(dòng)化控制。因此，該裝置基本上可以達(dá)到無(wú)人值守運(yùn)行的目的，但在功能上仍難以脫離Gauthier等[15]模擬消化器類似的弊端。由此可見(jiàn)，動(dòng)態(tài)胃腸道模擬消化系統(tǒng)決定其功能的核心技術(shù)是模擬消化器(反應(yīng)器)與模擬消化流程的設(shè)計(jì)，而現(xiàn)有報(bào)道的各種自動(dòng)模擬消化裝置在功能或自動(dòng)控制技術(shù)上均難以達(dá)到全自動(dòng)定量測(cè)定豬飼料養(yǎng)分消化率的目的。因此，在新型全自動(dòng)仿生消化系統(tǒng)的設(shè)計(jì)上，如何保障飼料樣品與消化液的充分混合及防止消化過(guò)程中因混合引起食糜貼壁而干涸？從一個(gè)消化階段轉(zhuǎn)入下一消化階段后(如胃轉(zhuǎn)入小腸階段)如何防止因食糜樣品轉(zhuǎn)移引起的誤差？模擬消化結(jié)束后水解產(chǎn)物與未水解產(chǎn)物的分離如何達(dá)到高度可重復(fù)并有利于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化？如何通過(guò)電腦程控全自動(dòng)模擬運(yùn)行一個(gè)完整的消化過(guò)程，并實(shí)現(xiàn)人機(jī)交互？模擬消化的測(cè)試結(jié)果能否重演、可加并與體內(nèi)法較好地吻合？這一系列問(wèn)題尚有待于深入研究。

3豬全自動(dòng)仿生消化系統(tǒng)的研究進(jìn)展

3.1豬體內(nèi)消化液的組成

如前所述，人們對(duì)豬的模擬消化普遍采用胃→小腸→大腸3個(gè)消化階段依次進(jìn)行。因此，獲得各階段消化液的組成即消化酶的活性及緩沖液的離子濃度是制備模擬消化液的生物學(xué)基礎(chǔ)。豬胃主要起儲(chǔ)存食物、控制食糜的排空和通過(guò)胃蛋白酶在酸性條件下對(duì)食物中的蛋白質(zhì)進(jìn)行消化等作用[19]。根據(jù)Chiang等[18]報(bào)道生長(zhǎng)豬胃食糜中胃蛋白酶的酶活性在240.0～865.4 U/g間變異，通過(guò)胃內(nèi)食糜的水分含量計(jì)算得出豬胃液中胃蛋白酶的平均活性為737.5 U/mL。Fujita等[20]報(bào)道豬胃液中含Na+80.6 mmol/L、K+6.0 mmol/L、Cl-134.2 mmol/L，pH 2.0。由于目前國(guó)際上通用的胃蛋白酶測(cè)定方法及離子濃度檢測(cè)方法與上述試驗(yàn)采用的方法一致，因此，本研究組將上述參數(shù)作為生長(zhǎng)豬模擬胃液的組成成分。

育肥豬小腸的長(zhǎng)度為16～21 m，是飼料養(yǎng)分消化吸收的主要場(chǎng)所。小腸液中消化酶主要來(lái)源于胰腺分泌的淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶及少量腸腺分泌的腸肽酶、二糖酶等[21]。根據(jù)生長(zhǎng)豬小腸在距離幽門1.5～1.8 m處的腸液中消化活性最高的原則[22]，在該位置安裝空腸套管得出了正常營(yíng)養(yǎng)水平下飼糧的蛋白質(zhì)來(lái)源與水平、飼糧類型對(duì)生長(zhǎng)豬空腸液中的4種主要消化酶活性(淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶)及離子濃度無(wú)顯著性影響[23-24]。同時(shí)通過(guò)簡(jiǎn)單相關(guān)分析及典型相關(guān)分析得出生長(zhǎng)豬個(gè)體間空腸液中主要消化酶活性的變異與飼料養(yǎng)分的消化率間并無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系[25]?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，豬空腸液的組成為：淀粉酶221.4 U/mL、胰蛋白酶69.1 U/mL、糜蛋白酶8.7 U/mL、脂肪酶3.3 U/mL、Na+89.9 mmol/L、K+15.0 mmol/L、Cl-116.7 mmol/L，pH 6.44。

豬的大腸由盲腸、結(jié)腸和直腸組成，小腸未消化完全的食糜在盲腸及結(jié)腸中經(jīng)微生物產(chǎn)生的纖維素酶水解，同時(shí)也通過(guò)微生物體內(nèi)代謝產(chǎn)生短鏈脂肪酸[21]。針對(duì)豬大腸消化的特點(diǎn)，本研究組研究了3種不同纖維水平飼糧條件下生長(zhǎng)豬盲腸液的組成成分差異。結(jié)果表明，飼糧的纖維水平對(duì)盲腸液中纖維酶的活性及pH無(wú)顯著影響，而對(duì)部分離子(K+、Cl-)的濃度有顯著的影響[26]?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，同時(shí)考慮到再生纖維素材質(zhì)的透析袋對(duì)纖維素酶的耐受量，豬大腸液的組成為：纖維素酶0.04 U/mL、Na+93.2 mmol/L、K+11.1 mmol/L、Cl-25.1 mmol/L，pH 6.42。

根據(jù)上述豬體內(nèi)消化液的組成參數(shù)，本研究組以試劑級(jí)消化酶根據(jù)主要消化酶活性相等的原則配制模擬消化液，并對(duì)飼料消化所處的主要環(huán)境——模擬小腸的模擬效果進(jìn)行了檢驗(yàn)。研究結(jié)果表明，模擬腸液對(duì)玉米、小麥麩、大豆粕、棉籽粕以及4種飼糧的水解能力達(dá)體內(nèi)腸液測(cè)值的94.8%以上，且2者的相關(guān)系數(shù)為0.95以上[27]。在此基礎(chǔ)上，王鈺明[24]建立了從豬空腸液中純化主要消化酶的方法，并建立了基于提純的消化酶粉劑添加少量試劑酶制備模擬豬腸液的方法，進(jìn)一步縮小了模擬腸液與體內(nèi)腸液組成的差距。而對(duì)于模擬胃液及模擬大腸液的水解能力尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.2仿生消化裝置的開(kāi)發(fā)

模擬消化器(圖1)是飼料仿生消化的場(chǎng)所，它由透明玻璃管、透析管、緩沖液出口、緩沖液入口、消化液泵入管(含單向閥)、標(biāo)準(zhǔn)磨口(19號(hào))、翻口硅膠塞組成。在裝配消化管前，透析袋通過(guò)脫甘油、脫硫與金屬元素處理，然后從消化管一端的磨口伸入并貫穿。透析管的兩端分別在標(biāo)準(zhǔn)磨口處外翻，并覆蓋標(biāo)準(zhǔn)磨口外徑15 mm以上，用橡皮條固定。一端用翻口硅膠塞塞上，加入飼料樣品(1～2 g)和20 mL模擬胃液，最后塞上帶有消化液添加管的硅膠塞[28]。

圖1　模擬消化器

仿生消化系統(tǒng)由模擬消化器、單通道及多通道蠕動(dòng)泵、非接觸式電磁閥、恒溫?fù)u床、制冷系統(tǒng)、恒溫水浴槽、減壓裝置、上位機(jī)、電腦和控制軟件等組成，并裝配成全自動(dòng)仿生消化儀器(型號(hào)：SDS-2)。每臺(tái)仿生消化系統(tǒng)中含有2套如圖2所示的消化裝置，每次運(yùn)行可以測(cè)定2個(gè)樣品，每個(gè)樣品可獲得5個(gè)重復(fù)測(cè)定數(shù)據(jù)。該系統(tǒng)中，39 ℃的酶促反應(yīng)溫度由恒溫?fù)u床控制模擬消化器外的空氣溫度，由水浴槽維持緩沖液的溫度進(jìn)而控制透析管內(nèi)的溫度2部分組成，從而使溫度的變異范圍控制在0.5 ℃以內(nèi)。搖床通過(guò)電磁感應(yīng)可精確控制180 r/min的轉(zhuǎn)速，以對(duì)消化液和飼料進(jìn)行充分混合。豬仿生消化運(yùn)行前，用于每1個(gè)樣品測(cè)定的5根消化管按照出水口朝上、進(jìn)水口朝下的方式固定在專用臺(tái)架上，并通過(guò)硅膠軟管將模擬消化器間的出水口與進(jìn)水口依次相連。然后，將臺(tái)架卡位在恒溫?fù)u床中，且第1根消化管的進(jìn)水口與第5根消化管的出水口分別與仿生消化系統(tǒng)的進(jìn)(蠕動(dòng)泵)、出(減壓裝置)水端相連。消化液添加管通過(guò)快速接頭與多通道蠕動(dòng)泵相連。

在控制軟件中對(duì)豬消化的流程參數(shù)進(jìn)行設(shè)置，包括溫度、混合強(qiáng)度、預(yù)熱時(shí)長(zhǎng)及胃、小腸和大腸的消化時(shí)長(zhǎng)、溶液排空時(shí)長(zhǎng)、清洗液體積、清洗時(shí)間、清洗次數(shù)、消化液泵入時(shí)間與體積等共計(jì)33項(xiàng)。在預(yù)熱程序運(yùn)行完成后，自動(dòng)開(kāi)始整個(gè)仿生消化過(guò)程。胃消化階段：電磁閥1、2自動(dòng)打開(kāi)，胃緩沖液通過(guò)蠕動(dòng)泵(11，圖2)泵入模擬消化器中并循環(huán)4 h。結(jié)束后，電磁閥1、2自動(dòng)關(guān)閉。接著自動(dòng)運(yùn)行排空程序以清除模擬消化器中各透析管外的胃緩沖液。排空程序包括9、10號(hào)電磁閥自動(dòng)打開(kāi)，蠕動(dòng)泵(11，圖2)反向轉(zhuǎn)動(dòng)將模擬消化器中的殘夜泵入廢液瓶中。然后，自動(dòng)運(yùn)行3次清洗程序以清除胃階段消化的產(chǎn)物。每個(gè)清洗程序包括蠕動(dòng)泵(12，圖2)泵入1 500 mL去離子水入清洗瓶中，電磁閥7、8自動(dòng)打開(kāi)，蠕動(dòng)泵(11，圖2)將去離子水泵入模擬消化器中并循環(huán)40 min，結(jié)束后再運(yùn)行一個(gè)排空程序。胃仿生消化結(jié)束后，進(jìn)入小腸仿生消化階段：電磁閥3、4自動(dòng)打開(kāi)，小腸緩沖液通過(guò)蠕動(dòng)泵(11，圖2)泵入模擬消化器中并循環(huán)30 min后，濃縮的模擬小腸液經(jīng)多通道蠕動(dòng)泵(13，圖2)自動(dòng)泵入透析管內(nèi)。小腸緩沖液繼續(xù)循環(huán)16 h。結(jié)束后，電磁閥3、4自動(dòng)關(guān)閉，接著依次運(yùn)行排空程序和3個(gè)清洗程序。小腸仿生消化完成后，進(jìn)入大腸仿生消化階段：電磁閥5、6自動(dòng)打開(kāi)，大腸緩沖液通過(guò)蠕動(dòng)泵(11，圖2)泵入模擬消化器中并循環(huán)30 min后，濃縮的模擬大腸液經(jīng)多通道蠕動(dòng)泵(14，圖2)自動(dòng)泵入透析管內(nèi)。大腸緩沖液繼續(xù)循環(huán)3.5 h。結(jié)束后，電磁閥5、6自動(dòng)關(guān)閉，接著依次運(yùn)行排空程序和6個(gè)清洗程序，從而完成整個(gè)仿生消化過(guò)程。針對(duì)飼料脂肪的仿生消化難以實(shí)現(xiàn)，采用對(duì)烘干的未消化殘?jiān)詿o(wú)水乙醇脫脂處理[28]。

圖2　豬模擬消化流程

3.3仿生消化法模擬豬飼料養(yǎng)分消化的檢驗(yàn)

為了使仿生消化系統(tǒng)的測(cè)定精度達(dá)到最優(yōu)，對(duì)測(cè)試過(guò)程的影響因素及測(cè)定結(jié)果的變異來(lái)源進(jìn)行了研究，得出了上樣樣品的粉碎粒度為60目(過(guò)0.3 mm篩)，消化殘?jiān)那逑创螖?shù)為6次，透析袋預(yù)處理后有效使用期為90 d[29]。仿生消化各步驟中，未消化殘?jiān)晌镔|(zhì)量的變異是引起測(cè)值結(jié)果變化的主要原因[30]。模擬消化液試劑盒在4 ℃或室溫下保存10個(gè)月以內(nèi)不影響測(cè)試結(jié)果[31]。在此基礎(chǔ)上，對(duì)仿生消化方法的重演性與可加性進(jìn)行了檢驗(yàn)。結(jié)果表明，在胃-小腸兩階段消化中，同一仿生消化系統(tǒng)不同批次間玉米、大豆粕、棉籽粕、小麥麩干物質(zhì)消化率與酶水解物能值的批內(nèi)變異系數(shù)、批間變異系數(shù)和總變異系數(shù)均小于1.40%，不同仿生消化系統(tǒng)間4種飼料原料干物質(zhì)消化率與酶水解物能值的儀器內(nèi)變異系數(shù)、儀器間變異系數(shù)和總變異系數(shù)均小于1.64%[28,32]。在胃-小腸-大腸3階段消化中，6個(gè)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定仿生消化系統(tǒng)各控制參數(shù)(緩沖液流速、清洗液定量輸入量、模擬消化液定量輸入量、全程溫度控制、混合強(qiáng)度等)的變異系數(shù)在11%以內(nèi)，玉米和大豆粕酶水解物能值的變異系數(shù)控制在1.7%以內(nèi)。通過(guò)玉米、大豆粕、棉籽粕、小麥麩配制的8個(gè)飼糧對(duì)仿生消化法的可加性檢驗(yàn)表明，飼糧的干物質(zhì)消化率及酶水解物能值的實(shí)測(cè)值與理論值符合Y=X這一線性函數(shù)，表明具有滿意的可加性[33]。由此可見(jiàn)，仿生消化系統(tǒng)在重演性及可加性上可以達(dá)到定量分析的基本要求。為了進(jìn)一步研究仿生消化法與生物學(xué)法的關(guān)系，通過(guò)19個(gè)豬飼糧檢驗(yàn)仿生消化法測(cè)定的酶水解物能值與生物學(xué)法消化能值的相關(guān)系數(shù)為0.87，估測(cè)的殘差標(biāo)準(zhǔn)差不高于146.3 J/g，絕對(duì)偏差在250.8 J/g以內(nèi)。同時(shí)，以10種不同來(lái)源的棉籽粕為研究對(duì)象，除蛋氨酸外，仿生消化法測(cè)定的可消化氨基酸含量與體內(nèi)法測(cè)值均顯著相關(guān)[24]。由此可見(jiàn)，仿生消化方法在估測(cè)豬飼料的消化能值及可消化氨基酸含量上是一種潛在的技術(shù)手段。

4結(jié)語(yǔ)

從模擬消化液的規(guī)范化及全自動(dòng)仿生消化儀器的開(kāi)發(fā)2個(gè)方面同時(shí)入手有望實(shí)現(xiàn)仿生消化法的標(biāo)準(zhǔn)化。目前仿生消化方法已在國(guó)內(nèi)30多家單位推廣使用并取得了顯著的經(jīng)濟(jì)效益，但在使用中也遇到了一些問(wèn)題。項(xiàng)目組正在對(duì)豬體內(nèi)消化酶提取方法的優(yōu)化、大腸模擬消化效果的改進(jìn)及仿生消化系統(tǒng)(儀器)的生產(chǎn)工藝改進(jìn)等方面開(kāi)展了一系列工作，并取得了預(yù)期的進(jìn)展。后續(xù)工作將針對(duì)用戶反饋的問(wèn)題在確保重演性與可加性等基本原則的基礎(chǔ)上推進(jìn)仿生消化方法的優(yōu)化，為今后修訂我國(guó)的豬飼料原料標(biāo)準(zhǔn)和飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)提供技術(shù)手段。

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(責(zé)任編輯武海龍)

Advance on the Development of Bionic Digestion Method to Evaluate the Nutritional Value of Feed for Pig

WANG YumingZHAO Feng*ZHANG HuZHANG Hongfu

(State Key Laboratory of Animal Nutrition, Institute of Animal Sciences, Chinese Academy of Agriculture Science, Beijing 100193, China)

Abstract:The bionic digestion technology based on in vitro enzymatic digestion method has been widely used to evaluate the nutritional values of feed for pigs in Denmark, Netherlands, France and other developed countries. Also, the nutritive value of feedstuff determined with the bionic digestion method has been the key contribution to establish their national feeding standard. However, this technology is still not differ from the traditional in vitro enzymatic digestion method, in which the pancreatin is used to prepare the simulated digestive fluids, thus its hydrolytic activity can not be repeatable, moreover, complete manual operation progresses the in vitro digestion with the simple instruments such as flask and shaking incubator. Therefore, the biological background and standardization for preparation of simulated digestive fluid and developing a specific instrument to simulate the procedure of in vivo digestion are always the key points and the difficult to innovate the method of in vitro enzymatic digestion. This review focuses on the advance on the development of simulated digestion technology for pig and also presents the experiment results studied at the China’s State Key Laboratory of Animal Nutrition in this field.[Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(5)：1324-1331]

Key words:pig; bionic digestion; simulative digestion system

doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2016.05.006

收稿日期：2015-12-25

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(31172215)；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程(ASTIP-IAS07)；科技部創(chuàng)新方法工作專項(xiàng)(2009IM033100)

作者簡(jiǎn)介：王鈺明(1991—)，男，陜西咸陽(yáng)人，碩士研究生，從事飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的評(píng)定。E-mail: wudixiaoming@163.com *通信作者：趙 峰，副研究員，碩士生導(dǎo)師，E-mail: zsummit@iascaas.net.cn

中圖分類號(hào)：S828

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-267X(2016)05-1324-08

*Corresponding author, associate professor, E-mail: zsummit@iascaas.net.cn