劉志滔,張明,耿盧婧,杜玉枝,魏立新,尚靖

(1.中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，青海省藏藥藥理學(xué)和安全性評(píng)價(jià)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810008；2.中國(guó)科學(xué)院藏藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810008；3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

藥物安全性評(píng)價(jià)是藥物研究開(kāi)發(fā)的基礎(chǔ)[1-3]，而汞化合物的藥用歷史已有數(shù)千年，目前傳統(tǒng)民族藥物中仍有大量口服含汞制劑用于臨床，其安全性備受關(guān)注[4].藏藥佐太是一種由水銀和硫磺等原料經(jīng)復(fù)雜炮制加工而制得黑色粉末狀制劑，是珍寶類(lèi)藏成藥中最為核心的成分，至今仍是制備七十味珍珠丸、仁青常覺(jué)、仁青芒覺(jué)、坐珠達(dá)西和佐塔德子瑪?shù)让F珍寶類(lèi)藏藥的必需原料，被譽(yù)為“藏藥之王”[5].硫化汞(HgS)和單質(zhì)硫(S0)是藏藥佐太的主要成分[5-7]，二者含量超過(guò)90%[8].佐太中HgS的主要存在形式是β-HgS[5-7,9]，其性質(zhì)不溶于水，理論上難以被機(jī)體吸收[10]，但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，β-HgS及藏藥佐太口服后，其汞均可經(jīng)胃腸道而被機(jī)體吸收[11-13].因此，藏藥佐太中還含有的S0及胃腸道環(huán)境很可能是促進(jìn)二者汞溶出的重要因素.

1 材料與方法

1.1 試劑

β-HgS(AR，英國(guó)Alfa Asear公司)；升華硫(AR，天津恒興化學(xué)試劑制造有限公司)；L-Cys(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；汞元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 mg/L，國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心)；硝酸(UP，蘇州晶瑞化學(xué)股份有限公司)；鹽酸(GR，華北特種試劑有限公司)；氯化鈉、氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、磷酸二氫鉀、氯化鉀、硼酸、重鉻酸鉀、九水硫化鈉、無(wú)水亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉均為分析純?cè)噭?；試?yàn)中所用氧氣、氮?dú)饧兌仍?9.99%以上.

1.2 儀器

固相液相直接測(cè)汞儀(DMA-80，意大利Milestone公司)；超純水儀(18.2 MΩ·cm，Milli-Q-Reference，美國(guó)Millipore公司)；pH計(jì)(PB-10，美國(guó)Sartorius公司)；十萬(wàn)分之一電子天平(ME204，瑞士Mettler Toledo公司)；水浴恒溫振蕩器(SHA-BA，常州朗越儀器制造有限公司)；高速冷凍離心機(jī)(3K-15，德國(guó)Sigma公司).

1.3 溶液的配制

汞標(biāo)準(zhǔn)貯備液(1 000 μg/L)：向1 000 mL容量瓶中加入0.05%硝酸重鉻酸鉀溶液600 mL，然后加入1 mL汞元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 mg/L)，用0.05%硝酸重鉻酸鉀溶液定容至刻度，混勻后密封保存于4 ℃冰箱備用.

汞標(biāo)準(zhǔn)溶液：用汞標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和0.05%硝酸重鉻酸鉀溶液配制系列濃度為0，2，5，10，20，50，100，150，200，300，500，700，1 000 μg/L的汞標(biāo)準(zhǔn)溶液.

模擬胃液(不含胃蛋白酶)和腸液(不含胰蛋白酶)的配制參照美國(guó)藥典[18].模擬胃液：將2.0 g氯化鈉溶于500 mL超純水，加入7.0 mL濃鹽酸，混勻后用超純水定容至1 L，溶液pH值約為1.2.模擬腸液：將6.8 g磷酸二氫鉀溶于250 mL超純水，攪拌使之溶解后加入77 mL的0.2 mol/L的氫氧化鈉溶液和500 mL超純水，使用0.2 mol/L的氫氧化鈉溶液或0.2 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6.8，用超純水定容至1 L.

pH 1.2～9.6緩沖溶液的配制參考美國(guó)藥典，配制過(guò)程如下：取A溶液50 mL置于200 mL容量瓶中，加入一定量的B液，用超純水定容至刻度.A、B液的種類(lèi)和加入體積見(jiàn)表1.

含200 mg/L L-Cys的模擬胃液和腸液：稱(chēng)取200.0 mg L-Cys置于藍(lán)蓋試劑瓶中，分別加入模擬胃液和腸液，搖晃使之溶解，即得.為了避免溶液中的氧氣對(duì)L-Cys的氧化，加入的模擬胃液和腸液在使用前需通氮?dú)怙柡鸵匀コ渲械难鯕?，臨用現(xiàn)配.

含200 mg/L L-Cys的pH 1.2～9.6緩沖溶液：稱(chēng)取L-Cys 40.0 mg，置于藍(lán)蓋試劑瓶中，分別加入氮?dú)怙柡瓦^(guò)的pH 1.2～9.6緩沖溶液各200 mL，搖晃使之溶解，即得.臨用現(xiàn)配.

硫化鈉、亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉濃度分別為1～1 000 mg/L的含200 mg/L L-Cys的模擬腸液：分別稱(chēng)取769.4 mg九水硫化鈉，250.0 mg亞硫酸鈉，250.0 mg硫代硫酸鈉于220 mL模擬腸液中，振蕩使之溶解，調(diào)節(jié)pH值至6.8，用模擬腸液定容至250 mL，即得硫化鈉、亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉濃度分別為1 000 mg/L的模擬腸液.然后再逐級(jí)稀釋成硫化鈉、亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉濃度分別為1，2，5，10，20，50，100，200，500 mg/L的模擬腸液.稱(chēng)取L-Cys 50.0 mg，置于藍(lán)蓋試劑瓶中，分別加入氮?dú)怙柡瓦^(guò)的硫化鈉、亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉濃度分別為1～1 000 mg/L的模擬腸液250 mL，搖晃使之溶解，即得.所有溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8，臨用現(xiàn)配.

表1 不同pH值緩沖溶液配制時(shí)A、B液的種類(lèi)和加入量

1.4 體外溶出試驗(yàn)

根據(jù)佐太的炮制工藝中水銀與硫磺的投料比計(jì)算[16]，佐太中HgS和S0的含量分別約為54.4%和39.4%.為了模擬佐太中β-HgS和S0組成，試驗(yàn)中β-HgS和S0的稱(chēng)樣量分別為35.0 mg和26.0 mg.本研究中試驗(yàn)的選擇參考了胃腸道生理?xiàng)l件，pH范圍為1.2～9.6，覆蓋了胃腸道pH范圍[19]；L-Cys濃度為200 mg/L，為胃腸道中可能達(dá)到的L-Cys濃度[20].

體外溶出試驗(yàn)過(guò)程如下：①分別量取含或不含L-Cys的模擬胃、腸液和pH 1.2～9.6緩沖溶液45 mL于60 mL具塞廣口瓶中，每種溶液設(shè)置β-HgS組和β-HgS+S0組(β-HgS組：溶液中含有35.0 mg β-HgS；β-HgS+S0組：溶液中含有35.0 mg β-HgS和26.0 mg S0)，搖勻，平行操作5次.分別量取硫化鈉、亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉濃度為1～1 000 mg/L的含L-Cys的模擬腸液各45 mL于60 mL具塞廣口瓶中，再分別加入35 mg β-HgS，搖勻，平行操作5次.根據(jù)胃腸道生理?xiàng)l件[21]，將上述廣口瓶置于水浴恒溫振蕩器中，在37 ℃下振蕩溫孵3 h，振蕩速度為100 r/min.溫孵結(jié)束后，吸取浸出液1.5 mL，轉(zhuǎn)入離心管，在室溫下以10 000g離心20 min.離心后取上清液0.8 mL，轉(zhuǎn)入離心管，測(cè)定汞含量.

1.5 汞含量測(cè)量

本試驗(yàn)使用DMA-80型固相液相直接測(cè)汞儀測(cè)定汞含量.該儀器的線性范圍分為2段：低濃度范圍0～20 ng Hg；高濃度范圍20～1 000 ng Hg.以0～1 000 μg/L濃度的汞標(biāo)準(zhǔn)溶液上樣0.1 mL，儀器工作站軟件根據(jù)汞吸收峰峰高自動(dòng)繪制汞標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1.取0.1 mL汞標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/L)連續(xù)上樣10次，計(jì)算測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見(jiàn)表2.

圖1 汞工作曲線Figure 1 Working curve of mercury

表2 DMA-80固相液相直接測(cè)汞儀精密度試驗(yàn)

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 汞含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線及精密度

如圖1所示，低濃度范圍的汞標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.049 8x-0.002，R2=0.999 8；高濃度范圍的汞標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.001 1x-0.000 1，R2=0.999 9.其中，y代表吸光度，x代表汞元素質(zhì)量(ng).這說(shuō)明該方法在0～20 ng 及20～1 000 ng Hg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.由表2可知，10次測(cè)量值范圍為9.939 8～10.101 2 ng，平均值為10.020 8 ng，RSD=0.55%，測(cè)量精密度良好.

2.2 S0對(duì)β-HgS中汞溶出的影響

2.2.1 S0對(duì)β-HgS在模擬胃液和腸液中汞溶出的影響 本試驗(yàn)測(cè)定了β-HgS、β-HgS+S0分別在含或不含200 mg/L L-Cys的模擬胃液和腸液中溶出的汞濃度，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3.由表3可知，與β-HgS組比較，β-HgS+S0組在不含L-Cys的模擬腸液中溶出的汞濃度顯著降低(P<0.01)，其降低倍數(shù)為2.1倍；β-HgS+S0組在含L-Cys的模擬胃液和腸液中溶出的汞濃度顯著降低(P<0.001)，其降低倍數(shù)分別為2.5倍和174.8倍；β-HgS+S0組在不含L-Cys的模擬胃液中溶出的汞濃度無(wú)顯著性差異.該結(jié)果表明，S0可抑制β-HgS在不含L-Cys的模擬腸液以及含L-Cys的模擬胃液和腸液中的汞溶出；S0對(duì)β-HgS在不含L-Cys的模擬胃液中的汞溶出無(wú)明顯影響.

2.2.2 S0對(duì)β-HgS中汞溶出的影響與pH及L-Cys的關(guān)系 試驗(yàn)2.2.1中發(fā)現(xiàn)，S0對(duì)β-HgS在含或不含L-Cys的模擬胃液和腸液中汞溶出的作用存在一定差異.鑒于上述溶液的主要區(qū)別是pH和L-Cys，S0對(duì)β-HgS中汞溶出影響可能與此二者有關(guān).為了探究S0對(duì)β-HgS中汞溶出影響與pH及L-Cys的關(guān)系，本試驗(yàn)測(cè)定了β-HgS、β-HgS+S0分別在含或不含200 mg/L L-Cys的pH 1.2～9.6緩沖溶液中溶出的汞濃度，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2～3.

表3 β-HgS、β-HgS+S0分別在含或不含L-Cys的模擬胃液和腸液中溶出的汞濃度(n=5)

與β-HgS組比較，a表示P<0.01；與β-HgS with L-Cys組比較，b表示P<0.01.Comparing with β-HgS group,a indicates P<0.01;Comparing with β-HgS with L-Cys group,b indicates P<0.01.

與β-HgS+S0組比較，a表示P<0.001.Comparing with β-HgS+S0 group,a indicates P<0.001.圖3 S0對(duì)β-HgS中汞溶出的影響與L-Cys的關(guān)系(n=5)Figure 3 The relation of L-Cys with the effect of sulfur on Hg dissolution of β-HgS(n=5)

由圖2-A中可以看出，β-HgS在不含L-Cys的pH 1.2～9.6緩沖溶液中溶出的汞濃度隨著pH升高呈現(xiàn)“U”型的變化趨勢(shì)(圖中為β-HgS組)；β-HgS+S0在不含L-Cys的pH 1.2～9.6緩沖溶液中溶出的汞濃度隨著pH升高呈現(xiàn)“逐漸降低”的趨勢(shì)(圖中為β-HgS+S0組).2組比較，β-HgS+S0在不含L-Cys的pH 7.2，8.4，9.6緩沖溶液中溶出的汞濃度均顯著降低(P<0.01)，在不含L-Cys的pH 1.2～6.0緩沖溶液中溶出的汞濃度無(wú)顯著差異.由圖2-B中可知，β-HgS在含L-Cys的pH 1.2～9.6緩沖溶液中溶出的汞濃度隨著pH升高呈現(xiàn)“逐漸升高”的趨勢(shì)(圖中為β-HgS with L-Cys組)；β-HgS+S0在含L-Cys的pH 1.2～9.6緩沖溶液中溶出的汞濃度隨著pH升高呈現(xiàn)“逐漸降低”的趨勢(shì)(圖中為β-HgS+S0with L-Cys組).兩組比較，β-HgS+S0在含L-Cys的pH 1.2～9.6緩沖溶液中溶出的汞濃度均顯著降低(P<0.01).該結(jié)果提示，S0抑制β-HgS中汞溶出的作用與pH有關(guān).S0可抑制β-HgS在不含L-Cys的pH 7.2～9.6條件和含L-Cys的pH 1.2～9.6條件下的汞溶出，但對(duì)β-HgS在不含L-Cys的pH 1.2～6.0條件下的汞溶出無(wú)明顯影響.

由圖3中可以看出，β-HgS+S0在含或不含L-Cys的pH 1.2～9.6緩沖溶液中溶出的汞濃度隨著pH升高均呈“逐漸降低”的趨勢(shì).兩組比較，β-HgS+S0with L-Cys組僅在pH 1.2條件下溶出的汞濃度顯著高于β-HgS+S0(P<0.001)，其它pH條件下無(wú)顯著差異.該結(jié)果提示，S0抑制β-HgS中汞溶出的作用與L-Cys關(guān)系較小.

綜合以上結(jié)果，S0可抑制β-HgS在不含L-Cys的模擬腸液以及含L-Cys模擬胃液和腸液中的汞溶出.該抑制作用與溶液的pH條件有關(guān)，與溶液中L-Cys存在與否關(guān)系較小.

2.3 S0抑制β-HgS在含L-Cys的模擬腸液中汞溶出的機(jī)制探索

如前所述，S0極為顯著地抑制了β-HgS在含L-Cys的模擬腸液中的汞溶出.為考察S0以何種離子影響了β-HgS在含L-Cys的模擬腸液中汞溶出，本試驗(yàn)用Na2S、Na2SO3、Na2S2O3分別代表這3種離子，測(cè)定了β-HgS在Na2S、Na2SO3、Na2S2O3濃度分別為1～1 000 mg/L的含200 mg/L L-Cys的模擬腸液中溶出的汞濃度，并將這三者對(duì)β-HgS中汞溶出的作用與S0的作用進(jìn)行對(duì)比，測(cè)定及對(duì)比結(jié)果見(jiàn)圖4.

由圖4可以看出，β-HgS在Na2S和Na2S2O3濃度分別為1～1 000 mg/L的含L-Cys的模擬腸液中溶出的汞濃度隨二者濃度的增加均呈現(xiàn)“逐漸降低”的趨勢(shì)(圖中分別為β-HgS+Na2S組和β-HgS+Na2S2O3組).β-HgS在Na2SO3濃度為1～1 000 mg/L的含L-Cys的模擬腸液中溶出的汞濃度隨Na2SO3濃度的增加而呈現(xiàn)“平穩(wěn)”的趨勢(shì)(圖中為β-HgS+Na2SO3組).

與β-HgS組比較，β-HgS+Na2S(1～1 000 mg/L)組和β-HgS+Na2S2O3(50～1 000 mg/L)組溶出的汞濃度均顯著降低(P<0.01)，但是β-HgS+Na2S2O3(1～20 mg/L)組和β-HgS+Na2SO3(1～1 000 mg/L)組溶出的汞濃度無(wú)顯著變化.這提示Na2S和Na2S2O3分別在1～1 000 mg/L和50～1 000 mg/L下可抑制β-HgS在含L-Cys的模擬腸液中的汞溶出，抑制作用隨著二者濃度升高而增強(qiáng)，但是Na2SO3在1～1 000 mg/L下對(duì)β-HgS的汞溶出無(wú)明顯影響.

與β-HgS組比較，a表示P<0.01；與β-HgS+S0組比較，b表示P<0.01.β-HgS組和β-HgS+S0組不做比較.Comparing with β-HgS group,a indicates P<0.01；Comparing with β-HgS+S0 group,b indicates P<0.01.No comparison between β-HgS group andβ-HgS+S0 group.圖4 Na2S、Na2SO3、Na2S2O3分別對(duì)β-HgS在含L-Cys的模擬腸液中溶出汞濃度的影響及其與S0影響的對(duì)比(n=5)Figure 4 Effect of Na2S,Na2SO3,Na2S2O3 on dissolved Hg concentrations of β-HgS in simulated intestinal fluid with L-Cys and the comparison with the effect of S0(n=5)

與β-HgS+S0組比較，β-HgS+Na2S(1～2 mg/L)組、β-HgS+Na2S2O3(1～500 mg/L)組和β-HgS+Na2SO3(1～1 000 mg/L)組溶出的汞濃度均顯著高于β-HgS+S0組(P<0.01)；β-HgS+Na2S(100～1 000 mg/L)組溶出的汞濃度顯著低于β-HgS+S0組(P<0.01)；僅β-HgS+Na2S(5～50 mg/L)組和β-HgS+Na2S2O3(1 000 mg/L)組溶出的汞濃度與β-HgS+S0組無(wú)顯著性差異.這提示Na2S和Na2S2O3分別在5～50 mg/L和1 000 mg/L下抑制β-HgS在含L-Cys的模擬腸液中汞溶出的作用與S0的抑制作用相似.

3 討論

前期研究表明，佐太在不含L-Cys的模擬腸液以及含L-Cys的模擬胃液和腸液中溶出的汞濃度顯著低于β-HgS[15]，但在不含L-Cys的模擬胃液中溶出的汞濃度顯著高于β-HgS[114-15].本研究模擬佐太中β-HgS和S0組成，并比較β-HgS、β-HgS和S0混合物的汞溶出情況，其結(jié)果顯示，S0可抑制β-HgS在不含L-Cys的模擬腸液以及含L-Cys的模擬胃液和腸液中的汞溶出，但對(duì)β-HgS在不含L-Cys的模擬胃液中的汞溶出無(wú)明顯影響.雖然佐太的主要成分是β-HgS和S0，但是佐太中還含有少量的碳單質(zhì)及其它金屬的硫化物和氧化物等[5,22]，仍無(wú)法判斷S0是造成佐太與β-HgS汞溶出差異的原因.而S0對(duì)β-HgS在不含L-Cys的模擬胃液中溶出的汞濃度無(wú)明顯作用的原因可能是S0在酸性條件下性質(zhì)較為穩(wěn)定[17].

本研究還發(fā)現(xiàn)，Na2S和Na2S2O3分別在5～50 mg/L和1 000 mg/L下抑制β-HgS在含L-Cys的模擬腸液中汞溶出的作用與S0的抑制作用相似.本試驗(yàn)是將26 mg S0溶于45 mL含L-Cys的模擬腸液中，其濃度為577.8 mg/L.根據(jù)S0的反應(yīng)方程式[17]，S0完全溶解后理論上可產(chǎn)生703.1 mg/L的Na2S和712.3 mg/L的Na2S2O3.但是實(shí)驗(yàn)中S0并未完全溶解，溶液中仍肉眼可見(jiàn)部分S0，故溶液中Na2S和Na2S2O3的實(shí)際濃度遠(yuǎn)低于其理論值.當(dāng)溶液中Na2S和Na2S2O3濃度均較低時(shí)，Na2S2O3抑制β-HgS中汞溶出的作用遠(yuǎn)不及Na2S.有文獻(xiàn)指出，S0在中性或弱堿條件下能夠生成S2-[17]，并且S2-可抑制β-HgS在pH 6.0～8.0條件下的汞溶出[23].本實(shí)驗(yàn)所用L-Cys的模擬腸液的pH為6.8，滿足S0通過(guò)生成S2-抑制β-HgS汞溶出的條件.而曾克武等[24]的研究結(jié)果顯示，Na2S可促進(jìn)朱砂中汞的溶出.但朱砂中汞的存在形式為α-HgS，其存在形式的不同可能導(dǎo)致S2-對(duì)二者汞溶出的影響出現(xiàn)相反結(jié)果.同時(shí)，該研究中所用溶液的pH值遠(yuǎn)大于6.8，pH的不同也可能造成S2-對(duì)二者汞溶出影響的巨大差異.

4 結(jié)論

綜上所述，S0是造成β-HgS在不含L-Cys的模擬腸液和含L-Cys的模擬胃、腸液中溶出的汞濃度顯著降低的主要因素；S0主要通過(guò)生成S2-來(lái)抑制β-HgS在含L-Cys的模擬腸液中的汞溶出.通過(guò)本研究，探究了S0在藏藥佐太中的存在意義，對(duì)佐太及含佐太的珍寶類(lèi)藏藥的安全性評(píng)價(jià)也具有重要的參考價(jià)值.