歐陽晗月　樂　勇　張永法　郭榮平　石　明

510060 中山大學(xué)腫瘤防治中心

?

SPARCL1在肝癌中的表達(dá)及其臨床意義

歐陽晗月樂勇張永法郭榮平石明

510060 中山大學(xué)腫瘤防治中心

【摘要】目的探討SPARCL1表達(dá)與肝癌患者術(shù)后預(yù)后的關(guān)系。方法收集154例肝癌患者的術(shù)后石蠟切片標(biāo)本、臨床病理資料及隨訪資料，采用免疫組化染色方法對石蠟切片組織中SPARCL1進(jìn)行檢測。結(jié)果不同肝癌組織中SPARCL1的水平具有差異;SPARCL1表達(dá)下調(diào)與門脈癌栓、病理分化差、TNM分期晚和BCLC分期晚等惡性指標(biāo)顯著相關(guān);SPARCL1表達(dá)下調(diào)的肝癌患者其中位生存時間顯著縮短(40.6個月vs118.7個月，P=0.002)。結(jié)論SPARCL1在肝癌中表達(dá)下調(diào)，提示肝癌患者的預(yù)后不良。

【關(guān)鍵詞】肝癌；SPARCL1；預(yù)后

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:701～703)

SPARCL1(SPARC-like 1)是1種分泌至細(xì)胞外基質(zhì)的多功能糖蛋白,其與SPARC、SMOC-2等成員共同組成SPARC家族[1]。目前人類多種腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)SPARCL1水平下調(diào)，并預(yù)示著腫瘤進(jìn)展，其中前列腺癌、腸癌組織的SPARCL1下調(diào)提示患者的不良預(yù)后[2-4]。目前國內(nèi)尚無SPARCL1在肝癌的研究報道。本研究旨在探討肝癌組織中SPARCL1水平與臨床病理資料相關(guān)性和其對肝癌患者預(yù)后的影響。

1材料與方法

1.1研究對象

收集2001年至2005年間本院肝膽科行手術(shù)治療的原發(fā)性肝癌確診病例154例的臨床病理資料。入組標(biāo)準(zhǔn)：①首次就診診斷為原發(fā)性肝癌并未接受任何治療；②無腹腔積液及肝性腦??；③肝功能分級為Child-Pugh A級。臨床分期采用第七版TNM和巴塞羅那BCLC分期系統(tǒng)，病理分級則采用Edmondson-Steiner分級法。隨訪資料均來自于本院隨訪科，截止到2014年11月1日止，死亡87例，所有入組患者中位總生存時間為 49.9個月。入組患者的詳細(xì)資料見表1。

1.2主要試劑和儀器

免疫組化用SPARCL1兔抗人多克隆抗體一抗，購自美國abcam公司；免疫組化用鼠/兔通用二抗及DAB顯色系統(tǒng)等均購自丹麥Dako公司。

1.3主要步驟及結(jié)果判定

免疫組化主要步驟：脫蠟和水化后，依次經(jīng)3%過氧化氫10 min、檸檬酸緩沖液高壓修復(fù)抗原10 min。滴加SPARCL1一抗4 ℃過夜，室溫平衡至少1 h。滴加二抗后于37 ℃孵育30 min。PBS漂洗后經(jīng)DAB顯色約3 min。雙蒸水漂洗4次后蘇木精復(fù)染1 min，風(fēng)干后封片。

表1　SPARCL1表達(dá)水平與肝癌臨床病理資料的相關(guān)性/例

結(jié)果判定：為了避免人為偏倚，我們采用Vectra-Inform分析系統(tǒng)對免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行自動標(biāo)準(zhǔn)化評分。具體如下：完成染色后的免疫組化片首先用Nuance VIS-FL多譜成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照和儲存，然后用InForm 2.0.1軟件進(jìn)行分析，經(jīng)過預(yù)先訓(xùn)練的InForm 2.0.1軟件不僅可以準(zhǔn)確區(qū)分腫瘤組織、癌旁組織和空白等不同組織，而且可以區(qū)分細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。選取腫瘤癌巢區(qū)域的細(xì)胞質(zhì)為目的檢測范圍，應(yīng)用InForm 2.0.1軟件對目的區(qū)域每百萬像素上的DAB染色進(jìn)行強度計算并打分，求和，可得到每張免疫組化染色片上的DAB染色總分，根據(jù)軟件計算結(jié)果，以中位數(shù)為分界點，將肝癌患者分為SPARCL1陰性表達(dá)和陽性表達(dá)兩組。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理

全部數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，χ2檢驗分析SPARCL1表達(dá)水平與肝癌患者臨床病理資料的相關(guān)性；不同SPARCL1水平肝癌患者的生存曲線采用Kaplan-Meier方法繪制，Log-Rank檢驗用于比較生存曲線間的差異。P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1SPARCL1在肝癌組織的表達(dá)情況

免疫組化的結(jié)果顯示，肝癌組織中的SPARCL1信號均定位于細(xì)胞質(zhì)，而且其在不同肝癌組織中的表達(dá)水平存在差異，根據(jù)上述結(jié)果判定方法及InForm軟件評分可將患者分為陰性表達(dá)組和陽性表達(dá)組。

2.2SPARCL1表達(dá)水平與肝癌患者臨床病理資料的關(guān)系

根據(jù)上述分組方法將患者分為陰性組和陽性組，用卡方檢驗方法分析肝癌組織標(biāo)本SPARCL1的表達(dá)水平與患者各項臨床病理指標(biāo)的關(guān)系。結(jié)果顯示SPARCL1低表達(dá)與門脈癌栓、病理分化差、BCLC分期晚、TNM分期晚等惡性指標(biāo)存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，而與性別、年齡及肝功能等指標(biāo)無明顯相關(guān)性。

2.3肝癌組織SPARCL1表達(dá)水平與肝癌預(yù)后的關(guān)系

生存分析顯示，SPARCL1 陽性表達(dá)的肝癌患者其中位生存時間為118.7個月，而陰性表達(dá)患者僅為40.6個月，兩者之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1，P=0.002)。

圖1　SPARCL1表達(dá)水平與肝癌患者生存曲線圖

3討論

肝細(xì)胞癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢[5]。近年來，盡管肝癌的診療手段已取得巨大進(jìn)展，仍有超過一半的患者就診時已處于肝癌晚期而無法接受根治性治療，有機會行手術(shù)切除和肝移植治療的初診患者僅占30%左右。對于接受根治性手術(shù)治療的肝癌患者，由于復(fù)發(fā)和腫瘤轉(zhuǎn)移率高，其術(shù)后5年生存率也僅為50%左右[6-7]。因此深入探討肝癌發(fā)病機制，尋找與肝癌患者預(yù)后密切相關(guān)的分子標(biāo)志物，對臨床工作中判斷肝癌患者的預(yù)后和進(jìn)一步完善肝癌的治療將具有十分重要的意義。

SPARCL1是1個單拷貝基因,定位于人類染色體4q22-25區(qū)段，該區(qū)段已被發(fā)現(xiàn)在人類多種腫瘤中發(fā)生缺失，提示SPARCL1可能是該區(qū)段的重要抑癌基因之一[8-10]。Bendik等學(xué)者最早在非小細(xì)胞肺癌和腸癌腫瘤組織發(fā)現(xiàn)SPARCL1水平發(fā)生下調(diào)[11]；Hu等學(xué)者通過體外、體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)SPARCL1能抑制腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)腸癌細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化,并進(jìn)一步地通過多中心的研究顯示SPARCL1與腸癌患者的良好預(yù)后有關(guān)[3]；Hurley等學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)SPARCL1可通過與Ⅰ型膠原結(jié)合，阻斷RHOC途徑，從而抑制前列腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，其表達(dá)水平與前列腺癌患者預(yù)后相關(guān)[4]。也有少量文獻(xiàn)報道SPARCL1可作為腫瘤相關(guān)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的一種標(biāo)記物[12]?？傊?，SPARCL1在人類腫瘤中的作用尚有待進(jìn)一步的研究。

我們通過免疫組化染色的方法發(fā)現(xiàn)在肝癌組織中，SPARCL1的信號均定位于胞質(zhì)，而且，其水平在不同的肝癌組織中具有差異。根據(jù)InForm軟件評分進(jìn)行分組和分析發(fā)現(xiàn)，SPARCL1的下調(diào)與門脈癌栓、病理分級高、BCLC分期晚、TNM分期晚等惡性臨床病理指標(biāo)密切相關(guān)。進(jìn)一步生存分析結(jié)果顯示SPARCL1陰性的肝癌患者，其生存時間顯著地低于SPARCL1陽性的患者(118.7個月vs 40.6個月;P=0.002)。本研究表明SPARCL1參與了肝癌的發(fā)生和發(fā)展，其表達(dá)水平發(fā)生下調(diào)與肝癌的侵襲性和惡性程度增加顯著相關(guān)，提示其具有腫瘤抑制的功能。同時，SPARCL1也是提示肝癌患者預(yù)后的標(biāo)志物。

參考文獻(xiàn)

[1]Girard JP,Springer TA.Cloning from purified high endothelial venule cells of hevin,a close relative of the antiadhesive extracellular matrix protein SPARC〔J〕.Immunity,1995,2(1):113-123.

[2]Nelson PS,Plymate SR,Wang K,et al.Hevin,an antiadhesive extracellular matrix protein,is down-regulated in metastatic prostate adenocarcinoma〔J〕.Cancer Res,1998,58(2):232-236.

[3]Hu H,Zhang H,Ge W,et al.Secreted protein acidic and rich in cysteines-like 1 suppresses aggressiveness and predicts better survival in colorectal cancers〔J〕.Clin Cancer Res,2012,18(19):5438-5448.

[4]Hurley PJ,Marchionni L,Simons BW,et al.Secreted protein,acidic and rich in cysteine-like 1(SPARCL1)is down regulated in aggressive prostate cancers and is prognostic for poor clinical outcome〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2012,109(37):14977-14982.

[5]Jemal A,Bray F,Center MM,et al.Global cancer statistics〔J〕.CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.

[6]Forner A,Llovet JM,Bruix J.Hepatocellular carcinoma〔J〕.Lancet,2012,379(9822):1245-1255.

[7]Villanueva A,Hoshida Y,Battiston C,et al.Combining clinical,pathology,and gene expression data to predict recurrence of hepatocellular carcinoma〔J〕.Gastroenterology,2011,140(5):1501-1512 e1502.

[8]Isler SG,Schenk S,Bendik I,et al.Genomic organization and chromosomal mapping of SPARC-like 1,a gene down regulated in cancers〔J〕.Int J Oncol,2001,18(3):521-526.

[9]Halbwedl I,Ullmann R,Kremser ML,et al.Chromosomal alterations in low-grade endometrial stromal sarcoma and undifferentiated endometrial sarcoma as detected by comparative genomic hybridization〔J〕.Gynecol Oncol,2005,97(2):582-587.

[10]Murray JC,Heng YM,Symonds P,et al.Endothelial monocyte-activating polypeptide-II(EMAP-II):a novel inducer of lymphocyte apoptosis〔J〕.J Leukoc Biol,2004,75(5):772-776.

[11]Bendik I,Schraml P,Ludwig CU.Characterization of MAS-

T9/Hevin,a SPARC-like protein,that is down-regulated in non-small cell lung cancer〔J〕.Cancer Res,1998,58(4):626-629.

[12]St Croix B,Rago C,Velculescu V,et al.Genes expressed in human tumor endothelium〔J〕.Science,2000,289(5482):1197-1202.

(編輯：吳小紅)

Expression of SPARCL1 in Primary Hepatocellular Carcinoma and Its Clinical Significance

OUYANGHanyue,LEYong,ZHANGYongfa,etal.

CancerCenterofSunYat-senUniversity,Guangzhou,510060

【Abstract】ObjectiveTo explore the expression of SPARCL1 in resectable human hepatocellular carcinoma(HCC)and investigate the clinical role of SPARCL1 in HCC.Methods154 specimens of HCC patients after resection and their clinicopathological data were collected.The expression levels of SPARCL1 in tumor were detected by immunohistochemistry(IHC)method.ResultsThe expression level of SPARCL1 in different HCC tissues had difference,and negative expression level of SPARCL1 was closely correlated with portal vein tumor invasion,pathological differentiation,BCLC staging and TNM staging.The overall survival of patients with SPARCL1 negative expression was significantly shorter(40.6 months vs 118.7 months,P=0.002).ConclusionNegative expression of SPARCL1 predicts bad prognosis in HCC patients.

【Key words】SPARCL1;Hepatocellular Carcinoma;Prognosis

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(81272639)；高?；究蒲谢痦椖?13ykzd24)；中山大學(xué)5010計劃項目(2007043)

通訊作者：石明

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.05.002

中圖分類號：R735.7

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-5930(2016)05-0701-03

(收稿日期2015-04-07修回日期 2016-03-15)