白　瑞，程志學(xué)，于志慧，尹志紅，范瑞文，龐全海，董常生（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801）

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不同代次羊駝皮膚黑素細(xì)胞TYR基因表達(dá)變化的研究

白瑞，程志學(xué)，于志慧，尹志紅，范瑞文，龐全海，董常生
（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801）

摘要：為了探討TYR基因在體外培養(yǎng)的羊駝皮膚黑素細(xì)胞不同代次間表達(dá)變化差異，根據(jù)GenBank中已發(fā)現(xiàn)的序列（EU293064）設(shè)計(jì)引物和探針，以羊駝皮膚黑素細(xì)胞的RNA為模板，采用QRT-PCR TaqMan探針法研究羊駝酪氨酸酶基因在不同代次間羊駝皮膚黑素細(xì)胞中mRNA表達(dá)量.結(jié)果表明，經(jīng)過內(nèi)參基因校正后，第10代羊駝黑素細(xì)胞中TYR基因的相對表達(dá)量是第3代細(xì)胞相對表達(dá)量的25倍（P＜0.01），第10代細(xì)胞與第5代細(xì)胞表達(dá)差異不明顯（P＞0.05）。表明TYR基因表達(dá)量的差異與羊駝皮膚黑素細(xì)胞傳代可能存在一定的相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：羊駝皮膚黑素細(xì)胞；TYR基因；QRT-PCR TaqMan探針法；基因表達(dá)水平

哺乳動(dòng)物機(jī)體中，黑素大多分布在皮膚、毛囊以及眼睛等處。在細(xì)胞中，黑素是由黑素細(xì)胞胞漿當(dāng)中的黑素小體產(chǎn)生，其黑素有兩種類型，一種為真黑素，一種為褐黑素［1］。動(dòng)物與人的皮膚毛發(fā)色素沉著決定于其所含真黑色素與褐黑色素的相對數(shù)量［2-3］。大量的研究表明，黑素細(xì)胞內(nèi)黑色素的生物合成是一個(gè)由酪氨酸酶（Tyrosinase，TYR）催化體內(nèi)酪氨酸羥化而啟動(dòng)的一系列生化反應(yīng)［4-6］。TYR是黑素合成過程中的關(guān)鍵酶，具有酪氨酸羥化酶和多巴氧化2種活性［7］。由于酪氨酸酶在黑素細(xì)胞中生成黑色素發(fā)揮很關(guān)鍵的功能，因此研究羊駝皮膚黑素細(xì)胞系中酪氨酸的表達(dá)有助于我們進(jìn)一步研究羊駝皮膚顏色和毛發(fā)顏色。這項(xiàng)研究說明，研究羊駝皮膚黑素細(xì)胞模型是有價(jià)值的，進(jìn)一步表明在羊駝皮膚黑素細(xì)胞上利用RNAi技術(shù)研究酪氨酸酶和其他毛色基因的功能是具有深遠(yuǎn)的意義。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)及樣本羊駝黑素細(xì)胞由羊駝生物工程實(shí)驗(yàn)室保存，細(xì)胞樣本分別取第3代、5代、第10代羊駝皮膚黑素細(xì)胞，同時(shí)培養(yǎng)72 h后，PBS清洗細(xì)胞3次，提取總RNA。

1.2主要試劑和儀器羊駝皮膚黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基（由羊駝生物工程實(shí)驗(yàn)室配置）、TRIZol、SuperScrip III First-strand（18080-051）、Platinum Taq酶（5 U/ μL）（11304-029）、探針合成、dNTP（BF6901B）、10×PCR Buffer、超純水均購自Invitrogen公司；上下游引物（10 μmol/L）由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司）；BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）；DL-CJ-1ND醫(yī)用型超凈工作臺等。

1.3方法

1.3.1羊駝皮膚黑素細(xì)胞總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄cDNA分別取傳代培養(yǎng)的第3代、第5代、第10代黑素細(xì)胞，并用TRIZol提取總RNA，分別取1 μL，用核酸蛋白測定儀測定A260nm/A280nm、A260nm/A230nm的吸光度值，并計(jì)算其濃度。然后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。10 μL反應(yīng)體系中含5×PrimeScriptTMBuffer 2 μL，PrimeScriptTMRT Enzyme Mix 10.5 μL，Oligo dt Primer 25 pmol/L，隨機(jī)引物50 pmol/L，Total RNA 1 μL，DEPC水加至10 μL。上述成分混勻后置于PCR儀器中，反應(yīng)條件：37℃15 min，85℃5 s；4℃保存。

1.3.2TYR基因引物設(shè)計(jì)參照GenBank公布的TYR基因序列，應(yīng)用Premier 5.0設(shè)計(jì)引物。為了檢測各RNA樣品完整性和反轉(zhuǎn)錄效率之間的差別，將待測樣品中的持家基因18S rRNA設(shè)為內(nèi)參。引物和探針都由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。引物探針詳細(xì)資料見表1和表2。

表1　實(shí)時(shí)熒光定量PCR中所用的引物序列

表2　實(shí)時(shí)熒光定量PCR中所用的探針序列

1.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立和目的基因定量將羊駝皮膚黑素細(xì)胞的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并以2倍梯度稀釋，相對濃度為20、2-2、2-4、2-6、2-8，以其為實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增模板，羊駝皮膚黑素細(xì)胞的cDNA濃度在536～658 ng/L之間，按照篩選好的QRT-PCR反應(yīng)體系條件進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)完成后，軟件自動(dòng)導(dǎo)出擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線、溶解曲線和循環(huán)閾值，反應(yīng)結(jié)束后生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，借助軟件分析導(dǎo)出內(nèi)標(biāo)基因和目的基因標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、擴(kuò)增效率R2以及直線方程系數(shù)（斜率），并分析兩者斜率之差。且樣本重復(fù)的Ct值之間差異小于1個(gè)循環(huán)，說明目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率相同，就可以通過△△Ct法進(jìn)行相對定量［4-5］。△Ct（第3代細(xì)胞）= Ct（目的基因）-Ct（內(nèi)參基因），△Ct（第5代細(xì)胞）= Ct（目的基因）-Ct（內(nèi)參基因），△Ct（第10代細(xì)胞）= Ct（目的基因）-Ct（內(nèi)參基因），△△Ct=△Ct（第n代細(xì)胞目的基因）-△Ct（第n代細(xì)胞內(nèi)參基因），TYR基因的相對表達(dá)水平= 2-△△CT。

試驗(yàn)中各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)均做3個(gè)重復(fù)，另加3個(gè)無模板的陰性對照，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行自動(dòng)熔解曲線分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和熒光曲線的Ct值計(jì)算定量結(jié)果。QRT-PCR反應(yīng)體系: cDNA模板1 μL，10× PCR Buffe2.5 μL，鎂離子（25 mmol/L）2 μL，dNTPs （25 mmol/L）0.2 μL，上下游探針（10 μmol/L）各0.5 μL，Taq酶0.3 μL，滅菌蒸餾水加至25 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 s，95℃5 s，59℃20 s，72℃10 s，40個(gè)循環(huán)，95℃1 min，55℃30 s，95℃30 s。

1.3.4數(shù)據(jù)分析及處理用Excel軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Means± SD）表示，并使用SPSS13.0軟件進(jìn)行ANOVA分析，其中TYR基因表達(dá)量結(jié)果均經(jīng)相應(yīng)持家基因18S rRNA表達(dá)量校正。

2　結(jié)果

2.1羊駝皮膚黑素細(xì)胞RNA的完整性、產(chǎn)率和純度細(xì)胞總RNA經(jīng)提取純化后通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行快速分析（15V/cm），從圖1中可見，總RNA有明顯的3條帶（5S、18S和28S），表明提取和純化效果較好。利用核酸/蛋白濃度測定儀對RNA樣品進(jìn)行濃度及純度的檢測結(jié)果顯示：OD260/OD280的比值在1.8～2.1之間，可以進(jìn)行后續(xù)的熒光定量PCR反應(yīng)。

圖1　羊駝皮膚黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)第3代、第5代、第10代細(xì)胞總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立本試驗(yàn)對目的基因TYR與內(nèi)參基因建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2中顯示，直線斜率分別是0.041，表明18S rRNA與TYR基因擴(kuò)增反應(yīng)效率一致，2-ΔΔCT相對定量方法適合于本試驗(yàn)。

圖2　2-ΔΔCT方法的確定

2.3qRT-PCR擴(kuò)增目的基因產(chǎn)物的鑒定目的基因和內(nèi)參基因經(jīng)過熒光定量PCR擴(kuò)增后，2%瓊脂糖凝膠電泳，第3代、第5代、第10代細(xì)胞TYR和18S rRNA，分別是108 bp和158 bp的片段，確定為是所需的目的基因，圖3。

圖3　TYR和18S rRNA基因瓊脂糖凝膠電泳圖M：DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量DL-2 000；1：第3代細(xì)胞TYR基因擴(kuò)增產(chǎn)物；2：第5代細(xì)胞TYR基因擴(kuò)增產(chǎn)物；3：第10代細(xì)胞TYR基因擴(kuò)增產(chǎn)物；4：內(nèi)參18SrRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物

2.4目的基因TYR和內(nèi)參基因18S rRNA擴(kuò)增曲線本試驗(yàn)內(nèi)參基因選用18SrRNA，進(jìn)行TYR基因和18S rRNA基因探針定量和擴(kuò)增分析，見圖4。其目的基因TYR和內(nèi)參基因18S rRNA擴(kuò)增曲線基線平直，“S”形曲線良好，拐點(diǎn)清楚。

圖4　TYR和18S rRNA的擴(kuò)增曲線A：TYR基因擴(kuò)增曲線；B：18S rRNA擴(kuò)增曲線

2.5不同代次間TYR基因mRNA表達(dá)的變化量

試驗(yàn)結(jié)果表明，隨這羊駝皮膚黑素細(xì)胞在體外培養(yǎng)傳代次數(shù)的增加，TYR表達(dá)量是逐漸增加的，TYR在第10代細(xì)胞中表達(dá)量較高，與第10代和5代細(xì)胞表達(dá)差異不顯著（P＞0.05），而在第5代較第3代細(xì)胞中表達(dá)高，他們之間的表達(dá)差異級顯著（P＜0.01）（圖5）。

圖5　目的基因mRNA表達(dá)結(jié)果

3　討論

3.1關(guān)于實(shí)時(shí)熒光定量TaqMan探針法QRT-PCR 是PCR技術(shù)中的一種高靈敏度核酸定量技術(shù)，包括SYBR-Green、FRET探針、TaqMan探針、分子信標(biāo)等手段［8］。其中SYBR Green為非特異性法，其原理是SYBR Green熒光染料可與雙鏈DNA結(jié)合，兩者相連后其熒光強(qiáng)度是游離狀態(tài)下的10～100倍，可被熒光PCR儀檢捕捉到熒光信號［9］。此方法優(yōu)勢是能監(jiān)測任何dsDNA的擴(kuò)增，而且不需要探針，檢測方法也較為簡便，成本也較為低廉。但缺點(diǎn)是特異性較差，容易受引物二聚體影響［10］。TaqMan探針法備受研究人員青睞，主要是它具有較高序列特異性，并適合檢測低拷貝模板。其原理是用雙標(biāo)記熒光探針與擴(kuò)增片斷結(jié)合，在探針5′端和3′端各有一個(gè)熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)，在Taq酶5′端有外切酶活性水解探針，利用此探針可使熒光基團(tuán)與淬滅熒光基團(tuán)分離從而發(fā)射熒光，這樣反應(yīng)體系中熒光的強(qiáng)度與系統(tǒng)中真正擴(kuò)增產(chǎn)物的分子數(shù)量相一致［8］。其熒光強(qiáng)度則是系統(tǒng)中發(fā)射熒光分子量的總和，即反應(yīng)系統(tǒng)中每擴(kuò)增一條DNA雙鏈，就產(chǎn)生一個(gè)發(fā)射熒光分子，所以反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量相等。

由于本研究在NCBI上檢索到的羊駝TYR基因只有122 bp大小的片段，因此對本實(shí)驗(yàn)造成了一定的難度，在短序列上設(shè)計(jì)引物，用SYBR Green法不能十分準(zhǔn)確的完成不同代次細(xì)胞見TYR基因的表達(dá)量的檢測，因此我們選用更具有特異性強(qiáng)的TaqMan探針法在研究該基因的表達(dá)量。

3.2不同代次間TYR表達(dá)變化量的探討據(jù)我們的研究，參照前人在細(xì)胞傳代上生物學(xué)特性以及細(xì)胞內(nèi)酶變化量的研究，我們得到羊駝皮膚黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)與其它類型的細(xì)胞一樣，都有原代培養(yǎng)期、傳代培養(yǎng)期及衰退期。傳代旺盛的細(xì)胞，通常核型為二倍體，保留著原組織的生物學(xué)特征。長期傳代的細(xì)胞，將逐漸失去二倍體，使得細(xì)胞生長變緩、衰退、甚至于死亡［11］。

在本課題先前的研究中，羊駝皮膚黑素細(xì)胞的原代和傳代細(xì)胞其形態(tài)結(jié)構(gòu)并無明顯差異，傳代至15代后細(xì)胞體積增大，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)顆粒物質(zhì)增加，核分裂相減少，透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少，線粒體變形，此變化都是細(xì)胞衰老的早期表現(xiàn)。

由于羊駝皮膚黑素細(xì)胞至今還沒有人研究，目前在細(xì)胞系中的各種和毛色相關(guān)的基因變化量尚不是很清楚。而TYR作為黑素細(xì)胞內(nèi)黑素生成過程中一個(gè)重要的基因。TYR表達(dá)變化量是反映黑素細(xì)胞合成黑色素顆粒能力的重要指標(biāo)。在本試驗(yàn)中，前10代的細(xì)胞具有較高的TYR表達(dá)，隨著代次的增加細(xì)胞內(nèi)合成黑素顆粒增多，其生物特性穩(wěn)定。提示選用10代以內(nèi)的羊駝皮膚黑素細(xì)胞，為羊駝毛色基因的研究提供了細(xì)胞模型。

因此，我們對不同代次間TYR基因的表達(dá)量的研究，給了我們一個(gè)初步認(rèn)識羊駝皮膚黑素細(xì)胞的特性。建立羊駝皮膚黑素細(xì)胞系，其目的是建立一個(gè)皮膚色素細(xì)胞模型，在這個(gè)平臺上來研究羊駝毛色基因的功能和作用機(jī)理，為我們進(jìn)一步探究羊駝毛色色素沉積和改變毛色奠定一個(gè)理論基礎(chǔ)。

4　小結(jié)

根據(jù)NCBI上登錄的酪氨酸酶基因122 bp的已知序列設(shè)計(jì)熒光定量引物和TaqMan探針，采用QRT-PCR TaqMan探針法研究羊駝酪氨酸酶基因在不同代次間羊駝皮膚黑素細(xì)胞中mRNA表達(dá)量，以尋找合適的細(xì)胞代數(shù)酪氨酸酶基因表達(dá)量最高，結(jié)果得出，TYR基因在第10代羊駝皮膚黑素細(xì)胞中的基因表達(dá)量經(jīng)內(nèi)參基因校正后相對于前面?zhèn)鞔牡?代細(xì)胞表達(dá)量的25倍，相對于第5代細(xì)胞表達(dá)量的20倍以上，第10代細(xì)胞與第5代細(xì)胞表達(dá)差異不明顯。在后續(xù)研究羊駝毛色基因中可以選取10代前的細(xì)胞進(jìn)行基因功能研究。

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Expression Level Analysis of TYR Genein Alpaca Skin Melanocytewith Different Passage

BAI Rui，CHENG Zhi-xue，YU Zhi-hui，YIN Zhi-hong，F(xiàn)AN Rui-wen，PANG Quan-hai，DONG Chang-sheng
（College of Animal Science and Veterinary Medicine，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

Abstract：This study explores TYR gene expression profiles in vitro cultured alpaca melanocyte with different passage.According to the sequence in Genank（EU293064），a pair of specific primers and probes were designed and the relative expression level of TYR gene in different passages for alpaca melanocytes was analyzed using QRT-PCR TaqMan probe method and SPSS13.0 software.The results showed that the relative gene expression level of TYR in the 10thgeneration of alpaca melanocytes was 25 times of that in the 3rdgeneration of alpaca skin melanocytes（P＜0.01），Expressional intensity of TYR gene in the 10thand 5thgenerations of alpaca melanocytes had no significant difference（P＞0.05）.Our results suggest that the gene expression level of alpaca TYR may be related to the alpaca skin melanocytes with different passages.

Key words：Alpaca skin melanocyte；TYR gene；QRT-PCR TaqMan probe method；Gene expression level Corresponding author：DONG Chang-sheng

中圖分類號：S829.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0529- 6005（2016）03- 0006- 04

收稿日期：2014-12-31

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30972223；31272628）

作者簡介：白瑞（1981-）男，講師，博士，主要從事羊駝毛色基因功能和動(dòng)物病理學(xué)方面的研究，E-mail：chinabairui@163.com

通訊作者：董常生：E-mail：cs_dong@sxau.edu.cn