張　蕾，肖　進(jìn)，2，董春娜，巴利民，栗利芳，宋　芳，王　楠，周　強(qiáng)，齊　鵬，汪　明，2（.中牧實(shí)業(yè)股份有限公司農(nóng)業(yè)部獸用生物制品與化藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室北京市獸用多肽疫苗設(shè)計(jì)與制備工程技術(shù)中心，北京豐臺(tái)00070；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京海淀0093）

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?？谔阋逴型合成肽VP1結(jié)構(gòu)蛋白ELISA抗體檢測(cè)方法的建立

張蕾1，肖進(jìn)1，2，董春娜1，巴利民1，栗利芳1，宋芳1，王楠1，周強(qiáng)1，齊鵬1，汪明1，2
（1.中牧實(shí)業(yè)股份有限公司農(nóng)業(yè)部獸用生物制品與化藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室北京市獸用多肽疫苗設(shè)計(jì)與制備工程技術(shù)中心，北京豐臺(tái)100070；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京海淀100193）

摘要：根據(jù)牛口蹄疫O型3個(gè)拓?fù)湫蚔P1序列設(shè)計(jì)3條合成肽，以此為包被抗原建立牛口蹄疫O型合成肽VP1結(jié)構(gòu)蛋白ELISA抗體檢測(cè)方法，并對(duì)該方法敏感性、特異性和重復(fù)性進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，該方法敏感性為96.7%，特異性為99.1%，批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為2.1%～9.8%和3.5%～10.7%。與2種商品化試劑盒比較，符合率分別為93.5%和85.9%。結(jié)果表明，該方法敏感性好、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性高，可用于?？谔阋逴型抗體水平檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：牛；口蹄疫；合成肽；ELISA

肖進(jìn)（1978-），男，博士生，工程師，從事合成肽疫苗及診斷試劑研發(fā)工作，E-mail：xjpeptide@126.com

注：肖進(jìn)與張蕾對(duì)本文具有同等貢獻(xiàn)

（1.China Animal Husbandry Industry Co.Ltd.Ministry of Agriculture Key Laboratory of veterinary biologics and drugs；Veterinary peptide vaccine design and preparation of engineering and technology center of Beijing，Beijing 100070，China；

2.College of Veterinary medicine，China Agricultural University，Beijing 100193，China）

口蹄疫（FMD）是由FMDV引起偶蹄動(dòng)物的烈性傳染病，該病毒傳播途徑多、傳染性強(qiáng)，嚴(yán)重危害畜牧業(yè)發(fā)展及畜產(chǎn)品生產(chǎn)供應(yīng)，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）在1984年將口蹄疫列為A類傳染病之首。FMDV有A、O、C、SAT I、SAT II、SAT及Asia 1七個(gè)血清型，每個(gè)型又分為若干個(gè)亞型，型及亞型間無(wú)交叉保護(hù)［1］。FMDV衣殼含有VP1、VP2、VP3和VP4共4種結(jié)構(gòu)蛋白，其中VP1暴露于病毒顆粒表面，能誘導(dǎo)感染動(dòng)物產(chǎn)生中和抗體，在分子流行病學(xué)調(diào)查、血清型分析等方面具有較重要學(xué)術(shù)價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義［2］。由于口蹄疫病毒近些年流行毒的突變發(fā)生頻率越來(lái)越高，而市售試劑盒僅能涵蓋較少毒株，因而已經(jīng)不能滿足對(duì)現(xiàn)有毒株的檢出率，為了克服這一缺陷，本試驗(yàn)針對(duì)口蹄疫O型3個(gè)拓?fù)湫停–ATHAY、ME-SA型和SEA型），采用生物信息學(xué)方法對(duì)VP1序列進(jìn)行精確分析，篩選出3條肽，制備出更新更全的包被抗原，建立了?？谔阋逴型合成肽VP1結(jié)構(gòu)蛋白ELISA抗體檢測(cè)方法，為進(jìn)一步研發(fā)?？谔阋逴型合成肽VP1結(jié)構(gòu)蛋白ELISA抗體檢測(cè)試劑盒奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1包被抗原分別為來(lái)自CATHAY、ME-SA和SEA三個(gè)拓?fù)湫蚔P1結(jié)構(gòu)蛋白的表位（位于氨基酸140～160區(qū)域），由中牧實(shí)業(yè)股份有限公司研究院合成并純化。

1.2主要試劑兔抗牛IgG酶標(biāo)二抗，購(gòu)自Sigma公司；其他試劑，購(gòu)自Amresco公司；牛、羊口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷試劑盒，購(gòu)自上海優(yōu)耐特生物醫(yī)藥公司（UBI）；口蹄疫O型液相阻斷ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所（LVRI）。

1.3血清牛口蹄疫O型陰、陽(yáng)性對(duì)照血清由本公司制備；100份?？谔阋逴型病毒感染牛血清，50份?？谔阋逴型疫苗免疫血清，100份健康牛血清（口蹄疫抗體為陰性），276份牛臨床血清由蘭州生物藥廠提供；牛口蹄疫亞洲1型陽(yáng)性血清和?？谔阋逜型陽(yáng)性血清各5份，由本公司制備。

1.4最佳抗原包被濃度和血清稀釋度的確定

采取方陣滴定方法，用包被液將合成肽包被抗原分別作8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625 μg/mL/肽，倍比稀釋；將陽(yáng)、陰性血清從1∶10、1∶20稀釋至1∶320，比較P/N值（P：陽(yáng)性對(duì)照孔OD450值；N：陰性對(duì)照孔OD450值），以P/N值最大的孔所對(duì)應(yīng)的抗原包被濃度和血清稀釋度為最佳抗原包被濃度和血清稀釋度。

1.5最佳封閉條件的確定分別用含0.2%、1% BSA、0.5%和5%脫脂奶粉的0.01%Tween-20 PBS （0.01 mol/L，pH值7.2）作為封閉液，進(jìn)行ELISA檢測(cè)，比較P/N值，以P/N值最大孔對(duì)應(yīng)封閉液配方作為最佳封閉液。

1.6底物反應(yīng)時(shí)間的確定分別置37℃孵育10、15 min及20 min，比較P/N值，以確定底物最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.7臨界值的確定對(duì)100份健康牛血清進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)健康動(dòng)物血清樣本OD450平均值（X）加上3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差（SD）得出試劑盒臨界值。

1.8敏感性試驗(yàn)對(duì)100份感染牛血清和50份免疫牛血清進(jìn)行檢測(cè)。

1.9特異性試驗(yàn)對(duì)100份健康牛血清、?？谔阋邅喼?型陽(yáng)性血清、?？谔阋逜型陽(yáng)性血清各5份分別進(jìn)行檢測(cè)。

1.10重復(fù)性試驗(yàn)用同一批次包被酶標(biāo)反應(yīng)板和相應(yīng)試劑，分別檢測(cè)已知背景15份血清樣本，其中陰性、強(qiáng)陽(yáng)性和弱陽(yáng)性血清各5份，計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)。用3批包被酶標(biāo)反應(yīng)板和相應(yīng)試劑，分別檢測(cè)已知背景15份血清樣本，計(jì)算批間變異系數(shù)。

1.11比對(duì)試驗(yàn)對(duì)276份臨床血清分別用本方法、UBI和LVRI試劑盒進(jìn)行比對(duì)試驗(yàn)。

2　結(jié)果與分析

2.1最佳抗原包被濃度和血清稀釋度的確定結(jié)果顯示（表1）抗原最佳包被濃度為0.5 μg/mL/肽，血清最佳稀釋度為1∶20。

表1　方陣滴定結(jié)果（P/N比值）

2.2最佳封閉條件的確定結(jié)果顯示（圖1）含有1%BSA、0.01%Tween-20的PBS封閉效果最好。

圖1　封閉液的確定

2.3待檢血清最佳反應(yīng)時(shí)間的確定結(jié)果顯示（圖2），加入待檢血清反應(yīng)60 min后，P/N值最高。

2.4臨界值的確定所測(cè)得100份健康牛血清平均OD450值（X）為0.141，標(biāo)準(zhǔn)方差（SD）值為0.041，X+3SD=0.264。≥0.264判為陽(yáng)性；＜0.264判為陰性。利用該Cut-off值判定這100份健康牛血清，僅有2份血清為陽(yáng)性，因而確定的臨界值可靠。

2.5敏感性試驗(yàn)本方法對(duì)100份感染牛血清和50份免疫血清進(jìn)行檢測(cè)（見(jiàn)表2），其中145份血清為陽(yáng)性，5份血清為陰性，敏感性為96.7%。

圖2　血清反應(yīng)時(shí)間的確定

表2　試劑盒敏感性和特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.6特異性試驗(yàn)本方法對(duì)100份健康牛血清檢測(cè)僅有1份為陽(yáng)性，對(duì)牛亞洲1型陽(yáng)性血清和牛A型陽(yáng)性血清均為陰性（表3），特異性為99.1%（109/110）。

表3　試劑盒重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.7重復(fù)性試驗(yàn)批內(nèi)重復(fù)性結(jié)果顯示，批內(nèi)變異系數(shù)在2.1%～9.8%之間。批間重復(fù)性結(jié)果顯示，批間變異系數(shù)在3.5%～10.7%之間，表明該試劑盒重復(fù)性較好。

2.8比對(duì)試驗(yàn)對(duì)276份臨床血清進(jìn)行檢測(cè)，本方法陽(yáng)性檢出率為37.0%。UBI試劑盒陽(yáng)性檢出率為36.2%。兩者共有258份血清檢測(cè)結(jié)果一致，符合率為93.5%。LVRI試劑盒陽(yáng)性檢出率為40.2%。兩者總共有237份血清檢測(cè)結(jié)果一致，符合率為85.9%。

表4　與其他試劑盒比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果

3　討論

目前OIE公布的口蹄疫感染和疫苗免疫后抗體檢測(cè)的血清學(xué)檢測(cè)方法有3種：液相阻斷ELISA、病毒中和試驗(yàn)、固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA。其中以病毒中和試驗(yàn)最為經(jīng)典，是評(píng)價(jià)疫苗效果和檢驗(yàn)其他方法的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但操作繁瑣，且涉及活病毒，對(duì)實(shí)驗(yàn)室生物安全和操作人員要求較高。液相阻斷ELISA目前是大多數(shù)國(guó)家廣泛使用的方法，然該方法需對(duì)血清作至少4個(gè)稀釋度，每塊板最多檢測(cè)20份血清，且操作繁瑣。本試驗(yàn)建立的方法操作簡(jiǎn)便適合大批量檢驗(yàn)，包被抗原為合成肽，無(wú)需接觸和使用病毒，無(wú)生物安全隱患。其次合成肽是FMDV外殼蛋白VP1抗原決定簇序列，與相應(yīng)抗體的結(jié)合力強(qiáng)，決定了本方法檢測(cè)的敏感性。并且合成肽是短肽，與其他非特異性抗體的交叉反應(yīng)性較低［3］，因此該方法在高效、特異、快捷及生物安全性上實(shí)現(xiàn)了較完美的結(jié)合。試驗(yàn)結(jié)果證明，該方法敏感性高、特異性好、重復(fù)性好，符合市場(chǎng)要求，可用于牛口蹄疫病毒O型抗體檢測(cè)，為進(jìn)一步研發(fā)相應(yīng)試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

［1］Alexandersen S，Zhang Z，Donaldson A I，et al.The pathogenesis and diagnosis of foot-and-mouth disease［J］.J Comp Pathol，2003，129 （1）：1-36.

［2］Acharya R，F(xiàn)ry E，Stuart D，et al . The three-dimensional structure of foot-and-mouth disease virus at 2.9 A resolution［J］. Nature，1989，337（6209）：709-716.

［3］Wang C Y，Chang T Y，Walfield A M，et al.Effective syntheticpeptide vaccine for foot and mouth disease in swine［J］. Vaccine，2002：2603 -2610.

Development of an ELISA based on synthetic peptidefor detection of cattlefoot- and- mouth diseasevirus type O VP1 antibody

ZHANG Lei1，XIAO Jin1，2，DONG Chun-na1，BA Li-min1，LI Li-fang1，SONG Fang1，WANG Nan1，ZHOU Qiang1，QI Peng1，WANG Ming1，2

Key words：cattle；FMDV；synthetic peptide；ELISA

Abstract：Three synthetic peptides of FMDV VP1 were used to detect antibody of FMDV type O.The ELISA system was optimized and the sensitivity，specificity and repeatability of this method were tested.The results showed that the sensitivity and specificity were 96.0%and 99.1%，and variations of intra-and inter-assay repeatability were 2.1%～9.8%and 3.5%～10.7%.Comparing this method with 2 test kits showed a coincidence rate of 93.5%and 85.7%.The results show that this method has high sensitivity and specificity，and is stable，which can be used to monitor VP1 antibody.

中圖分類號(hào)：S858.23

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0529- 6005（2016）03- 0022- 03

收稿日期：2014-12-26

作者簡(jiǎn)介：張蕾（1984-），女，獸醫(yī)師，博士，從事動(dòng)物免疫學(xué)研究，E-mail：zhanglei1984cau@163.com

通訊作者：齊鵬，E-mail：cahic_ivd@vip.tom.com

Corresponding author：QI Peng