劉彩容陳克芳黃啟輝

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從PI3k/Akt通路研究山茱萸對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用機(jī)制*

劉彩容①陳克芳②黃啟輝②

【摘要】目的：了解山茱萸對(duì)大鼠心肌缺血再灌注的保護(hù)作用機(jī)制。方法：選取84只雄性Wistar大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法分三組，分別為對(duì)照組、缺血再灌注組（I/R組）和治療組，每組28只。采用結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支法制備大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，對(duì)照組在左冠狀動(dòng)脈前降支處僅穿線不結(jié)扎，I/R組在再灌注前5 min時(shí)尾靜脈注射0.9%氯化鈉注射液1 mL，治療組在再灌注前5 min時(shí)尾靜脈注射山茱萸藥液1 mL，觀察記錄各組大鼠心肌缺血情況和心電圖信息。結(jié)果：與對(duì)照組比較，I/R組及治療組大鼠FS和EF均降低，LVDd、LVESV、LVEDV均上升；與I/R組比較，治療組FS和EF均上升，LVDd、LVESV、LVEDV均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：山茱萸及其有效成分通過(guò)PI3K/Akt通路，對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷保護(hù)機(jī)制的實(shí)現(xiàn)起到了十分重要的作用。

【關(guān)鍵詞】山茱萸； 心肌缺血； 再灌注損傷； PI3k/Akt通路

①?gòu)V州市白云區(qū)第三人民醫(yī)院 廣東 廣州 510000

②中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院

First-author’s address：The Third People’s Hospital of Baiyun，Guangzhou 510000，China

心肌缺血再灌注損傷（MIRI）對(duì)于人體健康的恢復(fù)以及相關(guān)治療活動(dòng)的開展有著極大的阻礙作用，相關(guān)醫(yī)療機(jī)構(gòu)必須加強(qiáng)對(duì)其的重視，積極的采取措施對(duì)其進(jìn)行研究，從而最大程度的避免心肌缺血再灌注損傷的產(chǎn)生。本文就以PI3k/Akt通路研究為基礎(chǔ)對(duì)山茱萸對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用機(jī)制進(jìn)行分析與探討。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 選擇24～25周齡的84只雄性Wistar大鼠為研究對(duì)象，體重均220～250 g，本次實(shí)驗(yàn)大鼠的提供機(jī)構(gòu)均為中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將84只雄性Wistar大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組，缺血再灌注組（I/R組）以及治療組，每組各為28只。

1.2方法

1.2.1心肌缺血再灌注損傷模型制備方法 在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前所有大鼠均采取禁食處理，禁食時(shí)間為8 h左右，期間保障自由飲水［1］。實(shí)驗(yàn)時(shí)以20%的氨基甲酸乙醋對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉［2］，仰臥位固定大鼠四肢，并于四肢皮下插入心電儀電極，對(duì)大鼠心電圖的信息進(jìn)行觀察與記錄。同時(shí)對(duì)大鼠進(jìn)行氣管插管手術(shù)，切開頸部氣管，插入導(dǎo)管后進(jìn)行固定，導(dǎo)管對(duì)連接動(dòng)物呼吸機(jī)，通氣量8 mL/kg［3］。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)大鼠的正常呼吸進(jìn)行維護(hù)，呼吸頻率控制在60～70次/min即可。暴露大鼠心臟，即在心臟脈動(dòng)最明顯的部位打開胸腔，剪開心包，繼而讓心臟完成暴露［4］。選擇左冠狀靜脈為標(biāo)志物進(jìn)行縫合，縫合針的型號(hào)為7-0無(wú)創(chuàng)代針，縫合位置為左心耳根部下方2 mm處，在進(jìn)行縫合處理時(shí)要對(duì)大鼠的心電圖進(jìn)行密切關(guān)注，當(dāng)心電圖保持穩(wěn)定10 min后再對(duì)左冠狀動(dòng)脈降支進(jìn)行活結(jié)結(jié)扎，從而造成心肌缺血［5］。缺血的判定標(biāo)準(zhǔn)為前降支動(dòng)脈供血區(qū)呈現(xiàn)出蒼白色或者青紫色，心電圖ST-T融合表現(xiàn)為太高狀態(tài)。大鼠被缺血30 min后，松開線繩進(jìn)行冠脈行再灌注，時(shí)間為2 h，完成心肌缺血再灌注損傷模型。對(duì)照組在左冠狀動(dòng)脈前降支處進(jìn)行穿線，不結(jié)扎；I/R組在再灌注前5 min時(shí)尾靜脈注射0.9%氯化鈉注射液1 mL；治療組在再灌注前5 min時(shí)尾靜脈注射山茱萸藥液1 mL。

1.2.2中藥給藥量的確定 本次實(shí)驗(yàn)中大鼠山茱萸的給藥量遵循中藥藥理實(shí)驗(yàn)的相關(guān)指導(dǎo)，大鼠的低等用藥量一般情況下均為單位體重人用藥量的10倍，中等用藥量為單位體重人用藥量的20倍，高等用藥量為單位體重人用藥量的40倍，本次研究中的山茱萸多糖及總苷的人用藥量即在此基礎(chǔ)上結(jié)合中藥提純率相應(yīng)計(jì)算得出［6］。

1.2.3大鼠血清CK-MB和LDH的測(cè)定方法 再灌注2 h后，采集大鼠腹部動(dòng)脈血3 mL，所采集的血樣在4 ℃、4000 r/min下離心10 min，取上清液進(jìn)行分裝，-80 ℃下保存。運(yùn)用ELISA法對(duì)血清CK-MB以及LDH活性進(jìn)行測(cè)定，為下一步研究的進(jìn)行提供依據(jù)［7］。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，大鼠心機(jī)缺血及梗死面積百分率以［±D（x）］形式表示，計(jì)量資料以（±s）形式表示，行t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠心肌梗死面積比較 三組大鼠心肌I/R后的缺血區(qū)面積比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與對(duì)照組比較，I/R組和治療組大鼠心肌梗死區(qū)面積均有所增加，治療組梗死區(qū)面積低于I/R組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1　各組大鼠心肌梗死面積比較［±D（x）］ %

表1　各組大鼠心肌梗死面積比較［±D（x）］ %

組別　缺血區(qū)面積　梗死區(qū)面積對(duì)照組（n=28）　45.65±2.34　26.80±4.76治療組（n=28）　46.23±1.89　43.54±2.38 I/R組（n=28）　47.22±2.65　45.66±2.87

2.2各組大鼠心肌I/R后心功能比較 與對(duì)照組比較，I/R組及治療組大鼠FS和EF均降低，LVDd、LVESV、LVEDV均上升，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與I/R組比較，治療組FS和EF均上升，LVDd、LVESV、LVEDV均下降，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2　各組大鼠I/R后超聲心動(dòng)圖結(jié)果比較（±s）/［±D（x）］

表2　各組大鼠I/R后超聲心動(dòng)圖結(jié)果比較（±s）/［±D（x）］

組別　LVDd（mm）　LVESV（mm）　LVEDV（mm）　FS（%）　EF（%）對(duì)照組（n=28）　5.45±0.18　0.04±0.11　0.30±0.03　58.8±1.42　91.8±1.11治療組（n=28）　5.96±0.43　0.13±0.03　0.45±0.04　41.3±1.45　85.6±5.32 I/R組（n=28）　6.64±0.26　0.20±0.04　0.60±0.04　21.3±1.95　64.5±4.41

3　討論

心肌缺血再灌注損傷是指患者出現(xiàn)心機(jī)缺血的狀況后，心肌血流得到恢復(fù)，使得心機(jī)結(jié)構(gòu)，以及組織受到一定損害的現(xiàn)象。心肌缺血灌注損傷可能誘發(fā)患者出現(xiàn)心肌梗死，或者梗死面積擴(kuò)大等不可逆損傷，這對(duì)于患者的健康與治療造成嚴(yán)重影響。因此，和其他心血管類疾病相比，心肌缺血再灌注損傷的病死率更高，相關(guān)醫(yī)療機(jī)構(gòu)必須加強(qiáng)對(duì)心肌缺血再灌注損傷的重視［8-9］。心肌缺血灌注損傷之所以會(huì)發(fā)生，主要是因?yàn)樵谛募∪毖獱顩r下，患者體內(nèi)所含有的氧自由基的數(shù)量在一定程度上被提升，并且細(xì)胞內(nèi)鈣含量也呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。此外，在心肌缺血的前提下，白細(xì)胞被激活的幾率被提升，釋放大量促炎細(xì)胞因子，進(jìn)而增加血管的通透性。此外，過(guò)多的白細(xì)胞被激活，使得組織受到進(jìn)一步損傷。動(dòng)物以及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，中藥復(fù)方制劑以及中藥提取物在緩解心肌缺血灌注損傷方面效果顯著，這是因?yàn)橹兴幪崛∥锘蛑兴帍?fù)方制劑會(huì)對(duì)MIRI的多種因素造成影響，進(jìn)而使得心肌細(xì)胞的存活率被提升，從而對(duì)缺血再灌注心肌進(jìn)行保護(hù)。

本文研究結(jié)果顯示，I/R后的心功能方面，與對(duì)照組比較，I/R組與治療組大鼠的FS和EF均降低，LVDd、LVESV、LVEDV均上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與I/R組比較，治療組FS和EF均上升，LVDd、LVESV、LVEDV均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這主要?dú)w咎于缺血再灌注損傷補(bǔ)救激酶信號(hào)通路，它主要由PI3K-蛋白激酶B以及ERK1/2組成，其中，PI3K-蛋白激酶B就是我們常說(shuō)的Akt。相關(guān)研究證明，PI3K/Akt通路對(duì)于再灌注損傷保護(hù)作用的發(fā)揮有著極為重要的作用，主要體現(xiàn)在以下方面：首先，PI3K/Akt能夠阻止線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，促進(jìn)肌漿網(wǎng)實(shí)現(xiàn)對(duì)Ca2+的獲取。同時(shí)，PI3K/Akt通路的建立也能夠促進(jìn)抗細(xì)胞凋亡途徑的恢復(fù)［10-11］。PI3K主要存在于細(xì)胞膜上，Akt通過(guò)PI3K的產(chǎn)物接觸細(xì)胞膜上的磷酸后呈現(xiàn)為被激活的狀態(tài)。在PI3K/Akt被激活的狀態(tài)下，實(shí)現(xiàn)向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)，并和相關(guān)部位的底物蛋白產(chǎn)生反應(yīng)，進(jìn)而把底物蛋白特定部位結(jié)構(gòu)磷酸化，這主要是因?yàn)楸涣蛩峄奈镔|(zhì)有蘇氨酸以及特定部位的絲。被激活的Akt同時(shí)能夠讓細(xì)胞核，以及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的多種底物被磷酸化［12-13］。譬如，ENOS被磷酸化后會(huì)生成內(nèi)源性的NO，這種NO能夠使得S6激酶呈現(xiàn)被激活狀態(tài)。又譬如，糖原被磷酸化后會(huì)促進(jìn)激酶-3β的合成。此外，磷酸化過(guò)程的進(jìn)行也能夠促進(jìn)相關(guān)基因的表達(dá)以及糖原代謝等，這些活動(dòng)能夠加強(qiáng)K+通道的開放，進(jìn)而保護(hù)缺血再灌注損傷心肌。因此，Akt常常扮演的角色為網(wǎng)絡(luò)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)器。相關(guān)學(xué)者研究還表明，被磷酸化的GSK-3β，能夠降低線粒體外膜腺甘酸轉(zhuǎn)移速度，進(jìn)而調(diào)節(jié)VDAC磷酸化水平，抑制MPTP開放過(guò)程［14-15］。同時(shí)，PI3K/Akt能夠保護(hù)線粒體功能，進(jìn)而減輕患者心肌缺血再灌注損傷。

相關(guān)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，山茱萸的有效的化學(xué)成分主要為苷類、多糖體以及有機(jī)酸等，在服用之后能夠清除自由基，對(duì)興奮作用進(jìn)行免疫［16-18］。山茱萸多糖對(duì)于免疫低下的小鼠，在細(xì)胞免疫功能以及體液免疫促進(jìn)方面作用明顯。同時(shí)，山茱萸總苷具有較為明顯的殺菌和抗炎效果。研究發(fā)現(xiàn)：山茱萸能夠使大鼠心肌梗死面積呈現(xiàn)減小趨勢(shì)，改善其心功能。山茱萸能夠保護(hù)大鼠心肌，是因?yàn)槠淠軌蛞种蒲仔越橘|(zhì)釋放，并改善心肌細(xì)胞鈣超載狀況。此外，山茱萸也能夠發(fā)揮線粒體功能，在心肌細(xì)胞凋亡抑制方面也存在一定的優(yōu)勢(shì)［19-20］。相關(guān)人員發(fā)現(xiàn)，山茱萸多糖和總苷在抑制心肌細(xì)胞凋亡機(jī)制方面有所差異，山茱萸多糖通過(guò)細(xì)胞膜受體信號(hào)通路，而山茱萸總苷則通過(guò)線粒體通路抑制細(xì)胞凋亡。

綜上所述，傳統(tǒng)中藥山茱萸及其有效成分通過(guò)PI3K/Akt通路，作用于線粒體ATP依賴性鉀通道，改善線粒體功能、減少細(xì)胞凋亡，具有十分重要的臨床意義。

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Study on Mechanism of Action of Cornus Officinalis for Rats with Myocardial Ischemia-reperfusion Injury

LIU Cai-rong，CHEN Ke-fang，HUANG Qi-hui.//Medical Innovation of China，2016，13（11）：024-027

【Abstract】Objective：To learn the protective mechanism of action of cornus officinalis for rats with myocardial ischemia-reperfusion injury.Method：Eighty-four male Wistar rats were divided into three groups according to the random number table，the control group，the ischemia-reperfusion group（I/R group） and the treatment group，twenty-eight rats in each group.The model of myocardial ischemia-reperfusion injury in rats was developed by ligaturing the left descending anterior coronary artery，the rats in the control group were only thread while rats in the I/R group were given 1 mL 0.9% sodium chloride injection through the tail vein before reperfusion and rats in treatment group were given 1 mL cornus officinalis injection through the tail vein.The myocardial ischemia and electrocardiograph information of all groups were observated and recorded.Result：Compared with the control group，F(xiàn)S and EF of the rats in I/R group and treatment group were decreased，but LVDd，LVESV and LVEDV were increased，while compared with the I/R group，F(xiàn)S and EF of the rats in treatment group were increased，but LVDd，LVESV，LVEDV were decreased，the differences were all statistically significant （P＜0.05）.Conclusion：Cornus officinalis may play a very important role for realizing the protective mechanism in rats with myocardial ischemia-reperfusion injury through PI3k/Akt pathway.

【Key words】Cornus officinalis； Myocardial ischemia； Ischemia-reperfusion injury； PI3k/Akt pathway

*基金項(xiàng)目：廣東省中醫(yī)藥局科研課題（20151174）

通信作者：劉彩容

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.11.007

收稿日期：（2015-12-07） （本文編輯：劉蕾）