趙　芳　王曉群　劉　曉　劉艷麗　劉慶陽(yáng)　徐凱智

華北理工大學(xué)附屬唐山工人醫(yī)院麻醉科　河北唐山　063000；①北京煤炭總醫(yī)院

丙泊酚對(duì)脂多糖誘導(dǎo)小鼠腎小球系膜細(xì)胞的影響

趙芳王曉群劉曉劉艷麗劉慶陽(yáng)①徐凱智

華北理工大學(xué)附屬唐山工人醫(yī)院麻醉科河北唐山063000；①北京煤炭總醫(yī)院

[摘要]①目的探討丙泊酚對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖、凋亡及一氧化氮(NO)分泌量的影響。②方法體外培養(yǎng)小鼠腎小球系膜細(xì)胞(SV40MES13)均勻接種在48孔板上，將細(xì)胞分為5組，即空白對(duì)照組、脂多糖組(10μg/mL)和脂丙1組(脂多糖10μg/mL+丙泊酚 5μg/mL)、脂丙2組(脂多糖10μg/mL+丙泊酚10μg/mL)、脂丙3組(脂多糖10μg/mL+丙泊酚20μg/mL)，每組各設(shè)5個(gè)復(fù)孔。按照以上分組添加刺激后繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況并照相，再分別檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量及細(xì)胞的增殖、凋亡情況。③結(jié)果與空白對(duì)照組比較，脂多糖組細(xì)胞數(shù)量明顯增多、凋亡率降低并且NO分泌明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與脂多糖組比較，脂丙2組和脂丙3組細(xì)胞增殖均明顯減輕、NO分泌量均減少，并且細(xì)胞凋亡率均有所升高，而脂丙1組與脂多糖組比較變化不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。④結(jié)論大劑量的丙泊酚能夠抑制脂多糖引起的小鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖及NO分泌增加，并誘導(dǎo)其凋亡，對(duì)腎臟起到保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞]丙泊酚腎小球系膜細(xì)胞脂多糖細(xì)胞增殖凋亡一氧化氮

膿毒癥是伴隨感染而出現(xiàn)的全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，常繼發(fā)于嚴(yán)重感染、大面積燒傷、創(chuàng)傷及大手術(shù)嚴(yán)重應(yīng)激等，進(jìn)一步發(fā)展可引起多器官功能障礙綜合征(MODS)，甚至危及生命。膿毒癥病情兇險(xiǎn)，病死率較高，腎臟是最易受到膿毒癥影響的靶器官之一。膿毒癥一旦并發(fā)急性腎功能衰竭，病死率可高達(dá)70%[1]。因此，及時(shí)防治急性腎功能損傷對(duì)于預(yù)防多器官功能衰竭、降低病死率十分重要。膿毒癥患者器官損傷時(shí)會(huì)產(chǎn)生焦慮、煩躁，所以在臨床治療的過(guò)程中，給予適當(dāng)?shù)逆?zhèn)靜很有必要。丙泊酚是一種臨床上常用的靜脈麻醉藥，有報(bào)道稱其除了具有鎮(zhèn)靜作用外，還能抑制自由基的生成以及調(diào)節(jié)炎癥因子的釋放，具有抗炎、抗氧化的作用，能有效緩解膿毒癥患者的過(guò)度炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)[2]。近年來(lái)，丙泊酚對(duì)于器官保護(hù)作用的研究受到越來(lái)越多的關(guān)注，有研究發(fā)現(xiàn)[3]，丙泊酚可對(duì)缺血再灌注引起的腎損傷起到保護(hù)作用，但尚無(wú)直接文獻(xiàn)報(bào)道其對(duì)脂多糖引起的腎臟炎癥是否有影響。因此，本實(shí)驗(yàn)主要探討丙泊酚對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠腎小球系膜細(xì)胞的影響，從而為丙泊酚應(yīng)用于防治膿毒癥提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞小鼠腎小球系膜細(xì)胞(SV40MES13)購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物和試劑脂多糖(LPS，美國(guó)Sigma公司)；DMEM高糖(4.5g/L)培養(yǎng)基(Hyclone 公司)；胎牛血清(FBS)和含EDTA胰蛋白酶(中國(guó)北京索來(lái)寶生物科技有限公司)；7-AAD(美國(guó)ebioscience公司)；MTT試劑盒和一氧化氮檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；實(shí)驗(yàn)所用丙泊酚購(gòu)于阿斯利康醫(yī)藥公司，批號(hào)為40117，溶解在DMSO中，使DMSO的最終濃度在0.0025%～0.0125%之間(根據(jù)參考文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出DMSO濃度在低于0.05%時(shí)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不造成影響)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1小鼠腎小球系膜細(xì)胞的培養(yǎng)。細(xì)胞完全培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基(含4.5g/L葡萄糖)，加入青鏈霉素混合液(青霉素的工作濃度為100U/mL，鏈霉素的工作濃度為0.1g/L)。將細(xì)胞放入溫度為37℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)到80%匯合狀態(tài)時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代，細(xì)胞傳至3～5代時(shí)供以下實(shí)驗(yàn)研究用。

1.3.2實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)。待培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，消化收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液的濃度為1×105個(gè)/mL均勻接種于48孔板，每孔加入200μL細(xì)胞懸液，過(guò)夜培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，更換含0.5%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞處于靜止期。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、脂多糖組(10μg/ml)和脂丙1組(脂多糖10μg/mL+丙泊酚5μg/mL)，脂丙2組(脂多糖10μg/mL+丙泊酚10μg/mL)，脂丙3組(脂多糖10μg/mL+丙泊酚20μg/mL)，每組各設(shè)5個(gè)復(fù)孔。正常對(duì)照組不加任何藥物，脂多糖組加入脂多糖保證其終濃度為10μg/mL，脂丙1、2、3組均先加脂多糖，使其終濃度為10μg/mL，1小時(shí)后再加入適宜劑量的丙泊酚，使其終濃度分別為5、10、20μg/mL。細(xì)胞按照分組處理好后，分別做好標(biāo)記放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。

1.3.3倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。取出培養(yǎng)48小時(shí)后的細(xì)胞，置于倒置顯微鏡下，觀察細(xì)胞的數(shù)量及形態(tài)，并照相保存。

1.3.4MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。預(yù)先配置好5mg/mL的MTT溶液，取出培養(yǎng)48小時(shí)后的細(xì)胞板，棄去各孔培養(yǎng)基，再分別加入100μL DMEM高糖培養(yǎng)基及10μL MTT溶液，繼續(xù)孵育4小時(shí)。再向所有孔中加入100μL Formanzan溶解液，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱再繼續(xù)孵育。直至在光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Formanzan全部溶解即可。調(diào)零孔只加入100μL DMEM高糖培養(yǎng)基。用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔的吸光度OD值。

1.3.5ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量。取出培養(yǎng)48小時(shí)后的細(xì)胞，收集各孔細(xì)胞培養(yǎng)液，以3000rpm/min，離心5分鐘，吸取上清。按50μL/孔，在96孔板中加入標(biāo)準(zhǔn)品及各組培養(yǎng)基上清，標(biāo)準(zhǔn)品用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋。先后向各孔中加入50μL室溫Griess Reagent I溶液和50μL室溫Griess Reagent II溶液，吹打均勻。避光靜置2分鐘，于540nm處測(cè)定吸光度OD值。繪制生長(zhǎng)曲線，計(jì)算NO濃度。

1.3.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。取出培養(yǎng)48小時(shí)后的細(xì)胞，按7-AAD試劑說(shuō)明書要求，收集各孔中的細(xì)胞，用PBS漂洗2次，加入一定量緩沖液，使細(xì)胞濃度為106個(gè)/mL，取100μL細(xì)胞懸液于流式上樣管中，加入7-AAD 試劑2μL，混勻，于4℃避光靜置5分鐘后采用流式細(xì)胞儀(BD Calibur，美國(guó)BD公司)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的百分率，認(rèn)定7-AAD陽(yáng)性為凋亡細(xì)胞。

2結(jié)果

2.1倒置相差顯微鏡下細(xì)胞生長(zhǎng)情況細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后，即可見細(xì)胞的數(shù)量及形態(tài)均發(fā)生改變，見圖1。與空白對(duì)照組比較，脂多糖組細(xì)胞明顯增多，并且細(xì)胞由不規(guī)則形狀變成圓形或橢圓形；與脂多糖組比較，脂丙1、2、3組的細(xì)胞數(shù)量均明顯減少，并且部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡，還有部分細(xì)胞脫壁懸浮。

A:空白對(duì)照組　B:脂多糖組　C：脂丙1組　D：脂丙2組　E：脂丙3組

2.2各處理組腎小球系膜細(xì)胞增生情況的比較與空白對(duì)照組比較，脂多糖組細(xì)胞顯著增加(P<0.05)；與脂多糖組比較，脂丙2組和脂丙3組細(xì)胞的數(shù)量均減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而脂丙1組細(xì)胞數(shù)量與脂多糖組比較無(wú)明顯差異(P>0.05),見表1。

表1　各組小鼠腎小球系膜細(xì)胞增生、凋亡、NO分泌量比較±s，n=6)

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與脂多糖組比較，#P<0.05

2.3各處理組腎小球系膜細(xì)胞NO分泌量的比較與空白對(duì)照組比較，脂多糖組細(xì)胞NO分泌量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與脂多糖組比較，脂丙2組和脂丙3組細(xì)胞的NO分泌量均明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而脂丙1組細(xì)胞NO分泌量與脂多糖組無(wú)明顯差異(P>0.05),見表1。

2.4各處理組腎小球系膜細(xì)胞凋亡率比較與空白對(duì)照組比較，脂多糖組細(xì)胞凋亡率明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與脂多糖組比較，脂丙2組和脂丙3組細(xì)胞的凋亡率有所回升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而脂丙1組細(xì)胞的凋亡率與脂多糖組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

3討論

膿毒癥是一種發(fā)展不可控的全身炎癥反應(yīng)綜合征，多繼發(fā)于嚴(yán)重感染、大面積燒傷、創(chuàng)傷及大手術(shù)嚴(yán)重應(yīng)激等。膿毒癥發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，同時(shí)存在多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑[4]，目前尚無(wú)報(bào)道對(duì)其進(jìn)行明確闡述。研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥常常會(huì)引起不同程度的腎功能損害，而腎功能異常反過(guò)來(lái)又會(huì)促進(jìn)膿毒癥的進(jìn)展與惡化。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在ICU 中大約有35%～50%的急性腎損傷(AKI) 是由膿毒癥引起的[5],并且當(dāng)膿毒癥合并AKI時(shí)，臨床治療難度提高，患者病死率明顯增加。所以，如果能早期發(fā)現(xiàn)并及時(shí)治療膿毒癥導(dǎo)致的AKI，可防止腎臟不可逆性功能損害，最終能夠改善預(yù)后及降低病死率。

腎小球系膜細(xì)胞是腎小球固有細(xì)胞中反應(yīng)最為活躍的一種細(xì)胞[6]，具有吞噬功能，并可產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)和多種細(xì)胞因子。正常情況下，系膜細(xì)胞不會(huì)發(fā)生明顯的增殖，而在炎癥等病理情況刺激下，系膜細(xì)胞會(huì)大量增生并分泌更多的細(xì)胞因子以及產(chǎn)生更多的細(xì)胞外基質(zhì)，最終將導(dǎo)致腎小球硬化或腎衰竭，引起嚴(yán)重的腎功能障礙[7]。因此，有效的抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖能在很大程度上緩解腎功能損傷。脂多糖是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的組成成分，是典型的炎癥反應(yīng)誘發(fā)劑[8]，可誘導(dǎo)系膜細(xì)胞釋放一些細(xì)胞因子參與炎癥反應(yīng)，NO便是其中之一。本實(shí)驗(yàn)以10μg/mL濃度的脂多糖刺激小鼠腎小球系膜細(xì)胞來(lái)模擬膿毒癥早期的炎癥發(fā)應(yīng)，結(jié)果顯示脂多糖刺激后，腎小球系膜細(xì)胞發(fā)生大量增殖并且NO的分泌量顯著升高。說(shuō)明膿毒癥早期各種誘發(fā)因素如脂多糖等刺激腎臟腎小球系膜細(xì)胞，導(dǎo)致系膜細(xì)胞過(guò)度增殖從而產(chǎn)生更多的細(xì)胞外基質(zhì)及大量釋放NO等炎癥介質(zhì)是引起腎臟損害的主要原因之一。

近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)麻醉藥除了具有鎮(zhèn)靜作用外，還能調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)，其中最典型的是丙泊酚。其特有的結(jié)構(gòu)使其能抑制炎癥細(xì)胞增殖、聚集、活化及減輕炎癥因子的釋放從而達(dá)到抗炎的作用[2]。除此之外，大量研究證實(shí)丙泊酚還具有保護(hù)臟器的作用。有報(bào)道丙泊酚對(duì)心、肝、肺和腎等的缺血再灌注損傷都具有保護(hù)作用[9,10]。而關(guān)于丙泊酚對(duì)內(nèi)毒素所致臟器損傷的影響報(bào)道則相對(duì)較少，并且相關(guān)的研究報(bào)道主要涉及的是腎臟的功能細(xì)胞如腎小管上皮細(xì)胞，針對(duì)腎小球系膜細(xì)胞的研究則較少。因此，本實(shí)驗(yàn)用丙泊酚處理經(jīng)脂多糖刺激的腎小球系膜細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞的增殖、凋亡及NO分泌量的變化，來(lái)探討丙泊酚對(duì)腎小球系膜細(xì)胞的影響。本研究結(jié)果顯示，與脂多糖組比較，脂丙2組和脂丙3組的細(xì)胞呈現(xiàn)出相同的趨勢(shì)，即細(xì)胞增殖和NO分泌均明顯受到抑制，凋亡率升高，并且隨著丙泊酚濃度的升高，差異更加明顯；而脂丙1組與脂多糖組比較未表現(xiàn)出明顯差異。因此說(shuō)明，大劑量丙泊酚可明顯抑制脂多糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞過(guò)度增殖及NO大量分泌，并可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而在一定程度上減輕腎臟炎癥反應(yīng)及纖維化進(jìn)程，發(fā)揮保護(hù)腎臟的作用，并且隨著丙泊酚濃度的增加，保護(hù)作用更加明顯。

綜上所述，膿毒癥早期給予大劑量丙泊酚對(duì)于腎臟功能有顯著的保護(hù)作用，并且與濃度有一定的關(guān)聯(lián)性，其可能的機(jī)制是通過(guò)影響腎小球系膜細(xì)胞的增殖、凋亡以及調(diào)節(jié)NO分泌量等發(fā)揮作用，但仍需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究闡明其確切的機(jī)制和藥物的最佳濃度。

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(2016-01-26收稿)(張愛國(guó)編輯)

Effect of propofol on mouse glomerular mesangial cells induced by LPS

ZHAOFang，WANGXiaoqun,LIUXiao,etal

(Departmentofanesthesiology,TangshanGongrenHospitalAffiliatedtoNorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000，China)

[ABSTRACT]ObjectiveTo explore the effects of propofol on the cell proliferation,cell apoptosis and secretion of NO in mouse glomerular mesangial cells(GMCs) induced by lipopolysaccharide (LPS). MethodsThe GMCs (SV40MES13) were cultured in vitro and uniformly planted in a 48-well culture board. The GMCs were divided into five groups, including blank control group, LPS (10μg/mL) group and LPS (10μg/mL)+propofol (5, 10, 20μg/mL) groups. Each group was set 5 wells.After the corresponding stimulant were added respectively to cells in accordance with above grouping, the GMCs were cultured in cell incubator for 48 hours.Then the cell growth was inspected under the inverted microscope and photographed. After that the cell proliferation, apoptosis and the secretion of NO of GMCs were detected. ResultsCompared with the blank control group, the cells number and the NO secretion of LPS groups were significantly increased, and the cell apoptosis rate decreased(P<0.05).Compared with the LPS group, both the proliferation and expression of NO were decreased but the ratio of apoptosis of GMCs improved in LPS + propofol (10μg/mL) groups and LPS + propofol (20μg/mL) groups.The change in LPS + propofol (5μg/mL) groups was not obvious.ConclusionA massive dose of propofol can inhibit the proliferation and NO secretion of GMCs induced by LPS and promote the apoptosis and play a part in kidney protection.

[KEYWORDS]Propofol.Glomerular mesangial cells.Lipopolysaccharide.Cell proliferation.Cell apoptosis.NO

【作者簡(jiǎn)介】趙芳(1989-)，女，碩士研究生，醫(yī)師。研究方向：膿毒癥與器官保護(hù)。

【通訊作者】徐凱智。

[中圖分類號(hào)]R 631

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]2095-2694(2016)03-179-05