王曉群　趙　芳　徐凱智　劉慶陽

華北理工大學(xué)附屬唐山工人醫(yī)院麻醉科　河北唐山　063000；①北京煤炭總醫(yī)院

鹽酸右美托咪定對膿毒癥肝細(xì)胞損傷的保護作用

王曉群趙芳徐凱智劉慶陽①

華北理工大學(xué)附屬唐山工人醫(yī)院麻醉科河北唐山063000；①北京煤炭總醫(yī)院

[摘要]①目的通過體內(nèi)與體外實驗研究，探討右美托咪定(DEX)對膿毒癥肝細(xì)胞損傷的保護作用。②方法雄性C57BL/6小鼠80只。30只隨機分成5組：對照組(C組)、膿毒癥組(CLP組)，DEX低、中、高濃度組(D1、D2、D3)，每組6只。除C組外，各組小鼠進行盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)造模。D1、D2、D3組在造模后1小時分別腹腔注射DEX 30μg/kg、40μg/kg、50μg/kg。C組和CLP組注射等量無菌生理鹽水。5組均在造模后48小時處死小鼠。取肝組織進行細(xì)胞培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡觀察肝細(xì)胞生長情況，進行細(xì)胞增殖和凋亡分析。同時另取50只小鼠按上述分組及處理后進行生存率分析。建立肝細(xì)胞損傷模型：體外培養(yǎng)的NCTC 1469細(xì)胞，分5組，對照組(c組)、肝細(xì)胞損傷組(LPS刺激組)，DEX低、中、高濃度組(d1、d2、d3)。除c組外，每組加入LPS 100μg/mL，d1、d2、d3組按10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL劑量加注DEX，培養(yǎng)24小時后，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，進行細(xì)胞增殖率分析，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞上清液檢測白蛋白含量。③結(jié)果體內(nèi)實驗：D2、D3 組小鼠生存率明顯高于CLP組和D1 組(P<0.05)。在體實驗：各D組肝細(xì)胞培養(yǎng)的增殖細(xì)胞計數(shù)明顯多于CLP組，細(xì)胞凋亡率低于CLP組(P<0.05)，細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)良好。體外實驗：LPS刺激組細(xì)胞受損嚴(yán)重，細(xì)胞凋亡率較c組顯著增加;各d組細(xì)胞狀態(tài)較LPS刺激組明顯改善，白蛋白含量增加，但仍低于c組(P<0.05),與LPS組相比，d2、d3組細(xì)胞增殖率增加，凋亡率降低。④結(jié)論DEX對膿毒癥受損肝細(xì)胞起到保護作用，同時改善了膿毒癥小鼠的預(yù)后。

[關(guān)鍵詞]右美托咪定膿毒癥肝損傷細(xì)胞凋亡細(xì)胞增殖

膿毒癥是重癥監(jiān)護病房(ICU)患者死亡的主要原因之一[1,2]，目前流行的觀點認(rèn)為膿毒癥系嚴(yán)重的燒創(chuàng)傷、大手術(shù)后等誘發(fā)的全身炎癥反應(yīng)，進而導(dǎo)致多個器官受損；晚期可伴有免疫功能抑制和多器官功能衰竭。在膿毒癥中，肝臟對宿主防御和組織修復(fù)至關(guān)重要，早期肝功能障礙是膿毒癥死亡的一項獨立預(yù)警因素。

鹽酸右美托咪定(DEX)是一種高選擇性α2-腎上腺素能受體激動劑，廣泛應(yīng)用于ICU患者的鎮(zhèn)靜及鎮(zhèn)痛，全麻輔助用藥等諸多領(lǐng)域。近年發(fā)現(xiàn)，DEX對多個器官有保護作用[3]。根據(jù)現(xiàn)有理論我們擬采取DEX進行干預(yù)，試圖對膿毒癥受損肝臟的保護提出新的干預(yù)措施。本研究中，體內(nèi)采取盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)制造小鼠膿毒癥模型，體外利用較大劑量(100μg/mL)脂多糖(LPS)直接刺激肝細(xì)胞模擬膿毒癥時肝細(xì)胞損傷，將體內(nèi)與體外實驗相結(jié)合，共同探討DEX對膿毒癥肝細(xì)胞損傷及膿毒癥小鼠預(yù)后的影響。

1材料和方法

1.1實驗動物雄性C57BL/6小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量19～21g，清潔級，購自于北京華阜康生物科技股份有限公司，動物許可證號：SCXK(京) 2014-0004；

1.2實驗細(xì)胞正常小鼠肝細(xì)胞NCTC 1469,購自于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞資源中心。

1.3實驗儀器CO2培養(yǎng)箱：NAPCO公司，日本；高速低溫離心機：Hitachi公司，日本；超低溫冰箱：德國賀利氏公司；流式細(xì)胞儀：美國BD公司；倒置顯微鏡: OLYMPUS，日本。

1.4實驗藥物及試劑DEX：(2mL：200μg)江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號14110832；LPS：美國Sigma公司;白蛋白測定試劑盒：南京建成生物工程研究所；RPMI-1640培養(yǎng)基：美國Gibco公司；DMEM培養(yǎng)基：美國Gibco 公司；胎牛血清：杭州四季青生物材料有限公司；7-AAD細(xì)胞凋亡檢測試劑盒:北京諾博萊德科技有限公司。

1.5實驗方法

1.5.1體內(nèi)實驗。C57BL/6小鼠50只，隨機分為5組(n=10)：對照組(C組)，膿毒癥組(CLP組)，DEX低濃度組(D1組：30μg/kg)，DEX中濃度組(D2組：40μg/kg)，DEX高濃度組(D3組：50μg/kg)，DEX均為腹腔注射。觀察并記錄小鼠的生存狀態(tài)及死亡率。

除C組外，其余4組均制備膿毒癥小鼠模型：0.5%戊巴比妥鈉15mg/mL麻醉，小鼠仰臥固定，腹部備皮，超凈臺內(nèi)消毒腹部，腹正中切口，進入腹腔后，分離盲腸遠(yuǎn)端和腸系膜，避免損傷腸系膜血管。距盲腸遠(yuǎn)端2/3處用無菌4號線結(jié)扎，并用無菌7號針頭，在盲腸遠(yuǎn)端中央處貫通穿刺數(shù)次，擠出少許內(nèi)容物后把盲腸送回腹腔，逐層縫合關(guān)閉腹腔。術(shù)后背部皮下注射生理鹽水1mL。每12小時晝夜節(jié)律變換，自由進食水。

1.5.2在體實驗另取30只小鼠，分組及操作同體內(nèi)實驗。造模48小時后，脫頸處死小鼠，取出肝臟,無菌漂洗除去血液,100目篩網(wǎng)碾磨，制成單細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞濃度，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DEME培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，細(xì)胞貼壁生長，1～2天換液，觀察并記錄細(xì)胞生長情況，進行細(xì)胞增殖計數(shù)，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.5.3體外實驗

1.5.3.1細(xì)胞分組。分為5組，對照組(c組)、肝細(xì)胞損傷組(LPS 刺激組)，DEX低、中、高濃度組(d1、d2、d3組)。將處于對數(shù)期且生長狀態(tài)良好的NCTC 1469細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，PBS液洗滌后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105cell/mL，按上述分組每孔100μL接種于96孔板中，每組設(shè)6個平行孔，放于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時后，d1、d2、d3組分別加入終濃度為10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL的DEX溶液。除c組外，其余各組均加入終濃度為100μg/mL LPS。經(jīng)上述處理后，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后，待用。

1.5.3.2細(xì)胞增殖計數(shù)。收集培養(yǎng)后的細(xì)胞，計算活細(xì)胞數(shù)，取平均值，計算細(xì)胞增殖率。

1.5.3.3細(xì)胞上清液白蛋白含量測定。按試劑說明書操作，檢測上清液中白蛋白含量。

1.5.3.4流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡。用0.25%的胰蛋白酶消化后，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，將細(xì)胞輕輕吹打下來，1500rpm離心5分鐘，用PBS洗3遍，棄上清。校正細(xì)胞濃度，制成細(xì)胞懸液，加入5μL 7-AAD,室溫暗處染色15分鐘，上機檢測。

2結(jié)果

2.1體內(nèi)實驗DEX能降低膿毒癥小鼠死亡率，并呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系(P<0.05)。D1組和CLP組死亡率相同，D2、D3組死亡率明顯低于C組和D1組，見表1。

表1　各組小鼠死亡率比較( n=10)

注：與CLP組、C組比較，*P<0.05

2.2在體實驗各D組小鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)，增殖率明顯高于CLP組(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率低于CLP組(P<0.05)；而D2、D3組增殖細(xì)胞計數(shù)明顯多于D1組，細(xì)胞凋亡率低于D1組(P<0.05)，且呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系。細(xì)胞培養(yǎng)顯示，各D組的小鼠肝臟細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)良好，壞死碎裂細(xì)胞少，細(xì)胞島細(xì)胞聚集增殖明顯，見表2。

表2　在體實驗各組小鼠肝細(xì)胞

注：與CLP組比較，*P<0.05；與D1組比較，△P<0.05

2.3體外細(xì)胞系培養(yǎng)實驗

2.3.1高濃度LPS(100μg/mL)刺激后NCTC1469細(xì)胞受損嚴(yán)重，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)整，碎裂、懸浮細(xì)胞增多。加入DEX的培養(yǎng)孔細(xì)胞狀態(tài)明顯改善，見圖1。

2.3.2細(xì)胞增殖計數(shù)結(jié)果LPS組細(xì)胞增殖計數(shù)顯著低于c組(P<0.05);d2、d3組肝細(xì)胞培養(yǎng)的增殖細(xì)胞計數(shù)明顯多于LPS組與d1組(P<0.05)，見表3。

注：A：c組對照組；B：LPS組；C：d1 組DEX 10ng/mL；D：d2組DEX 100ng/mL；E：d3組DEX1000ng/mL

組別劑量(ng/mL)細(xì)胞增殖率(%)細(xì)胞凋亡率(%)c組020.20±4.662.46±0.34LPS組010.32±2.7813.68±2.49d1組1011.30±2.1112.88±3.90d2組10018.92±2.67*8.23±1.81*d3組100014.56±3.98*6.58±1.12*

注：與LPS組、d1組比較，*P<0.05

2.3.3流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果。LPS組與c組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),LPS組與d2、d3組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，d1組與LPS組未見明顯差異。見表3。

2.3.4細(xì)胞上清液中白蛋白含量。LPS組細(xì)胞上清液中白蛋白含量顯著低于c組(P<0.05)，各d組上清液中白蛋白含量明顯高于LPS組，且低于c組(P<0.05),見表4。

表4　不同組別肝細(xì)胞培養(yǎng)

注：與LPS組比較，*P<0.05；與d1組比較，△P<0.05

3討論

DEX是一種強有效的α2腎上腺素能受體激動劑,因其良好的麻醉和鎮(zhèn)靜效果，一般用于麻醉和ICU[4,5]。近年來還被證實具有抗炎、器官保護、增強機體免疫力的作用。有研究表明，DEX能夠減輕動物模型的全身炎癥反應(yīng)，改善氣體交換[6,7]。還有報道DEX能夠幫助改善小鼠腎缺血再灌注損傷后急性肺損傷[8], 對腎臟缺血再灌注損傷有強有力的保護作用，這可能與Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和轉(zhuǎn)錄激活因子通路有關(guān)[9,10]。在體內(nèi)和體外實驗中，DEX能夠改善由膽紅素介導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷，說明DEX有一定的細(xì)胞保護作用。DEX作為麻醉劑或鎮(zhèn)靜劑對慢性肝病圍手術(shù)期處理是一個不錯的選擇[11]。因此，我們認(rèn)為DEX能改善肝細(xì)胞損傷，起到一定的肝保護作用。鑒于DEX的藥理特點，本研究擬探討DEX是否可以減輕膿毒癥肝細(xì)胞的損傷并改善膿毒癥小鼠的預(yù)后。

DEX可以降低膿毒癥小鼠的死亡率。本研究表明，CLP組肝臟明顯腫脹、失去正常紅潤光澤、表面散在點狀及片狀出血點、質(zhì)地偏韌，DEX中、高劑量組肝臟大體形態(tài)明顯改善；此外還明顯改善了膿毒癥小鼠食欲減低、嗜睡、行動遲緩等生存狀態(tài)，降低膿毒癥小鼠的死亡率，改善遠(yuǎn)期預(yù)后。本研究與陸洋等[12]以及王益兵等[13]報道的DEX增加膿毒癥大鼠生存率的研究結(jié)果一致。

目前DEX對膿毒癥肝臟損傷的保護作用研究主要著眼于炎癥因子、免疫細(xì)胞及免疫調(diào)節(jié)等方面，而對肝臟實質(zhì)細(xì)胞的研究較少。肝細(xì)胞損害可導(dǎo)致肝功能不全,肝細(xì)胞功能喪失更可誘導(dǎo)多器官功能不全綜合征的發(fā)生。過度炎性介質(zhì)可以直接或間接損傷肝細(xì)胞。其中TNF-α是最為關(guān)鍵的細(xì)胞因子，可直接對肝細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，還可以誘發(fā)其他炎性介質(zhì)如IL- 6、IL- 8、IL-1等產(chǎn)生放大效應(yīng)。研究表明DEX可以減低熱射病大鼠血清中TNF-α、IL-6水平[14],降低內(nèi)毒素血癥或者膿毒癥大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性以及IL-6，TNF-α，IL-1β濃度，從而減輕急性肝損傷[15,16]。此外，氧化損傷也是肝細(xì)胞凋亡的一項重要機制。吳文峰等[17]通過5μg/kg DEX預(yù)處理缺血再灌注損傷大鼠，可明顯抑制TNF-α的釋放，同時減少肝組織中氧自由基生成。本研究表明，DEX組小鼠取出的肝細(xì)胞培養(yǎng)的增殖細(xì)胞計數(shù)明顯多于CLP組，而細(xì)胞凋亡率低于CLP組,呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系。由此可見，DEX能夠?qū)Ω渭?xì)胞產(chǎn)生有益影響,這可能與DEX具有抗炎和抗氧化作用有關(guān)。

近年的研究表明除淋巴細(xì)胞凋亡外，實質(zhì)細(xì)胞凋亡可能是器官功能障礙的重要原因之一。在體外實驗排除機體其他因素的影響下，本研究對NCTC1469細(xì)胞株增殖和凋亡情況及細(xì)胞功能的改變進行了觀察。結(jié)果顯示：DEX減輕了體外培養(yǎng)細(xì)胞損傷，細(xì)胞增殖率升高，凋亡率下降，白蛋白分泌增多。由此可見，DEX可以直接保護肝損傷模型中的肝細(xì)胞，促進細(xì)胞存活和增殖，抑制細(xì)胞凋亡。因此，本研究認(rèn)為DEX對膿毒癥肝細(xì)胞損傷具有保護作用，并且可以通過改善肝細(xì)胞損傷來改善膿毒癥預(yù)后，為膿毒癥肝臟保護提供了新的思路。

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(2016-03-04收稿)(庫雪飛編輯)

The effect of dexmedetomidine on the protection of sepsis liver cell injury

WANGXiaoqun,ZHAOFang,XUKaizhi,etal

(DepartmentofAnesthesiology，TangshanGongrenHospitalAffiliatedtoNorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000，China)

[ABSTRACT]ObjectiveTo explore the effect of dexmedetomidine(DEX)on the protection of sepsis liver cell injury in vitro and vivo.MethodsA total of eighty male C57BL/6 mice were randomly divided into 2 groups,and in which 30 mice were randomly divided into 5 groups:control group(C group),sepsis group(CLP group),DEX group(D1、D2、D3 group),Each group hod six mice.The animal models were established by cecal ligation and puncture(CLP)group and D group,except C group.One hour after the surgery,the mice in group D1、D2、D3 were received intraperitoneal injection with 30μg/kg,40μg/kg and 50μg/kg of DEX.The mice were sacrificed at 48h after CLP.Liver specimens were obtained for cell culture.Used the inverted microscope to ovserve the hepatocyte growth.Furthermore the survival rates were observed in the other 50 mice.The cultured NCTC1469 cells were divided into 5 groups:control group(c group),hepatocyte injury group(LPS group),DEX group(d1、d2、d3 group).Except c group,LPS at concentration of 100μg/mL was used to induce injury to the cultured cells and 10ng/mL,100ng/mL,1000ng/mL DEX were added at the same time in d group.After 24h of incubation,the cell apoptosis rates were detected by flow-cytometry.The content of albumin in cell supernatants were measured.Used the inverted microscope to observe the hepatocyte growth and recorded the number of cell proliferation.ResultsIn vivo,the survival rate of mice in D2 or D3 group was significantly higher than that in CLP group (P<0.05).Compared with CLP group, the cell proliferation count was increased and the apoptosis rate was decreased in D group(P<0.05). The cultured hepatocyte grew well.The cultured NCTC1469 cells in LPS group were seriously damaged and the apoptosis rate was increased compared with c group(P<0.05).In d group,the state of cultured cells was improved,albumin content and cell proliferation rate were significantly increased(P<0.05).ConclusionDEX can effectively ameliorate the sepsis-associated hepatocyte injury and significantly improve the survival rate in mice with sepsis.

[KEYWORDS]Dexmedetomidine.Sepsis.Liver injury.Cell apoptosis.Cell proliferation

【作者簡介】王曉群(1988-)，女，碩士研究生，醫(yī)師。研究方向：膿毒癥與器官保護。

【通訊作者】徐凱智

[中圖分類號]R 614.1 R 392.5

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]2095-2694(2016)03-169-05