陳建霞，許瑞環(huán)，黃衍鋒，張　旭

(深圳市龍崗中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東深圳 518116)

·論著·

3種不同方法檢測(cè)乙型肝炎病毒的診斷性能比較

陳建霞，許瑞環(huán)，黃衍鋒，張旭

(深圳市龍崗中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東深圳 518116)

摘要:目的比較酶聯(lián)免疫法(ELISA)、電化學(xué)發(fā)光法(ECLIA)及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(PCR)檢測(cè)乙型肝炎病毒(HBV)對(duì)臨床診斷的對(duì)比分析。方法應(yīng)用ELISA、ECLIA及PCR法同時(shí)檢測(cè)200例HBV患者或HBV攜帶者血清標(biāo)本的HBV病毒，比較不同方法HBV病毒檢出率差異。結(jié)果ELISA對(duì)HBV病毒有5份漏檢，而PCR、ECLIA沒(méi)有。PCR、ECLIA和ELISA方法對(duì)HBV的檢測(cè)結(jié)果與臨床符合率分別為99.5%、100.0%及93.5%。HBV-DNA的檢測(cè)結(jié)果與ECLIA法檢測(cè)HBV病毒一致性較好。結(jié)論ELISA分別與ECLIA及PCR檢測(cè)HBV病毒的檢出率有顯著性差異，ELISA比較適合初篩，ECLIA相對(duì)準(zhǔn)確性更好一些，而PCR檢測(cè)HBV-DNA用于判斷體內(nèi)HBV病毒復(fù)制與否。

關(guān)鍵詞:乙型肝炎病毒；酶聯(lián)免疫法；電化學(xué)發(fā)光法；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法

隨著免疫學(xué)和分子生物技術(shù)的迅速發(fā)展，檢測(cè)乙型肝炎病毒(HBV)標(biāo)志物的方法不斷更新[1]。目前常用的免疫學(xué)方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，固相放射免疫法、膠體金免疫層析法、時(shí)間分辨免疫熒光法、微粒子酶免疫分析法、化學(xué)發(fā)光法及電化學(xué)發(fā)光法(ECLIA)等[2]，分子生物學(xué)方法有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(PCR)。放射免疫分析雖然具有高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，但其不可避免的放射性對(duì)操作者的身體是有害的。膠體金法是一種優(yōu)化的方法，其優(yōu)點(diǎn)是速度快，10 min即可判讀結(jié)果，但其同樣只能做定性檢測(cè)，且準(zhǔn)確率低于ELISA，對(duì)于弱陽(yáng)性的表現(xiàn)度較差，容易造成弱陽(yáng)性標(biāo)本的漏讀和誤讀，性價(jià)比與準(zhǔn)確度方面都略遜于傳統(tǒng)的ELISA[3]。時(shí)間分辨免疫熒光法、微粒子酶免疫分析法、化學(xué)發(fā)光法及ECLIA是目前定量檢測(cè)HBV標(biāo)記物的較好方法[4]。這些方法具有很多優(yōu)越性，如靈敏度和特異性都比定性方法學(xué)高，標(biāo)本可以獨(dú)立檢測(cè)，大大縮短了等候報(bào)告的時(shí)間等；另外定量方法可以克服ELISA定性對(duì)含量太高造成假陰性的誤判，也避免了ELISA 定性分析時(shí)弱陽(yáng)性標(biāo)本的漏檢[5]。HBV病毒核酸(HBV-DNA)水平是直接反映HBV患者病毒復(fù)制水平，病毒血癥程度，傳染性強(qiáng)弱的最佳指標(biāo)，目前臨床上常采用熒光定量PCR可直接檢測(cè)血清中HBV-DNA的載量。由于ELISA、ECLIA及PCR方法在臨床檢測(cè)中應(yīng)用的比較多，本文旨在研究三者之間的關(guān)系，為對(duì)乙型肝炎的診斷與治療提供更準(zhǔn)確、更有價(jià)值的信息。

1資料與方法

1.1一般資料隨機(jī)留取本院HBV患者或HBV攜帶者血清樣本200例，其中男135例，女65例，平均年齡47歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：HBsAg陽(yáng)性持續(xù)6個(gè)月以上；ALT<2×ULN持續(xù)6個(gè)月以上，未使用任何保肝降酶藥；HBeAg(+/-)，HBV-DNA>102copies/mL；既往未接受任何抗病毒治療包括干擾素和核苷(酸)類似物，排除其他類型肝炎的感染。按照HBV-DNA含量高低分3組。 A組為HBV-DNA含量小于103copies/mL；B組為HBV-DNA含量103～<105copies/mL；C組為HBV-DNA含量 105～108copies/mL；每組份HBV血清標(biāo)志物的測(cè)定采用同一份標(biāo)本。

1.2主要儀器與試劑全自動(dòng)發(fā)光儀(美國(guó)羅氏公司生產(chǎn)的E170型)、實(shí)時(shí)熒光PCR分析儀(美國(guó)ABI公司生產(chǎn)7300型)、酶標(biāo)儀(上海安圖公司生產(chǎn)PHOM型)和洗板機(jī)(深圳匯松洗板機(jī)PW-960)。PCR法試劑由深圳市匹基生物科技有限公司提供；HBV血清學(xué)標(biāo)志物發(fā)光試劑是美國(guó)羅氏公司配套試劑，ELISA法試劑由上?？迫A公司提供。

1.3檢測(cè)方法

1.3.1標(biāo)本采集空腹抽取靜脈血3 mL，避免溶血和脂血。靜置30 min,，2 000 r/min離心5 min，離心后分離血清，-80 ℃保存直至檢測(cè)。

1.3.2HBV血清標(biāo)志物檢測(cè)分別采用ECLIA法和ELISA法，ECLIA法由美國(guó)羅氏公司提供全自動(dòng)免疫分析儀和配套試劑。ELISA法由上?？迫A公司提供試劑。每天質(zhì)量控制均符合要求，操作與判斷結(jié)果嚴(yán)格按照說(shuō)明書要求進(jìn)行。

1.3.3HBV-DNA檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(循環(huán)程序設(shè)置：50 ℃，2 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃，5 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃，15 s，57 ℃，15 s，45個(gè)循環(huán)；25 ℃，10 s，1個(gè)循環(huán)。熒光信號(hào)收集在57 ℃。HBV-DNA定量結(jié)果由儀器軟件自動(dòng)分析計(jì)算，HBV-DNA>103copies/mL時(shí)血清為陽(yáng)性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，HBV-DNA copies數(shù)采用求對(duì)數(shù)平均值的方法計(jì)算，并運(yùn)用χ2檢驗(yàn)和Fisher精確檢驗(yàn)比較檢測(cè)結(jié)果，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.13種方法檢出率的頻數(shù)分布研究結(jié)果顯示，ECLIA檢測(cè)的HBsAg陽(yáng)性檢出率與ELISA檢測(cè)的陽(yáng)性率比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他組間ELISA組與PCR組(χ2=2.065，P=0.091)或ECLIA組與PCR組(χ2=2.008，P=0.157)其檢出率差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對(duì)于陰性檢出率ELISA組與ECLIA或PCR比較(χ2=6.231，P=0.013)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1　　3種方法檢測(cè)HBV標(biāo)志物檢出率的頻數(shù)分布

2.23種方法檢測(cè)HBV標(biāo)志物定量結(jié)果比較總體上組內(nèi)差異情況研究結(jié)果顯示，ECLIA檢測(cè)的HBsAg或PCR法檢測(cè)的HBV-DNA在A和C組內(nèi)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，其他組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。在ELISA組的檢出率中C組與A和B組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，A和B組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2　　3種方法檢測(cè)HBV標(biāo)志物分組結(jié)果定量結(jié)果比較

2.3ELISA,ECLIA和PCR檢測(cè)HBV標(biāo)志物檢出率比較3種方法對(duì)HBV標(biāo)志物檢出率兩兩之間進(jìn)行比較，方法采用Fisher精確檢驗(yàn)，結(jié)果顯示ELISA法檢出率(93.5%)與ECLIA法(100.0%)和PCR法(100.0%)檢出率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，ECLIA法與PCR法檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3討論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示PCR和ECLIA檢測(cè)的HBV結(jié)果比ELISA對(duì)臨床診斷的符合率較高，但是每種方法對(duì)HBV的檢測(cè)又各有差異。

ELISA仍是目前大多數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)室定性檢測(cè)HBV血清標(biāo)志物的常規(guī)方法。該方法具有靈敏度高、特異度強(qiáng)、重復(fù)性好的特點(diǎn)，且操作簡(jiǎn)單、試劑價(jià)廉、無(wú)放射性危害等多年來(lái)廣泛應(yīng)用于臨床[6-7]。然而，ELISA不能進(jìn)行定量分析，在陽(yáng)性判斷值周圍一定范圍之外的測(cè)定結(jié)果為測(cè)定的灰區(qū)，易引起假陰性。本試驗(yàn)結(jié)果表明，5例ELISA檢測(cè)陰性的標(biāo)本ECLIA檢測(cè)或PCR檢測(cè)為陽(yáng)性，分析其原因可能為溶血、脂血、黃疸鉤狀效應(yīng)引起的[8]。雖然ELISA 方法優(yōu)缺點(diǎn)分明，但從臨床角度，尚不可能用ECLIA或時(shí)間分辨熒光分析法來(lái)取代傳統(tǒng)的ELISA，其原因主要在于價(jià)格上的巨大差異。而且，絕大多數(shù)受試者只需ELISA即可，而且ELISA中S/CO值實(shí)際上有一定半定量意義。

ECLIA是一種高靈敏度的分析技術(shù)，是繼放射免疫、熒光免疫、酶免疫、化學(xué)發(fā)光免疫和時(shí)間分辨免疫技術(shù)測(cè)定之后新一代標(biāo)記技術(shù)。近年來(lái)，ECLIA以其自動(dòng)、快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景[9]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示ECLIA的檢測(cè)陽(yáng)性率和符合率均高于ELISA檢測(cè)方法。有研究結(jié)果顯示ECLIA的靈敏度為0.05 ng/mL，大大高于ELISA測(cè)定靈敏度的1.00 ng/mL[10]。從方法學(xué)和自動(dòng)化程度上來(lái)講，ECLIA優(yōu)于ELISA，但成本高，且未能國(guó)產(chǎn)化，從而影響到其推廣應(yīng)用。ECLIA和ELISA不能定量判斷病毒載量情況，PCR方法在此方面要優(yōu)于以上方法。 PCR技術(shù)能夠大大增加HBV-DNA檢測(cè)的敏感范圍，達(dá)到5～10 pg/mL[11]。而且PCR檢測(cè)HBV-DNA可以判斷體內(nèi)HBV是否存在復(fù)制、復(fù)制程度、HBV是否被清除等，特別是檢測(cè)隱性HBV方面尤為突出，為臨床觀察藥物療效、病情轉(zhuǎn)歸等提供了有力的證據(jù)[12]。

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The comparision of there different methods to detect HBV virus of diagnostic performance

ChenJianxia,XuRuihuan,HuangYanfeng,ZhangXu

(DepartmentofClinicalLaboratory,LonggangCentralHospitalofShenzhen,Shenzhen,Guangdong518116,China)

Abstract:ObjectiveTo compare of ELISA,ECLIA and PCR in the detection of HBV virus for clinic diagnosis of HBV patients.MethodsThe serum sample of 200 HBV patients or HBV carriers were tested with ELISA,ECLIA and PCR.The different HBV detection rate between the three methods were compared.ResultsFive of 200 samples were lost with ELISA method,but in ECLIA and PCR there were no lost samples.Coincidence rate of HBV detection of ELISA,ECLIA and PCR were 99.5%，100.0% and 93.5% respectively.The results of HBV with ECLIA were consistent with HBV-DNA with PCR method.ConclusionThere is obvious difference between ELISA,ECLIA and PCR in relevance rate of HBV detection.ELISA is suitable to preliminary screening,and ECLIA has better accuracy and PCR is suitable to decide whether HBV virus replication happened in the body.

Key words:hepatitis B virus;ELISA;ECLIA;PCR

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.10.024

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)10-1360-02

(收稿日期：2015-12-11)

作者簡(jiǎn)介：張文靜,女,副主任醫(yī)師，主要從事臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)研究。