程孝中， 許 勇， 葛永斌， 魏 磊， 燕傲蕾， 張 宇， 劉西嶺， 徐 娟， 郭 慧

(1．亳州學(xué)院，安徽亳州 236800；2.安徽省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院,安徽合肥 230061)

亳芍產(chǎn)芍藥苷內(nèi)生真菌的篩選

程孝中1， 許 勇2*， 葛永斌1， 魏 磊1， 燕傲蕾1， 張 宇1， 劉西嶺1， 徐 娟1， 郭 慧1

(1．亳州學(xué)院，安徽亳州 236800；2.安徽省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院,安徽合肥 230061)

摘要[目的]篩選亳芍產(chǎn)芍藥苷內(nèi)生真菌。[方法]采用組織塊法從亳芍的根部分離內(nèi)生真菌；從內(nèi)生真菌發(fā)酵液中抽提芍藥苷；然后通過薄層層析、高效液相色譜分析和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)內(nèi)生真菌所產(chǎn)芍藥苷進(jìn)行鑒定。[結(jié)果]從亳芍中分離到22株內(nèi)生真菌，其中1株為產(chǎn)芍藥苷內(nèi)生真菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定為細(xì)腳棒束孢種(Isaria tenuipes)。[結(jié)論]從亳芍中分離到了一株產(chǎn)芍藥苷內(nèi)生真菌R12，可作為芍藥苷藥物工業(yè)化生產(chǎn)的候選菌株。

關(guān)鍵詞亳芍；內(nèi)生真菌；芍藥苷;篩選

植物內(nèi)生真菌(Endophytic fungi)是指在某一時(shí)期生活在植物體內(nèi)，但對(duì)寄主植物組織并不引起明顯病害癥狀的真菌[1]，“內(nèi)共生理論”認(rèn)為內(nèi)生真菌可產(chǎn)生與其宿主相同或相似的代謝物質(zhì)，1993年美國蒙大拿州立大學(xué)Strobel首次從短葉紅豆杉的韌皮部分離到一株具有合成與宿主相同抗癌藥物——紫杉醇的內(nèi)生真菌[2]。隨后，許多科研工作者相繼從不同植物體內(nèi)分離得到產(chǎn)生抗癌活性物質(zhì)、抗菌活性物質(zhì)等其他藥用物質(zhì)的內(nèi)生真菌[3-5]。

芍藥苷(paeoniflorin)為芍藥的主要活性成分，能夠抑制腎臟中的ICAM-1、IL-1、TNF-α等細(xì)胞因子，起到抗炎癥、抗氧化作用[6]。芍藥苷通過調(diào)節(jié)腺苷A1受體減少痛疼，抑制前列腺素E2、白三烯B4來減少炎癥反應(yīng)，促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖和分化來實(shí)施免疫保護(hù)[7]；在抑制血管發(fā)生[8]、抗過敏[9]等方面均發(fā)揮了重要的作用。但芍藥生長周期較長(3～4 a)[10]，原產(chǎn)地種植率下降，地道的亳芍產(chǎn)量急劇下降，加上芍藥苷化學(xué)合成較難，芍藥苷的市場(chǎng)來源越來越困難，因此通過微生物發(fā)酵方法生產(chǎn)芍藥苷具有重要意義。筆者采用組織塊法從亳芍的根部分離內(nèi)生真菌，從內(nèi)生真菌發(fā)酵液中抽提芍藥苷，然后通過薄層層析(TLC)、高效液相色譜(HPLC)分析和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF)對(duì)內(nèi)生真菌所產(chǎn)芍藥苷進(jìn)行鑒定，篩選能夠產(chǎn)芍藥苷的內(nèi)生真菌，為微生物發(fā)酵生產(chǎn)芍藥苷提供候選菌株。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)材料。亳芍采自亳州學(xué)院中藥園(3年生)，取植株的根部位。

1.1.2儀器與試劑。SD25-12DTDN超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技有限公司)；DIIG-9141A電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司)；GI54DWS 高壓蒸汽滅菌鍋(廈門致微儀器有限公司)；SW-CJ-2FD凈化工作臺(tái)(AIRTECH)；ZXSD-A1160培養(yǎng)箱(上海智誠分析儀器制造有限公司)；E2695高效液相色譜儀(美國沃特世公司)；基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(New ultrafleXtreme MALDI TOF，Bruker Daltonics)。芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品為阿拉丁產(chǎn)品；2,5-二羥基苯甲酸(DHB)為Sigma-Aldrich產(chǎn)品，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1內(nèi)生真菌的分離與純化。取亳芍根部位，洗潔精漂洗1遍，流動(dòng)水洗至無泡沫。在超凈工作臺(tái)上，用75%酒精消毒1 min，無菌水洗滌3遍，0.1%升汞消毒6 min，再用無菌水洗滌3遍，無菌濾紙吸干殘留水分，剪切成0.5 cm×0.5 cm小片接種于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)平皿上，置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～6 d，即可見小片切割邊緣長出菌絲，挑取菌絲接種于另一PDA斜面上備用。對(duì)照組使用未切割的小片，其余操作同試驗(yàn)組，證明所分離的菌是來源于植物體內(nèi)而非表面附生菌。

1.2.2產(chǎn)芍藥苷菌株的篩選。液體培養(yǎng)基采用PDA液體培養(yǎng)基，挑取備用的菌絲接種于100 mL PDA液體培養(yǎng)基中，接種5瓶，28 ℃搖床，120 r/min培養(yǎng)7 d。收集發(fā)酵液，經(jīng)過濾、凍融后，加入等體積氯仿萃取，有機(jī)相濃縮得到內(nèi)生真菌的粗提物。

1.2.3薄層層析(TLC)檢測(cè)[10]。展開劑為氯仿∶甲醇(3∶1)，顯色劑為5%香草醛硫酸乙醇溶液，顯色后記錄芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的Rf值。

1.2.4高效液相色譜分析(HPLC)。色譜柱C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈和含0.1%三氟乙酸的水(14∶86)；流速1 mL/min；檢測(cè)波長230 nm。以芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品為參考。

1.2.5基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI -TOF)分析。取樣品1 μL點(diǎn)靶，等樣品風(fēng)干后，再取基質(zhì)DHB 1 μL點(diǎn)在樣品上面，自然風(fēng)干形成結(jié)晶后進(jìn)行打靶。

1.2.6菌株的初步鑒定。形態(tài)學(xué)分類依據(jù)內(nèi)生真菌的菌落外部形態(tài)進(jìn)行分類[11]。

2結(jié)果與分析

2.1內(nèi)生真菌活性產(chǎn)物芍藥苷的鑒定

2.1.1TLC檢測(cè)。利用TLC法對(duì)22株內(nèi)生真菌發(fā)酵液提取物進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)，菌株R12粗提物中出現(xiàn)一個(gè)斑點(diǎn)與芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品的遷移率最接近，標(biāo)準(zhǔn)品和R12粗提物的Rf值分別為0.54、0.51(圖1)，混合點(diǎn)顯示樣品點(diǎn)與標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)重合完好。

2.1.2 HPLC分析。對(duì)菌株R12粗提物進(jìn)行HPLC分析，R12菌株提取物中最高峰出峰時(shí)間為7.773 min，芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間為7.801 min(圖2)，二者出峰時(shí)間非常接近，表明R12粗提物中含有芍藥苷，菌株R12為產(chǎn)芍藥苷內(nèi)生真菌。根據(jù)峰面積計(jì)算出R12菌株菌液中芍藥苷濃度為0.44 mg/L。

注：1為標(biāo)準(zhǔn)品；2為R12粗提物；3為混合點(diǎn)。Note: 1. Paeoniflorin standard;2. Extracts from strain R12;3. Mixture of paeoniflorin standard and extracts from strain R12.圖1　內(nèi)生真菌R12菌株產(chǎn)芍藥苷的TLC分析Fig. 1　The TLC analysis of endophytic fungi R12 producing paeoniflorin

圖2　芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品(a)和R12提取物(b)的HPLC分析Fig.2　HPLC analysis of standard paeoniflorin(a) and fungal paeoniflorin from R12(b)

2.1.3MALDI -TOF分析。為了進(jìn)一步確定HPLC中7.773 min出峰的物質(zhì)，收集7.773 min的物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，芍藥苷分子量為480.46，質(zhì)譜圖中出現(xiàn)2個(gè)離子峰(圖3)，分別為503.157(M+Na+)和519.127(M+K+)，進(jìn)一步證明菌株R12的代謝產(chǎn)物中含芍藥苷，菌株R12為產(chǎn)芍藥苷內(nèi)生真菌。

圖3　R12提取物的MALDI-TOF分析Fig. 3　MALDI-TOF of fungal paeoniflorin from strain R12

圖4　產(chǎn)芍藥苷內(nèi)生真菌R12的菌落形態(tài)Fig. 4　The colony morphology of paeoniflorin-producing endophytic fungi strain R12

2.2種屬初步鑒定產(chǎn)芍藥苷內(nèi)生真菌R12在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，菌落直徑為3 cm左右，絨毛狀，白色，菌落疏松，不規(guī)則形，背面呈暗棕色，不易挑取，延長培養(yǎng)產(chǎn)生孢梗束，液體培養(yǎng)5 d后，菌絲球達(dá)3～5 mm，菌液黃色(圖4)。與《中國真菌志》(第四十三卷)[11]棒束孢屬(Isaria)細(xì)腳棒束孢種(Isaria tenuipes)菌落形態(tài)描述極為相似。

3結(jié)論與討論

在分離內(nèi)生真菌過程中，利用未切割的亳芍根部組織做同樣的培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)并沒有真菌生長，證明試驗(yàn)組分離到的22株真菌均為內(nèi)生真菌。內(nèi)生真菌分布比較廣泛，植物不同部位均有分布，且次生代謝產(chǎn)物十分豐富[12],由于亳芍以根部入藥，故該試驗(yàn)中是從亳芍根部分離內(nèi)生真菌，分離到的內(nèi)生真菌只是亳芍內(nèi)生真菌的一部分，接下來的試驗(yàn)可以從亳芍葉、莖等部位分離更多的內(nèi)生真菌，可能會(huì)篩選到產(chǎn)量更高的產(chǎn)芍藥苷內(nèi)生真菌。

R12菌株是首次從亳芍根部分離到的能夠產(chǎn)芍藥苷的內(nèi)生真菌，在鑒定R12提取物時(shí)，除了傳統(tǒng)方法TLC和HPLC分析外，該試驗(yàn)采用了MALDI-TOF對(duì)提取物進(jìn)行分子量驗(yàn)證，MALDI-TOF是近年來發(fā)展起來的一種新型軟電離質(zhì)譜技術(shù),其檢測(cè)和鑒定具有快速、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)樣品的量要求較少[13]，試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)一步證明了R12菌株是產(chǎn)芍藥苷內(nèi)生真菌。

在鑒定R12菌株方面，根據(jù)形態(tài)學(xué)初步鑒定為棒束孢屬(Isaria)細(xì)腳棒束孢種(Isaria tenuipes)。進(jìn)一步鑒定和確認(rèn)R12菌株方面，還需要利用分子生物學(xué)擴(kuò)增保守序列并結(jié)合生物信息學(xué)，構(gòu)建生物分類系統(tǒng)進(jìn)化樹。

該試驗(yàn)中產(chǎn)芍藥苷菌株R12初步發(fā)酵產(chǎn)量為0.44 mg/L，未進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，下一步可以進(jìn)行R12發(fā)酵條件的探索，以提高芍藥苷發(fā)酵產(chǎn)量，為工業(yè)化提供更成熟的發(fā)酵條件。在提高發(fā)酵產(chǎn)量方面，還可以通過代謝工程對(duì)芍藥苷代謝途徑進(jìn)行控制，但目前芍藥苷生物合成途徑研究較少，對(duì)于芍藥苷上下游產(chǎn)物以及關(guān)鍵合成酶研究尚不深入，基礎(chǔ)研究的不足限制了芍藥苷發(fā)酵產(chǎn)量的優(yōu)化，將來這些代謝節(jié)點(diǎn)的研究均可為芍藥苷代謝途徑控制提供基礎(chǔ)。

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Screening of Producing Paeoniflorin Endophytic Fungi fromPaeonialactiflora

CHENG Xiao-zhong1,XU Yong2*,GE Yong-bin1et al

(1. Bozhou University,Bozhou,Anhui 236800; 2. Anhui Academy of Medical Sciences,Hefei,Anhui 230061)

Abstract[Objective] To isolate paeoniflorin-producing endophytic fungi strains from Paeonia lactiflora. [Method] The endophytic fungi were isolated from the root of Paeonia lactiflora using tissue explants;The paeoniflorin from endophytic fungi were confirmed by thin layer chromatography(TLC), high performance liquid chromatography(HPLC) and matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF). [Result] A total of 22 endophytic fungi were isolated from the root of Paeonia lactiflora.1 strain was recognized as an endophytic fungi capable of producing paeoniflorin and classified asIsaria tenuipes. [Conclusion]The separated endophytic fungi,strain R12,can be a candidate for paeoniflorin production.

Key wordsPaeonia lactiflora; Endophytic fungi; Paeoniflorin; Screening

基金項(xiàng)目安徽省高校自然科學(xué)基金項(xiàng)目(KJ2014A167)。

作者簡介程孝中(1983-)，男，安徽安慶人，講師，在讀博士，從事中草藥組織培養(yǎng)和內(nèi)生菌研究。*通訊作者，助理研究員，碩士，從事分子生物學(xué)及生物化學(xué)研究。

收稿日期2016-03-28

中圖分類號(hào)Q 813.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)11-162-03