王曉琳曹愛新周傳斌趙愷凝趙國柱

（1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083；2.中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心城市與區(qū)域生態(tài)國家重點實驗室，北京 100085）

垃圾填埋場甲烷氧化菌及甲烷減排的研究進(jìn)展

王曉琳1曹愛新2周傳斌2趙愷凝1趙國柱1

（1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083；2.中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心城市與區(qū)域生態(tài)國家重點實驗室，北京 100085）

垃圾填埋場是全球最重要的人為甲烷排放源之一，其全球年甲烷釋放量為35-69 Tg，垃圾填埋場甲烷減排是目前全球溫室氣體研究的熱點。甲烷氧化菌能夠氧化分解甲烷，作為減少大氣甲烷排放的重要生物匯，對保持大氣中甲烷濃度的平衡具有重要意義。從甲烷氧化菌的類型及其特征、甲烷氧化機(jī)理著手，介紹了多樣性研究方法、填埋場中甲烷氧化菌的活性影響因素及甲烷生物減排應(yīng)用等最新研究進(jìn)展。在綜述前人研究的基礎(chǔ)上，探討了目前研究的不足，提出了利用甲烷氧化菌復(fù)合微生物菌劑等綜合處理措施，旨為垃圾填埋場甲烷減排的研究和應(yīng)用提供新的思路。

垃圾填埋場；甲烷；甲烷氧化菌；溫室氣體；生物減排

甲烷是一種重要的溫室氣體，其全球增溫潛勢是二氧化碳的25倍，我國將甲烷列為重點控制的溫室氣體之一［1］。研究表明，自前工業(yè)化時期以來，大氣中甲烷的排放對全球變暖的貢獻(xiàn)率約為20%［2］。據(jù)估算，全球每年通過自然源和人為源排放至大氣的甲烷為500-600 Tg［3］，而垃圾填埋場是最為重要的人為甲烷排放源之一，其年甲烷釋放量為35-69 Tg，垃圾填埋場的甲烷減排技術(shù)受到越來越多的關(guān)注［1］。填埋場中大量的可生物降解垃圾是其甲烷釋放的主要來源。填埋場的甲烷產(chǎn)量會達(dá)到峰值后緩慢下降，但釋放量會在其封場后仍然持續(xù)幾十年［4］。我國的生活垃圾衛(wèi)生填埋場雖然有導(dǎo)氣和填埋氣收集裝置，但也僅能收集60%-80%的填埋氣，仍有大量的甲烷排放到環(huán)境中。土壤中的甲烷氧化微生物在維持大氣中的甲烷濃度平衡中具有非常重要的作用，有研究表明土壤中的甲烷氧化菌貢獻(xiàn)了甲烷氧化總量的5%-15%，是重要的全球甲烷匯之一［5］。填埋場的存量垃圾和表層覆土中都有甲烷氧化菌的存在，因此強(qiáng)化其甲烷氧化功能、削減垃圾填埋場中無組織排放的甲烷，已成為垃圾處理、溫室氣體減排、生態(tài)及環(huán)境工程微生物等領(lǐng)域的研究熱點［6］。

1 甲烷氧化菌類型及其特征

甲烷氧化菌是一類以甲烷為唯一碳源和能源的甲基營養(yǎng)型微生物［7］，可將甲烷經(jīng)一系列酶促反應(yīng)氧化成二氧化碳，于1906 年首次被分離出來。根據(jù)代謝途徑、膜結(jié)構(gòu)、主要磷脂脂肪酸成分等系列特征，甲烷氧化菌分為TypeⅠ、TypeⅡ和Type X三種類型。TypeⅠ型甲烷氧化菌歸屬于γ-變形菌門（gammaproteobacteria），通過磷酸核酮糖途徑同化甲醛；TypeⅠ型甲烷氧化菌中的Methylococcus和Methylocaldum也被稱為Type X型甲烷氧化菌，是一類耐熱的甲烷氧化菌［8］。與Ⅰ型一樣，X型利用磷酸核酮糖途徑同化甲醛。X 型和Ⅰ型的不同之處在于 X型含有低水平的絲氨酸途徑酶，生長溫度要比Ⅰ型和Ⅱ型高，且DNA中的GC%比大多數(shù)Ⅰ型高。而TypeⅡ型甲烷氧化菌歸屬于α-變形菌門（Alphaproteobacteria），通過絲氨酸途徑同化甲醛［9］。隨著研究的深入，人們又發(fā)現(xiàn)了屬于疣微菌門（Verrucomicrobia）的極端嗜酸嗜熱甲烷氧化菌［10-14］，其同化甲醛的途徑也為絲氨酸途徑。目前已知的甲烷氧化菌有24個屬［15-19］，主要類型及其生物學(xué)特征，見表1。雖然甲烷氧化菌被認(rèn)為是以甲烷為唯一碳源和能源的甲基營養(yǎng)型微生物，但隨著研究的深入，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了Methylocella silvestris［20］等兼性甲烷氧化菌，這些菌除能利用甲烷外，還能利用多碳化合物、乙醇和烷烴作為碳源［21，22］。

表1 已知甲烷氧化菌的分類及其生物學(xué)特征

2 甲烷的微生物氧化機(jī)理

雖然甲烷氧化菌的種類和生存環(huán)境多種多樣，但通過其生物化學(xué)作用氧化甲烷的原理基本一致。Hanson等［7］解析了甲烷的生物氧化機(jī)理，如圖1所示。甲烷首先被氧化為甲醇，催化該過程的關(guān)鍵酶是甲烷單加氧酶（methane monooxygenase，MMO），該酶有兩種不同類型，一種是顆粒狀或膜結(jié)合甲烷 單 加 氧 酶（particulate methane monooxygenase，pMMO），幾乎存在于所有已發(fā)現(xiàn)的甲烷氧化菌中；另一種是位于細(xì)胞質(zhì)中的可溶性甲烷單加氧酶（soluble methane monooxygenase，sMMO），僅存在于部分甲烷氧化菌中。雖然它們在細(xì)胞內(nèi)具有相似的功能，但這兩種酶的基因和結(jié)構(gòu)明顯不同［23］。由于MMO 是甲烷氧化菌的功能酶系，且?guī)缀跛泻醚跫淄檠趸己衟MMO，因此已廣泛利用MMO作為生物標(biāo)記物進(jìn)行甲烷氧化菌生態(tài)學(xué)研究。接著甲烷氧化產(chǎn)生的內(nèi)源甲醇和由幾丁質(zhì)及木質(zhì)素降解形成的外源甲醇在甲醇脫氫酶（methanoldehydrogenase，MDH）的作用下氧化成甲醛。然后甲醛在甲醛脫氫酶的作用 下氧化成甲酸。同時，Ⅰ 型甲烷氧化菌可以利用磷酸核酮糖途徑同化甲醛，作為其生長繁殖需要的碳源和能源；Ⅱ型甲烷氧化菌則通過絲氨酸途徑完成這個同化作用［24］。最后甲酸在甲酸脫氫酶作用下氧化為二氧化碳。

圖1 甲烷氧化菌氧化甲烷的機(jī)理圖［7］

3 甲烷氧化菌多樣性的研究方法

甲烷氧化菌多樣性研究可以很好地反應(yīng)甲烷氧化菌在環(huán)境樣品中的物種豐富度、各類遺傳信息及其所執(zhí)行的功能和過程，為我們?nèi)媪私饧淄檠趸捌溲趸到饧淄榈墓δ艿於嘶A(chǔ)。研究甲烷氧化菌多樣性的方法主要有培養(yǎng)法、分子生物學(xué)法和穩(wěn)定同位素示蹤法［25］。因傳統(tǒng)的培養(yǎng)法得到的甲烷氧化菌分離培養(yǎng)物并不能代表填埋土里真正的甲烷氧化菌群落，會造成大量信息的丟失，特別是不可培養(yǎng)的甲烷氧化菌，所以目前研究者多采用分子生物學(xué)法和穩(wěn)定同位素示蹤法。

研究甲烷氧化菌常用的分子標(biāo)記物主要是16S rRNA和功能基因。16S rRNA作為研究最多和最透徹的基因序列，因其高度保守性和特異性，通過高通量測序Hiseq、Miseq等技術(shù)，已被廣泛地應(yīng)用于甲烷氧化菌的檢測及相關(guān)的分子生態(tài)學(xué)領(lǐng)域。功能基因因其在復(fù)雜的環(huán)境樣品中具有高度敏感性和可識別不可培養(yǎng)的功能微生物的優(yōu)點也被越來越被廣泛使用［26］。pmoA（編碼顆粒性甲烷單加氧酶的α-亞基）已在大多數(shù)甲烷氧化菌中被測序，是目前研究最為深入的功能基因。另外，mmoX（編碼可溶性甲烷單加氧酶）、mxaF（編碼甲醇脫氫酶的較大亞基）［27］和nifH（編碼固氮酶的關(guān)鍵部分雙氮還原酶）［28，29］等功能基因也較為常用。

末端限制性片段長度多態(tài)性分析（terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）、變性梯度凝電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）是常用的分析環(huán)境樣品中甲烷氧化菌多樣性的方法，與實時定量PCR技術(shù)結(jié)合使用，可以定量地分析環(huán)境樣品中甲烷氧化菌群落特征。傳統(tǒng)的定量方法——最大釋然法（most-probable-number，MPN）已被用來探測沼澤［30］、濕地［31］、稻田［32］等環(huán)境樣品中的甲烷氧化菌的數(shù)量，但因其取決于特定培養(yǎng)基中甲烷氧化菌的生長情況，具有很大的偏好性。

隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，許多新興的技術(shù)也相繼出現(xiàn)。熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）是利用帶有熒光標(biāo)記的探針與甲烷氧化菌的特征基因序列進(jìn)行雜交，來探測同源的核酸序列，最終來鑒定環(huán)境樣品中甲烷氧化菌的存在及豐度。它具有無需培養(yǎng)和無需單獨分離基因的優(yōu)點，但同時也存在其目標(biāo)物的16S rRNA需為已知的缺點［26］。

穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)（stable isotope probing，SIP）和微生物標(biāo)記物結(jié)合使用，可以有效的分析甲烷氧化菌的群落結(jié)構(gòu)和功能多樣性。這項技術(shù)主要有DNA-SIP［33］、RNA-SIP［34］、磷脂脂肪酸（PLFA）-SIP［35］和最新的mRNA-SIP［36］。PLFA-SIP由于靈敏度高于DNA-SIP，經(jīng)常被用于甲烷氧化菌的檢測。PLFA是活體微生物細(xì)胞膜的重要組分，它在自然生理條件下相對穩(wěn)定，而通常細(xì)胞外的磷脂含量較少，當(dāng)微生物死亡時，磷脂會被迅速代謝［25］。因土壤中不同微生物的特征性PLFA組成和含量有所不同，所以與穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)結(jié)合可以指示特定微生物群落的結(jié)構(gòu)特征與生物量。土壤中Ⅰ型甲烷氧化菌的特征性PLFA以14C-PLFA和16C-PLFA為主，而Ⅱ型甲烷氧化菌則以18C-PLFA 為主［37，38］。但PLFA-SIP方法本身具有一定的局限性，其對微生物種類的判斷主要依賴于樣品PLFA圖譜和已知的純培養(yǎng)甲烷氧化菌PLFA圖譜的比對，難以對環(huán)境樣品中甲烷氧化菌種類進(jìn)行精確的鑒定［39］。

另外，以pmoA為目標(biāo)基因的微陣列（microarray）、基因芯片技術(shù)，也已應(yīng)用于檢測和定量垃圾填埋覆土中的甲烷氧化菌［40，41］，它可以清晰地反映垃圾填埋場在不同深度的空間趨勢。另外，納米二次離子質(zhì)譜（nanoSIMS）［42］、微流體數(shù)字PCR［43］等技術(shù)也被用來探究甲烷氧化菌群的功能特征。

4 填埋土層中甲烷氧化菌活性影響因素

影響垃圾填埋場覆土層甲烷氧化活性的主要因素有土壤成分、含水率、溫度、甲烷及氧氣濃度、NH4+、土壤pH值等。

4.1 土壤成分

增加土壤有機(jī)質(zhì)的含量，可以明顯提高甲烷的氧化活性［44］。因有機(jī)質(zhì)可以為甲烷氧化菌提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)，使其數(shù)量和活性顯著增加［45］。Kightley等［46］通過在填埋覆土中添加富含有機(jī)質(zhì)的活性污泥發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，甲烷氧化能力提高了26%，而添加無機(jī)鹽K2HPO4的覆土，甲烷氧化能力變化不大。同時，有研究表明，有機(jī)質(zhì)含量高的生物覆蓋層與普通的泥沙覆土相比，前者不僅具有較高的甲烷氧化活性，可達(dá)441 μg CH4h-1· g· dw-1，而且甲烷氧化菌的數(shù)量也相對較高［47］。

4.2 含水率

當(dāng)填埋場覆土層含水率達(dá)到最適時，氣體易于擴(kuò)散，微生物活性較高，甲烷氧化活性最高；含水率過高時，甲烷和氧氣在土壤中的擴(kuò)散受到限制，使底物供應(yīng)受阻，從而降低了甲烷氧化能力［48］；含水率過低，則會使甲烷氧化菌的活性降低，其甲烷氧化性能顯著降低［49］。Scheutz［50］認(rèn)為填埋場覆土層中甲烷氧化的最佳含水率在25%左右。而Zhang等［51］研究添加活性污泥的填埋覆土發(fā)現(xiàn)，含水率與甲烷氧化活性呈倒U型關(guān)系，在24%-36%時，達(dá)到最大值。

4.3 溫度

LISP協(xié)議網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)除了將LISP主機(jī)間的互通進(jìn)行考慮外，還對LISP和非LISP主機(jī)間的通信進(jìn)行了考慮。如圖3給出了LISP和非LISP之間互通的整體網(wǎng)絡(luò)架構(gòu)。

一般認(rèn)為甲烷氧化的最適溫度為25-35℃［49］。研究發(fā)現(xiàn)，在2℃時，甲烷氧化作用仍然存在［50，52］，表明即使在冬季甲烷氧化菌仍然可以有效地氧化甲烷，降低垃圾填埋場的甲烷排放量，但冬季垃圾填埋場甲烷的氧化效率要明顯低于夏季。Borjesson［53］發(fā)現(xiàn)，在低溫環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的甲烷氧化菌都屬于I型，表明溫度具有選擇效應(yīng)，可以確定哪種類型的甲烷氧化菌在給定的環(huán)境系統(tǒng)中起主導(dǎo)作用。同時，研究表明填埋場受所處氣候帶的影響，不同氣候帶中甲烷氧化菌的最適溫度也存在差異［54］。

4.4 甲烷及氧氣濃度

填埋場覆土層內(nèi)甲烷和氧氣的分布是由下層甲烷的產(chǎn)生和上層氧氣擴(kuò)散共同影響的。Li等［55］研究了不同濃度的甲烷對覆土層中甲烷氧化菌的影響發(fā)現(xiàn)，當(dāng)甲烷濃度為5.0 ×104ppmv和1.0 ×105ppmv時，甲烷氧化菌的豐富度最高。且隨著甲烷和氧氣濃度的增高，甲烷氧化活性也不斷提高，最大可 達(dá) 98.7 ×1016mol·cell-1·h-1。Pawlowska［56］與He等［57］研究指出，覆土層內(nèi)好氧甲烷氧化速率最大的深度在10-20 cm之間，且隨著深度不斷增加，氧化效率逐漸減小，這應(yīng)與氧氣的濃度減小有關(guān)。

無機(jī)氮 對填埋場覆土層中甲烷氧化效果的影響較為復(fù)雜，正面或負(fù)面的影響都可能存在。現(xiàn)普遍認(rèn)為對甲烷氧化有抑制作用［58，59］，其抑制機(jī)理可能在于和CH4具有相似的分子結(jié)構(gòu)，競爭甲烷氧化菌酶系統(tǒng)相同的位點或降低甲烷氧化酶活性，從而起到抑制甲烷氧化的作用［50］。Vissche等［60］研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)甲烷濃度不同時，起到的作用也不同，低甲烷濃度時，可起到40%的抑制作用，且NH4Cl和（NH4）2SO4的抑制效果也大體一致，高甲烷濃度時，則起到促進(jìn)作用。

4.6 土壤pH值

填埋場覆土層甲烷氧化的最適pH值一般取決于土壤的材料。Zhang［61］通過實驗發(fā)現(xiàn)，在添加了礦化垃圾的覆土中，甲烷氧化最佳pH為6.5-8.0。而甲烷氧化菌在沙質(zhì)脫鈣土壤中要求的pH一般在7以下，最低可到4.5［50］?，F(xiàn)一般認(rèn)為，在自然環(huán)境條件下，甲烷氧化菌氧化甲烷的最佳pH為中性，pH值范圍在6.5-7.5［51］，而純培養(yǎng)時，甲烷氧化菌的最適 宜pH值為6.6-6.8［7］。

填埋場覆土層的植被可以有效提高甲烷氧化效率。原因可能是覆土層植被的根系可疏松土壤，形成氣體傳輸通道，增加氣體擴(kuò)散，從而形成適于甲烷氧化菌生長的環(huán)境來提高其甲烷氧化能力［62］。Bohn等［63］在覆土中種植豆科植物發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，甲烷氧化能力顯著提高，這應(yīng)該與豆科植物的固氮作用有關(guān)，同時，他還認(rèn)為植物的蒸騰作用可以減少垃圾滲濾液，從而調(diào)節(jié)了覆土的含水率。

5 垃圾填埋場的甲烷生物減排

針對垃圾填埋場大部分填埋氣不能有效利用、甲烷排放濃度高等環(huán)境問題，目前除了對甲烷氣體進(jìn)行收集燃燒或作為燃料開發(fā)利用外，研究主要通過生物手段控制甲烷排放，主要包括檢測甲烷氧化優(yōu)勢菌，改良垃圾填埋覆土層以擴(kuò)大甲烷氧化菌培養(yǎng)，抑制產(chǎn)甲烷菌和準(zhǔn)好氧填埋等生物減排技術(shù)。

5.1 填埋土層中的甲烷氧化優(yōu)勢菌的檢測分析

Gebert等［64］利用末端限制性片段長度多態(tài)性分析技術(shù)和微列陣技術(shù)研究了德國5個垃圾填埋場的覆土的甲烷氧化菌的群落結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，甲烷氧化菌的組成在這5個垃圾填埋場的不同填埋深度都基本相似。Ⅱ型甲烷氧化菌中的Methylocystis和Ⅰ型甲烷氧化菌中的Methylobacter和Methylococcus為優(yōu)勢菌屬，這與Stralis-Pavese等［41，65，66］的研究結(jié)果較為一致。而Chang等［67］通過借助pmoA的基因芯片技術(shù)研究種植不同植物的垃圾填埋土發(fā)現(xiàn)，Ⅹ型甲烷氧化菌Methylocaldum占主導(dǎo)作用，而Methylocystis在種植光棍樹（milk bush）的深層土壤中為優(yōu)勢菌。另外，Singh等［68］研究發(fā)現(xiàn)Ⅰ型甲烷氧化菌在種植牧草的垃圾覆土中占主導(dǎo)作用，Ⅱ型甲烷氧化菌在種植灌木林的垃圾覆土中發(fā)揮重要作用 。這可能與Ⅰ型甲烷氧化菌對氧濃度更加敏感，更喜歡高氧濃度，而Ⅱ型甲烷氧化菌對甲烷濃度更敏感，更適應(yīng)于高甲烷濃度下生長有關(guān)。Lee等［69］研究了實驗室模擬垃圾填埋生物覆蓋層的甲烷氧化菌，在不同深度土層的樣品中，利用熒光定量PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)甲烷氧化菌的數(shù)量無顯著差異。在上層（0-10 cm）樣品中，I型和II型甲烷氧化菌都發(fā)揮重要作用，而在中層（10-40 cm）和底層（40-50 cm）樣品中，I型比II型甲烷氧化菌更占主導(dǎo)地位。

5.2 甲烷氧化菌的強(qiáng)化

根據(jù)已知的影響填埋土層中甲烷氧化菌的活性因素，在填埋覆土層添加礦化垃圾、活性污泥等可以有效地強(qiáng)化甲烷氧化菌的生物活性，加快甲烷的氧化速度［70，71］。礦化垃圾是在填埋場中填埋多年，基本達(dá)到穩(wěn)定化，已可進(jìn)行開采利用的垃圾，在長期的生物降解過程中，其表面附著了數(shù)量龐大、種類繁多、代謝能力極強(qiáng)的微生物群落。因其本身富含甲烷氧化菌（1.25×108-1.25×109CFU/g），且成本低、氧化效果明顯，并可增加再生填埋庫容，使填埋場空間循環(huán)利用，所以是甲烷氧化覆蓋層的一種很好材料［72］。Lou等［73］通過實驗發(fā)現(xiàn)，添加礦化垃圾和活性污泥，甲烷去除率分別可達(dá)78.7%和66.9%，且發(fā)現(xiàn)當(dāng)用14年以上的礦化垃圾處理時，效果最好。Zhang等［51］研究發(fā)現(xiàn)，以6∵4的比例添加礦化垃圾和活性污泥到覆土中，甲烷氧化效率可達(dá)到最佳。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)粉煤灰、陶粒等材料含水率低、孔穴豐富、比表面積大的優(yōu)點［74］，可添加到礦化垃圾和活性污泥中，配合使用來增強(qiáng)甲烷氧化效果。另外，種植植物也是改良填埋覆土的一種有效方法，目前填埋場覆土種植的植物主要集中在芒草、苜蓿和楊樹等［63，65，75］。有研究發(fā)現(xiàn)，利用礦化垃圾中的硫酸鹽還原菌進(jìn)行甲烷的共氧化是甲烷自然減排的另一種途徑［76］。

甲烷 氧化菌除了能夠氧化甲烷作為生長所必需的碳源和能量外，由于甲烷單加氧酶的底物非特異性，使得還可以氧化一些碳?xì)浠衔锛安糠蛀u代烴。因垃圾填埋氣中除了甲烷和二氧化碳外，還有約占填埋氣總體積1%的各種非甲烷有機(jī)氣體，如氯乙烯、苯及甲苯等，且大多有毒。所以甲烷氧化菌的這一性質(zhì)對于垃圾填埋氣中非甲烷有機(jī)氣體的去除也有著重要意義。另外，對甲烷氧化菌的開發(fā)利用也取得了一定進(jìn)展，有報道利用甲烷氧化混合菌合成聚β-羥基丁酸酯（PHB）［77］（一種生物可降解的仿生塑料）、利用混合菌為催化劑實現(xiàn)丙烯氧化生產(chǎn)環(huán)氧丙烷［78］、去除水體中的污染 物三氯乙烯［79］以及廢水脫氮［80］等。

5.3 產(chǎn)甲烷菌的抑制

與甲烷氧化菌不同，產(chǎn)甲烷菌是一類能夠?qū)⒂袡C(jī)或無機(jī)化合物經(jīng)厭氧消化作用轉(zhuǎn)化成甲烷和二氧化碳的古細(xì)菌，為嚴(yán)格厭氧菌，生存條件較為苛刻，也是垃圾填埋場甲烷氣體的主要生產(chǎn)菌。目前，研究主要通過添加甲烷抑制劑多為多鹵素化合物，如氯代甲烷、三氯乙炔、溴氯甲烷等抑制產(chǎn)甲烷菌的代謝活性，從而減少甲烷釋放量。Zhao等［81］通過餐廚垃圾厭氧發(fā)酵過程中甲烷抑制的實驗發(fā)現(xiàn)，同樣濃度的二氯甲烷、氯仿和四氯化碳，氯仿的抑制作用要遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于二氯甲烷和四氯化碳。當(dāng)濃度都為20 mg/kg時，氯仿對甲烷的抑制率可達(dá)到98.1%，而四氯化碳和二氯甲烷的抑制率分別為42.7%和43.2%。雖然，鹵素化合物對產(chǎn)甲烷菌有較好的抑制作用，但因其本身具有毒性，實際應(yīng)用時，還具有一定局限性。對填埋場進(jìn)行好氧通風(fēng)也是抑制微生物產(chǎn)甲烷的有效途徑之一，準(zhǔn)好氧填埋是代表性的技術(shù)之一［82］。準(zhǔn)好氧填埋是通過滲濾液收集管的不滿流設(shè)計，在填埋場內(nèi)外溫差的作用下使空氣自然通過滲濾液收集管末端進(jìn)入填埋場，從而使得垃圾內(nèi)部部分區(qū)域處于好氧狀態(tài)，使垃圾降解的速度得到提高，并且減少了甲烷的排放［72］。

6 結(jié)語

甲烷氧化菌在甲烷減排、全球溫室氣體控制及碳、氮、硫等元素的地球生物化學(xué)循環(huán)中都起到了非常重要的作用。垃圾填埋領(lǐng)域的甲烷氧化研究正在受到越來越 廣泛的關(guān)注。目前國內(nèi)外對于甲烷氧化菌的研究主要集中在好氧甲烷氧化菌、氧化機(jī)理、填埋場覆土應(yīng)用等方面，以下幾方面還有待進(jìn)一步的探索。

6.1 垃圾填埋甲烷氧化復(fù)合微生物菌劑研究

微生物菌劑在促進(jìn)有機(jī)物發(fā)酵、除臭、降解污染物等方面具有廣泛的應(yīng)用，但目前還沒有甲烷氧化菌的復(fù)合微生物菌劑的應(yīng)用。在傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法中，甲烷氧化菌生長非常緩慢、細(xì)胞密度低、發(fā)酵周期較長，很難滿足工業(yè)上的大規(guī)模生產(chǎn)。這就需要對甲烷氧化菌的培養(yǎng)工藝進(jìn)行更深入的研究，強(qiáng)化氧氣、甲烷傳遞速率，提高甲烷氧化菌的生長速度和酶活穩(wěn)定性，為開發(fā)處理甲烷的微生物菌劑奠定基礎(chǔ)。另外，除臭菌劑主要是靠微生物降解作用去除NH3，即以的形態(tài)被微生物吸收，作為營養(yǎng)物質(zhì)通過新陳代謝作用為微生物所分解、利用，最終將其氧化分解為等。而和CH4因具有相似的分子結(jié)構(gòu)，可以競爭甲烷氧化菌酶系統(tǒng)相同的位點或降低甲烷氧化酶活性，起到抑制甲烷氧化作用，所以可利用除氨氣的微生物和甲烷氧化菌相結(jié)合，開發(fā)同時處理甲烷與氨氣的復(fù)合微生物菌劑，以解決垃圾填埋場溫室氣體排放和惡臭污染的問題。

6.2 甲烷氧化菌的互生關(guān)系研究及其應(yīng)用

目前已有研究表明，甲烷氧化菌同氨氧化菌、填埋土表面植物之間存在某種互生關(guān)系，例如氨氧化菌可以削減以減少其對甲烷氧化功能的抑制，填埋土表面植物可以為甲烷氧化菌提供必要的好氧環(huán)境。目前常規(guī)的實驗技術(shù)手段和方法，較難分離得到純種甲烷氧化菌，這可能預(yù)示著在土壤生態(tài)系中，甲烷氧化菌與其他生物或環(huán)境之間存在著密切的依存關(guān)系，它們對甲烷的協(xié)同作用，降解機(jī)理還不是十分清楚。在未來的研究中，分子技術(shù)、同位素示蹤等新的研究手段，有望進(jìn)一步解析甲烷氧化菌同其他微生物或植物間的互生、共生、拮抗關(guān)系，對于掌握其耦合作用機(jī)制，提升甲烷協(xié)同氧化能力，具有非常重要的理論和應(yīng)用價值。

6.3 厭氧型甲烷氧化菌的機(jī)理與應(yīng)用研究

生活垃圾填埋場堆體內(nèi)部主要是厭氧環(huán)境，而厭氧是甲烷產(chǎn)生和釋放的必要條件。目前除了通過管道通風(fēng)換氣，抑制厭氧發(fā)酵甲烷的產(chǎn)生，同時促進(jìn)好氧甲烷氧化菌對甲烷的分解外，則主要通過好氧型甲烷氧化菌及填埋層覆土材料的選擇與工程優(yōu)化等方面進(jìn)行綜合甲烷減排。厭氧甲烷氧化菌的作用機(jī)理研究剛剛起步，也僅有較少的菌株被篩選出來。有研究表明，厭氧甲烷氧化古菌可參與到有機(jī)廢水的“反硝化”過程，為反硝化細(xì)菌還原和提供電子和所需物質(zhì)等，幫助其最終完成反硝化過程，亦可達(dá)到甲烷減排的目的。因此，厭氧甲烷氧化菌在填埋場的工程應(yīng)用研究同樣具有一定的開發(fā)前景。

［1］IPCC. Climate Change 2007：the Physical Science Basis. Contribution of Working Group I to the Fourth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change［M］. Cambridge and New York：Cambridge University Press, 2007.

［2］Kirschke S, Bousquet P, Ciais P, et al. Three decades of global methane sources and sinks［J］. Nature Geoscience, 2013, 6（10）：813-823.

［3］Conrad R. The global methane cycle：recent advances in understanding the microbial processes involved［J］. Environmental Microbiology Reports, 2009, 1（5）：285-292.

［4］Albanna M, Warith M, Fernandes L. Kinetics of biological methane oxidation in the presence of non-methane organic compounds in landfill bio-covers［J］. Waste Manage, 2010, 30（2）：219-227.

［5］Aronson E, Allison S, Helliker BR. Environmental impacts on the diversity of methane-cycling microbes and their resultant function［J］. Frontiers in Microbiology, 2013, 4：225.

［6］梅娟, 趙由才. 填埋場甲烷生物氧化過程及甲烷氧化菌的研究進(jìn)展［J］. 生態(tài)學(xué)雜志, 2014, 33（9）：2567-2573.

［7］Hanson RS, Hanson TE. Methanotrophic bacteria［J］. Microbiological Reviews, 1996, 60（2）：439-471.

［8］贠娟莉, 王艷芬, 張洪勛. 好氧甲烷氧化菌生態(tài)學(xué)研究進(jìn)展［J］.生態(tài)學(xué)報, 2013, 33（21）：6774-6785.

［9］Semrau JD, Dispirito AA, Yoon S. Methanotrophs and copper［J］. FEMS Microbiology Reviews, 2010, 34（4）：496-531.

［10］Dunfield PF, Yuryev A, Senin P, et al. Methane oxidation by an extremely acidophilic bacterium of the phylum Verrucomicrobia［J］. Nature, 2007, 450（7171）：879-882.

［11］Pol A, Heijmans K, Harhangi HR, et al. Methanotrophy below pH 1 by a new Verrucomicrobia species［J］. Nature, 2007, 450（7171）：874-878.

［12］Islam T, Jensen S, Reigstad LJ, et al. Methane oxidation at 55℃and pH 2 by a thermoacidophilic bacterium belonging to the Verrucomicrobia phylum［J］. Proce Natl Acad Sci USA, 2008, 105（1）：300-304.

［13］Op den Camp HJ, Islam T, Stott MB, et al. Environmental genomic and taxonomic perspectives on methanotrophic Verrucomicrobia［J］. Environmental Microbiology Reports, 2009, 1（5）：293-306.

［14］van Teeseling MC, Pol A, Harhangi HR, et al. Expanding the verrucomicrobial methanotrophic world：description of three novel species of Methylacidimicrobium gen. nov［J］. Applied and Environmental Microbiology, 2014, 80（21）：6782-6791.

［15］Kalyuzhnaya MG, Puri AW, Lidstrom ME. Metabolic engineering in methanotrophic bacteria［J］. Metab Eng, 2015, 29：142-152.

［16］Deutzmann JS, Hoppert M, Schink B. Characterization andphylogeny of a novel methanotroph, Methyloglobulus morosus gen. nov., spec. nov.［J］. Syst Appl Microbiol, 2014, 37（3）：165-169.

［17］Tavormina PL, Hatzenpichler R, McGlynn S, et al. Methyloprofundus sedimenti gen. nov., sp. nov., an obligate methanotroph from ocean sediment belonging to the'deep sea-1'clade of marine methanotrophs［J］. Int J Syst Evol Microbiol, 2015, 65（1）：251-259.

［18］Hirayama H, Abe M, Miyazaki M, et al. Methylomarinovum caldicuralii gen. nov., sp. nov., a moderately thermophilic methanotroph isolated from a shallow submarine hydrothermal system, and proposal of the family Methylothermaceae fam. Nov［J］. Int J Syst Evol Microbiol, 2014, 64（3）：989-999.

［19］Hoefman S, van der Ha D, Iguchi H, et al. Methyloparacoccus murrellii gen. nov., sp. nov., a methanotroph isolated from pond water［J］. Int J Syst Evol Microbiol, 2014, 64（6）：2100-2107.

［20］Theisen AR, Ali MH, Radajewski S, et al. Regulation of methane oxidation in the facultative methanotroph Methylocella silvestris BL2［J］. Molecular Microbiology, 2005, 58（3）：682-692.

［21］Semrau JD, DiSpirito AA, Vuilleumier S. Facultative methanotrophy：falseleads, true results, and suggestions for future research. FEMS Microbiology Letters, 2011, 323（1）：1-12.

［22］Dunfield PF, Dedysh SN. Methylocella：a gourmand among methanotrophs［J］. Trends Microbiol, 2014, 22（7）：368-369.

［23］Murrell JC, Gilbert B, McDonald IR. Molecular biology and regulation of methane monooxygenase［J］. Archives of Microbiology, 2000, 173（5-6）：325-332.

［24］Chang Y S, HaIsey JL. Detection of methanotrophs in groundwater by PCR［J］. Applied and Environmental Microbiology, 1999, 65（2）：648-651.

［25］黃夢青, 張金鳳, 楊玉盛, 等. 土壤甲烷氧化菌多樣性研究方法進(jìn)展［J］. 亞熱帶資源與環(huán)境學(xué)報, 2013, 8（2）：42-48.

［26］McDonald IR, Bodrossy L, Chen Y, et al. Molecular ecology t echniques for the study of aerobic methanotrophs［J］. Applied and Environmental Microbiology, 2008, 74（5）：1305-1315.

［27］McDonald IR, Murrell JC. The methanol dehydrogenase structural gene mxaF and its use as a functional gene probe for methanotrophs and methylotrophs［J］. Applied and Environmental Microbiology, 1997, 63（8）：3218-3224.

［28］Auman AJ, Speake CC, Lidstrom M E. nifH sequences and nitrogen fixation in type I and typeII methanotrophs［J］. Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67（9）：4009-4016.

［29］Dedysh SN, Ricke P, Liesack W. NifH and NifD phylogenies：an evolutionary basis for understanding nitrogen fixation capabilities of methanotrophic bacteria［J］. Microbiology, 2004, 150（5）：1301-1313.

［30］Daniel NM, Joseph BY, Eugene LM, et al. Methanotrophic activity, abundance, and diversity in forested swamp pools：dynamics and influences on methane fluxes［J］. Geomicrobiology Journal, 2004, 21（4）：257-271.

［31］Horz HP, Raghubanshi AS, Heyer J, et al. Activity and community structure of methane-oxidizing bacteria in a wet meadow soil［J］. FEMS Microbiology Ecology, 2002, 41（3）：247-257.

［32］Bosse U, Frenzel P. Activity and distribution of methane oxidizing bacteria in flooded rice soil microcosms and in rice plants（Oryzasativa）［J］. Applied and Environmental Microbiology, 1 997, 63（4）：1199-1207.

［33］Radajewski S, Ineson P, Parekh NR, et al. Stable-isotope probing as a tool in microbial ecology［J］. Natur e, 2000, 403（6770）：646-649.

［34］Manefield M, Whiteley AS, Griffiths RI, et al. RNA stable isotope probing, a novel means of linking microbial community function to phylogeny［J］. Applied and Environmental Microbiology, 2002, 68（11）：5367-5373.

［35］Bull ID, Parekh NR, Hall GH, et al. Detection and classification of atmospheric methane oxidizing bacteria in soil［J］. Nature, 2000, 405（6783）：175-178.

［36］Dumont MG, Pommerenke B, Casper P, et al. DNA-, rRNA-and mRNA-based stable isotope probing of aerobic methanotrophs in lake sediment［J］. Environme ntal Microbiology, 2011, 13（5）：1153-1167.

［37］Bowman JP, Sly LI, Nichols PD, et al. Revised taxonomy of the methanotrophs：Description of Me thylobacter gen. nov. emendation of Methylococcus, validation of Methylosinus and Methylocystis species, and a proposal that the family Methylococcaceae includes only the group I methanotrophs［J］. Int J Syst Bacteriol, 1993, 43（4）：735-753.

［38］Dedysh SN, Khmelenina VN, Suzina NE, et al. Methylocapsa acidiphila gen. nov., sp. nov., a novel methane-oxidizing and dinitrogen-fixing acidophilic bacterium from Sphagnum bog［J］.Int J Syst Bacteriol, 2002, 52（1）：251-261.

［39］蔡元鋒, 賈仲君. 土壤大氣甲烷氧化菌研究進(jìn)展［J］. 微生物學(xué)報, 2014, 54（8）：841-853.

［40］Cebron A, Bodrossy L, Stralis-Pavese N, et al. Nutrient amendments in soil DNA stable isotope probing experiments reduce the observed methanotroph diversity［J］. Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73（3）：798-807.

［41］Stralis-Pavese N, Sessitsch A, Weilharter A, et al. Optimization of diagnostic microarray for application in analyzing landfill methanotroph communities under different plant covers［J］. Environmental Microbiology, 2004, 6（4）：347-363.

［42］Li TL, Wu TD, Mazéas L, et al. Simultaneous analysis of microbial identity and function using NanoSIMS［J］. Environmental Microbiology, 2008, 10（3）：580-588.

［43］Hashsham SA, Gulari E, Tiedje JM. Microfluidic systems being adapted for microbial, molecular biological analyses［J］. Microbe-American Society for Microbiology, 200 7, 2（11）：531-536.

［44］Sadasivam BY, Reddy KR. Landfill methane oxidation in soil and bio-based cover systems：a review［J］. Reviews in Environmental Science and Bio/ Technology, 2014, 13（1）：79-107.

［45］Scheutz C, Mosbaek H, Kjeldsen P. Attenuation of methane and volatile organic compounds in landfi ll soil covers［J］. Journal of Environmental Quality, 2004, 33（1）：61-71.

［46］Kightley D, Nedwell DB, Cooper M. Capacity for methane oxidation in landfill cover soils measured in laboratory sca le soil microcosms［J］. Appl Environ Microbiol, 1995, 61（2）：592-601.

［47］Ait-Benichou S, Jugnia LB, Greer CW, et al. Methanotrophs and methanotrophic activity in engineered landfill biocovers［J］. Waste Management, 2009, 29（9）：2509-2517.

［48］Cabral AR, Tremblay P, Lefebvre G. Determination of the diffusion coefficient of oxygen for a cover system including a pulp and paper by-product［J］. Geotechnical Testing Journal, 2004, 27（2）：184-197.

［49］Scheutz C, Kjeldsen P, Bogner JE, et al. Microbial methane oxidation processes and technologies for mitigation of landfill gas emissions［J］. Waste Management Research, 2009, 27（5）：409-455.

［50］Scheutz C, Kjeldsen P. Environmental factors influencing attenuation of methane and hydrochlorofluorocarbons in landfill cover soils［J］. J Environ Qual, 2004, 33（1）：72-79.

［51］Zhang HH, Yan XF, Cai BC, et al. The effects of aged refuse and sewage sludge on landfill CH4oxidation and N2O emissions：Roles of moisture content and temperature［J］. Ecological Engineering, 2015, 74：345-350.

［52］Christophersen M, Linderod L, Jensen PE, et al. Methane oxidation at low temperatures in soil exposed to landfill gas［J］. Journal of Environmental Quality, 2000, 29（6）：1989-1997.

［53］Borjesson G, Sundh I, Svensson B. Microbial oxidation of CH4at different temperatures in landfill cover soils［J］. FEMS Microbiology Ecology, 2004, 48（3）：305-312.

［54］Christopherson M, Kjeldsen P, Holst H, et al. Lateral gas transport in soil adjacent to an old landfill：Factors governing emissions and methane oxidation［J］. Waste Management and Research, 2001, 19（6）：595-612.

［55］Li H, Chi ZF, Lu WJ, et al. Sensitivity of methanotrophic community structure, abundance, and gene expression to CH4and O2in simulated landfill biocover soil［J］. Environmental Pollution, 2014, 184：347-353.

［56］Pawlowska M, Stepniewski W. Biochemical reduction of methane emissions from landfills［J］. Environmental Engineering Science, 2006, 23（4）：666-672.

［57］He PJ, Yang N, Fang WJ, et al. Interaction and independence on methane oxidation of landfill cover soil among three impact factors：water, oxygen and ammonium［J］. Frontiers of Environmental Science and Engineering in China, 2011, 5（2）：175-185.

［58］Bender M, Conrad R. Microbial oxidation of methane, ammonium and carbon monoxide, and turnover of nitrous oxide and nitric oxide in soils［J］. Biogeochemistry, 1994, 27（2）：97-112.

［59］King GM, Schnell S. Ammonium and nitrite inhibition of methane oxidation by Methylobacter albus BG8 and Methylosinus trichosporium OB3b at low methane concentrations［J］. Applied and Environmental Microbiology, 1994, 60（10）：3508-3513.

［60］Visscher AD, Cleemput OV. Induction of enhanced CH4oxidation in soilsinhibition patterns［J］. Soil Biology and Biochemistry, 2003, 35（7）：907-913.

［61］Zhang HH, Li WX, Cai ZC, et al. Landfill CH4oxidation and N2O emissions by aged refuse：effects of wastewater-N incubation,heavy metals and pH［J］. Ecological Engineering, 2013, 53：243-249.

［62］Keppler F, Hamilton JT, Brass M, et al. Methane emissions from terrestrial plants under aerobic conditions［J］. Nature, 2006, 439（7073）：187-191.

［63］Bohn S, Brunke P, Gebert J, et al. Improving the aeration of critical fine-grained landfill top cover material by vegetation to increase the microbial methane oxidation efficiency［J］. Waste Management, 2011, 31（5）：854-863.

［64］Gebert J, Singh BK, Pan Y, et al. Activity and structure of methanotrophic communities in landfill cover soils［J］. Environmental Microbiology Reports, 2009, 1（5）：414-423.

［65］Stralis-Pavese N, Bodrossy L, Reichenauer TG, et al. 16S rRNA based T-RFLP analysis of methane oxidising bacteria：assessment, critical evalultion of methodology performance and application for landfill site cover soils［J］. Applied Soil Ecology, 2006, 31（3）：251-266.

［ 66］Hery M, Singer AC, Kumaresan D, et al. Effect of earthworms on the community structure of active methanotrophic bacteria in a landfill cover soil［J］. The ISME Journal, 2008, 2（1）：92-104.

［67］Chang CY, Tung HH, Tseng IC, et al. Dynamics of methanotrophic communities in tropical alkaline landfill upland soil［J］. Applied Soil Ecology, 2010, 46（2）：192-199.

［68］Singh BK, Tate KR, Kolipaka G, et al. Effect of afforestation and reforestation of pastures on the activity and population dynamics of methanotrophic bacteria［J］. Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73（16）：5153-5161.

［69］Lee EH, Moon KE, Kim TG, et al. Depth profiles of methane oxidation potentials and methanotrophic community in a lab-scale biocover［J］. Journal of Biotechnology, 2014, 184：56-62.

［70］Han D, Zhao YC, Xue BJ, et al. Effect of bio-column composed of aged refuse on methane abatement-A novel configuration of biological oxidation in refuse landfill［J］. Journal of Environmental Sciences, 2010, 22（5）：769-776.

［71］Contin M, Goi D, Nobili MD. Land application of aerobic sewage sludge does not impair methane oxidation rates of soils［J］. Science of the Total Environment, 2012, 441：10-18.

［72］趙由才, 趙天濤, 韓丹, 等. 生活垃圾衛(wèi)生填埋場甲烷減排與控制技術(shù)研究［J］. 環(huán)境污染與防治, 2009, 31（12）：48-52.

［73］Lou ZY, Wang L, Zhao YC. Consuming un-captured methane from landfill using aged refuse bio-cover［J］. Bioresource Technology, 2011, 102（3）：2328-2332.

［74］Wang JM, Ban H, Teng XJ, et al. Impacts of pH and ammonia on the leaching of Cu（Ⅱ）and Cd（Ⅱ）from coal fly ash［J］. Chemosphere, 2006, 64（11）：1892-1898.

［75］Reichenauer TG, Watzinger A, Riesinga J, et al. Impact of different plants on the gas profile of a landfill cover［J］. Waste Management, 2011, 31（5）：843-853.

［76］韓丹, 石峰, 柴曉利, 等. 生活垃圾填埋場甲烷自然減排的新途徑：厭氧與好氧的共氧化作用［J］. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2011, 31（4）：791-797.

［77］Rostkowski KH, Pfluger AR, Criddle CS. Stoichiometry and kinetics of the PHB-producing Type II methanotrophs Methylosinus trichosporium OB3b and Methylocy stis parvus OBBP［J］. Bioresource Technology, 2013, 132：71-77.

［78］Xin JY, Cui JR, Chen JB. Continuous biocatalytic synthesis of epoxypropane using a biofilm reactor［J］. Process Biochemistry, 2003, 38（12）：1739-1746.

［79］van Hylckama Vlieg JE, Janssen DB. Formation and detoxification of reactive intermediates in the metabolism of chlorinated ethenes［J］. Journal of Biotechnology, 2001, 85（2）：81-102.

［80］Zhu GB, Jetten MSM, Kuschk P, et al. Potential roles of anaerobic ammonium and methane oxidation in the nitrogen cycle of wetland ecosystems［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 86：1043-1055.

［81］Zhao TT, Zhang LJ, Chen HQ, et al. Co-inhib ition of methanogens for methane mitigation in biodegradable wastes［J］. Journal of Environmental Sciences, 2009, 21（6）：827-833.

［82］Chong TL, Matsufuji Y, Hassan MN. Implementation of the semi-aerobic landfill system（Fukuoka method）in developing countries：A Malaysia cost analysis［J］. Waste Management, 2005, 25（7）：702-711.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Progress on Methanotrophic Bacteria in Landfills and the Reduction of Methane Emission

As the main source of anthropogenic methane emission，landfills globally produce 35-69 Tg methane per year. The technology of reducing the methane emission in landfills has become a hot topic at present. Methanotrophic bacteria decomposing methane are the important biological collection to reduce atmospheric methane emissions，which is of significance in keeping the balance of the methane concentration in the atmosphere. Starting from the taxonomy and characteristics of methanotrophic bacteria，and the mechanism of its oxidizing methane，we summarized the latest research progress on the methods of studying diversity，factors affecting the activities of methanotrophic bacteria in landfills，and applications of them in the biological reduction of methane emission. Based on the prior researches，the issues in current studies of methanotrophic bacteria are also discussed. We propose comprehensive measures of utilizing the complex microbial agents of methanotrophic bacteria in landfills，providing a new thought in the research and application of reducing methane emission in landfills.

landfill；methane；methanotrophic bacteria；greenhouse gas；biological reduction

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.003

2015-07-28

國家自然科學(xué)基金項目（41201579，J1103516，31093440，31493010，31493011），中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項基金項目（TD2012-03）

王曉琳，女，碩士研究生，研究方向：環(huán)境微生物；E-mail：yexiayuan@126.com

趙國柱，男，博士，研究方向：資源與環(huán)境微生物；E-mail：zhaogz@im.ac.cn

WANG Xiao-lin1CAO Ai-xin2ZHOU Chuan-bin2ZHAO Kai-ning1ZHAO Guo-zhu1

（1. College of Biological Sciences and Biotechnology，Beijing Forestry University，Beijing 100083；2. State Key Laboratory of Urban and Region Ecology，Research Center for Eco-Environmental Sciences，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100085）