閆曉波，李晨燁，王 爽，玄明文

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干擾素-β對星形膠質(zhì)細胞形態(tài)學及蛋白的影響

閆曉波，李晨燁，王 爽，玄明文

［摘要］目的 觀察不同含量干擾素-β（interferon-β，IFN-β）作用不同時間，對體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞（astrocytes，AS）的生長狀態(tài)、細胞形態(tài)、細胞連接變化、細胞骨架及細胞彈性相關蛋白表達影響，從而研究內(nèi)源性IFN-β對AS的免疫調(diào)節(jié)作用，探討AS作為多發(fā)性硬化治療新靶點的可行性。方法 體外培養(yǎng)AS，將培養(yǎng)的AS分為對照組和實驗組，其中實驗組根據(jù)IFN-β不同的含量（102U/ mL和103U/ mL）及不同的作用時間24、48、72 h分為6組。通過免疫熒光進行AS鑒定并觀察細胞形態(tài)變化。利用原子力顯微鏡觀察細胞形態(tài)，電鏡觀察細胞連接，四甲基偶氮唑鹽比色法檢測IFN-β對細胞生長情況的影響。蛋白質(zhì)印跡法觀察細胞結(jié)構(gòu)及細胞彈性相關蛋白，即膠質(zhì)纖維酸性蛋白、β-肌動蛋白、波形蛋白、絲切蛋白-1、抑制蛋白-1的表達情況。結(jié)果 在不同時間、不同含量IFN-β作用下，AS的形態(tài)及數(shù)量無明顯變化。但隨著作用時間延長、IFN-β含量增加，細胞連接增多，細胞骨架及細胞彈性相關蛋白表達也呈現(xiàn)出與IFN-β含量及作用時間的正相關。結(jié)論 在IFN-β作用下AS彈性及韌性增強、細胞突觸增加、細胞連接更加緊密，對調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)血腦屏障的通透性有著重要的意義，在防止中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘中起到了重要的作用。雖然IFN-β對AS增殖無明顯影響，但膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達增加，提示膠質(zhì)細胞增生，可能導致病理性斑塊的產(chǎn)生，從而影響IFN-β治療的效果。

［關鍵詞］多發(fā)性硬化；干擾素-β；星形膠質(zhì)細胞；相關蛋白；中樞神經(jīng)系統(tǒng)

［作者單位］150086黑龍江哈爾濱，哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（閆曉波，王 爽），干部病房（李晨燁）；150086黑龍江哈爾濱，哈爾濱醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（玄明文）

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種由T細胞介導的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）自身免疫性脫髓鞘疾病，其臨床表現(xiàn)具有神經(jīng)系統(tǒng)功能進行性喪失、年輕人易患、臨床表現(xiàn)多樣，病程較長、多部位受累、最終導致嚴重殘疾的特點［1］。目前對MS的研究多集中在效應T細胞上，對固有細胞研究甚少。作為CNS中含量最多的星形膠質(zhì)細胞（astrocytes，AS）在MS的發(fā)病過程中起到了重要的作用。有研究表明，在效應細胞發(fā)揮作用前必須通過血腦屏障（blood brain barrier，BBB）進入CNS發(fā)揮作用［2］。AS作為BBB的固有組成部分，其活化后具有介導細胞信號轉(zhuǎn)導、抗原呈遞作用，從而影響細胞遷移。但MS發(fā)病過程中，AS增生，膠質(zhì)斑塊的形成又可以加重MS的病情［3-4］。由此可見AS的調(diào)節(jié)及形態(tài)在MS的發(fā)病過程中具有重要的作用。有研究表明，干擾素-α可以抑制病理性斑塊的形成［5］。但作為治療MS的常用干擾素-β （interferon-β，IFN-β）在調(diào)節(jié)CNS膠質(zhì)斑塊形成中研究甚少。IFN-β是由炎癥或病毒誘導因素刺激成纖維細胞產(chǎn)生的一種糖蛋白，不但可以抑制T細胞活化和增殖，促進自身反應性T細胞的凋亡，誘導調(diào)節(jié)性T細胞生成，抑制白細胞穿過BBB，而且可以調(diào)節(jié)AS細胞形態(tài)加強BBB的選擇透過性，從而起到對MS的治療作用［6-7］。但是部分患者，長期應用IFN-β后，則出現(xiàn)對IFN-β的敏感性降低，甚至病情加重的情況［8］。因此，本實驗通過觀察IFN-β對AS的形態(tài)及結(jié)構(gòu)彈性相關蛋白的影響，研究IFN-β 對AS作用時AS的變化，為探索MS治療的新靶點提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗動物 出生1～2 d的SD乳鼠，來源于哈爾濱醫(yī)科大學動物實驗中心［SCXK-（黑）-2013-0001）］。

1.2方法

1.2.1實驗分組 將體外培養(yǎng)的AS分為對照組及實驗組。將實驗組根據(jù)INF-β的不同含量（102U/ mL、103U/ mL）及不同作用時間點（24、48、72 h）分為6組。

1.2.2實驗方法

1.2.2.1原代AS培養(yǎng) 選用新生（1～2 d）SD大鼠，將其大腦皮質(zhì)組織切碎、攪拌、過濾、離心、沉淀以準備標志的細胞懸液，取5×106/ mL于玻璃瓶內(nèi)進行培養(yǎng)，于第10天行震蕩提純，在膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）免疫熒光檢測下細胞陽性率為90%。

1.2.2.2原子力顯微鏡 培養(yǎng)細胞貼壁，以相應含量取INF-β于相應時間分別滴加至各組。將實驗細胞與戊二醛混合固定1 h。在原子力顯微鏡下觀察并記錄細胞形狀及彈性的變化。

1.2.2.3電子顯微鏡 培養(yǎng)細胞貼壁，以相應含量取INF-β于相應時間分別滴加至各組。在不同的作用時間點，細胞被磷酸鹽緩沖液以每次5 min、洗滌3次后與戊二醇混合固定1 h。在掃描鏡下觀察細胞的形態(tài)學改變并記錄。將細胞傳代，分別接種于培養(yǎng)瓶中，待該批培養(yǎng)瓶中細胞生長狀況基本相同時，將培養(yǎng)瓶分組，并分別加入不同含量的IFN-β作用不同時間。待達到作用時間后，分別將各組的AS用細胞刮刮下，并收集到離心管中，與戊二醛混合固定1 h。透射電鏡觀察細胞器結(jié)構(gòu)及細胞連接變化。

1.2.2.4四甲基偶氮唑鹽比色法觀察IFN-β對AS促進或抑制細胞增殖作用 顯微鏡下觀察AS，細胞生長狀態(tài)好，無污染。用胰蛋白酶消化細胞，用含10%胎牛血清的達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基制成單細胞懸液。以每孔5×103個細胞接種于96孔板中，每孔加培養(yǎng)液200 μL。將培養(yǎng)板移入CO2孵育箱，在5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)。待細胞貼壁生長后，按照不同含量IFN-β作用不同時間，分別設為對照組、102U/ mL組及103U/ mL組，每組作用時間分別為24、48、72 h。為防止細胞生長情況存在誤差，每個實驗項均設3個副孔。待達到IFN-β作用時間后，每孔加入四甲基偶氮唑鹽溶液（5 mg/ mL）20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入150 μL二甲基亞砜，振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解。選擇492 nm波長，在酶標儀上測定各孔光密度（optical density，OD）值。以加IFN-β含量為變量、時間為橫軸、OD值為縱軸繪制細胞生長曲線。

1.2.2.5免疫印跡檢測相關蛋白 通過免疫印跡法觀察細胞彈性相關蛋白，包括GFAP、β-肌動蛋白、波形蛋白、絲切蛋白-1和抑制蛋白-1。凝膠成像分析：圖像瀏覽或拍照，凝膠圖像處理系統(tǒng)被作為評估相對分子質(zhì)量和光學密度的靶帶。以灰度值判定雜交帶的漸變分級，且β-肌動蛋白雜交帶的灰度值被作為校準的內(nèi)部標準。為保證實驗結(jié)果的真實性，從每組選擇3個實驗數(shù)據(jù)。

1.3統(tǒng)計學處理 應用SPSS 13.0軟件，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，P＜0. 05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1IFN-β對AS形態(tài)學影響 AS可用胞質(zhì)與胞核同等均一染色的方法界定。90%的細胞為GFAP陽性的AS。各組的細胞形態(tài)及數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義。102U/ mL與103U/ mL IFN-β影響72 h后的細胞內(nèi)顯微結(jié)構(gòu)在免疫熒光檢驗法鏡下更為鮮明，并且細胞連接更為緊密（圖1）。

在原子力顯微鏡下，可以清晰地發(fā)現(xiàn)IFN-β影響72 h后的細胞生態(tài)學結(jié)構(gòu)明顯比其他組鮮明（圖2）。與此同時，細胞的彈性系數(shù)下降以示細胞的彈性增加（圖3）。電子顯微鏡下，隨IFN-β的含量及作用時間的增加，胞突數(shù)量隨其逐漸增加，細胞連接也隨其增加（圖4、圖5）。

圖1　免疫熒光（1∶200）下各組細胞形態(tài)

圖2　原子力顯微鏡（4.972 μm）下各組細胞形態(tài)

圖3　實驗組與對照組細胞彈性系數(shù)

圖4　電子顯微鏡下（1∶500）各組細胞形態(tài)（48 h）

圖5　透射電鏡下IFN-β不同含量及不同作用時間與細胞形態(tài)的關系

2.2IFN-β對AS的增殖影響 細胞OD值與活細胞數(shù)及細胞增長均呈正比。四甲基偶氮唑鹽比色法顯示對于IFN-β作用后的AS增長沒有明顯的影響，同時各組OD值差異無統(tǒng)計學意義（圖6）。在102U/ mL與103U/ mL IFN-β影響24 h后2組AS 的OD值差異無統(tǒng)計學意義（P=0. 351）。在102U/ mL與103U/ mL IFN-β影響48 h后2組AS的OD值差異無統(tǒng)計學意義（P=0.407）。在102U/ mL與103U/ mL IFN-β影響72 h后2組AS的OD值差異無統(tǒng)計學意義（P=0.572，表1）。

表1　實驗組與對照組OD值（±s）

表1　實驗組與對照組OD值（±s）

組別　24 h　48 h　72 h對照組　0.168±0.042　 0.199±0.014　 0.213±0.003 102U/ mL組　0.163±0.045　 0.195±0.021　 0.219±0.012 103U/ mL組　0.184±0.005　 0.199±0.011　 0.219±0.003

2.3IFN-β對AS彈性蛋白及細胞結(jié)構(gòu)蛋白的影響在IFN-β作用后AS的細胞結(jié)構(gòu)和彈性連接蛋白表達增強（圖7）。IFN-β促進了4種蛋白的表達，表現(xiàn)為劑量及時間依賴（圖8）。以103U/ mL作用72 h時效能最佳（與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01）。

圖6　細胞光密度曲線

圖7　蛋白印跡法觀察IFN-β不同含量及時間的細胞結(jié)構(gòu)及彈性連接蛋白變化

圖8　IFN-β不同含量及不同作用時間與4種蛋白表達的關系

3　討論

近年來，AS作為CNS中數(shù)量最多的細胞受到了研究者們越來越多的關注。隨著認識不斷深入，研究表明，在中樞系統(tǒng)免疫疾病中，除了效應T細胞，AS也扮演了重要角色［9-10］。AS可以形成一個三維控制架構(gòu)，執(zhí)行中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)遞質(zhì)的新陳代謝及神經(jīng)興奮傳導，以此來維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)。通常情況下，AS處于靜止狀態(tài)；當機體處于感染、缺血、缺氧、腦外傷時，AS將發(fā)生形態(tài)及結(jié)構(gòu)的改變，如GFAP染色增強、胞突增加、新陳代謝加快及大量分泌細胞因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子，此現(xiàn)象稱之為膠質(zhì)細胞增生。損傷和變性的神經(jīng)元被激活的AS包裹，有利于重塑和修復損傷區(qū)域的中樞神經(jīng)。AS投放神經(jīng)營養(yǎng)因子對于小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生作用以此來修復髓鞘［11-12］。

本實驗通過不同方法來觀察細胞形態(tài)、增殖、激活、細胞連接和細胞彈性，探索IFN-β對細胞彈性、結(jié)構(gòu)和細胞連接與AS的關系。結(jié)果顯示，IFN-β可通過對AS的影響起到對MS的治療效果。原因可能為對細胞骨架的重構(gòu)作用，并非是對AS形態(tài)學及增殖的影響。同時，GFAP染色的增色反應可能與IFN-β的含量及作用時間呈正相關。IFN-β作用晚期AS活化程度增加引起細胞膠質(zhì)增殖過多引起膠質(zhì)瘢痕，從而影響治療效果。

試管內(nèi)高含量的AS培養(yǎng)是該實驗的關鍵。在本實驗中，用出生1～2 d的SD鼠的大腦皮質(zhì)分離出AS，并以傳統(tǒng)方法對AS做了原代細胞培養(yǎng)。腦膜的AS處于分裂期的峰值，更易于分離獲得。震蕩提純第10天的增殖細胞可提高培養(yǎng)AS的純度［13］。原代AS被GFAP染色，結(jié)果顯示絕大部分的表現(xiàn)為GFAP染色強陽性，這一結(jié)果支持了培養(yǎng)細胞中基本為AS。

AS的細胞形態(tài)和表面結(jié)構(gòu)在IFN-β作用后置于熒光顯微鏡及原子力顯微鏡下觀察，結(jié)果顯示隨劑量與持續(xù)時間的增長，GFAP表達隨之增強，表明AS活化作用隨IFN-β含量及持續(xù)時間增強，細胞形態(tài)沒有明顯變化，但細胞的彈性纖維及細胞的完整性、靈活性均增加了。電子顯微鏡及透射電鏡下，細胞的聯(lián)系變得更緊密了，這在細胞的信息遞導、信號傳導及抗原提呈上起到了作用。

實驗設計用于探查IFN-β處理下AS存留及增殖的程度，結(jié)果顯示細胞增長的態(tài)勢沒有明顯改變。但是一些研究表明，IFN-β不僅可提升AS的增殖，而且可通過抑制神經(jīng)生長因子來抑制AS的增殖［14-15］。因此，長期培養(yǎng)需明確IFN-β對AS增殖的影響。

原子力顯微鏡下，可觀察楊氏模量，細胞的彈性隨IFN-β的含量及作用時間增加而增長。這一結(jié)果證明了IFN-β在提高AS的彈性及韌性上起到了關鍵作用。

對于全細胞蛋白的蛋白質(zhì)組分析顯示構(gòu)成AS骨架的一些蛋白質(zhì)如GFAP、β-肌動蛋白、波形蛋

白、絲切蛋白-1和抑制蛋白-1起到了關鍵作用［15］。

絲切蛋白是一種主要的肌動蛋白聚合蛋白，由磷酸化或去磷酸化作用，調(diào)節(jié)高度保守的絲氨酸殘基的活性。這種磷酸化，可抑制蛋白質(zhì)的活性，影響肌動蛋白的親和力。另一種肌動蛋白結(jié)合蛋白抑制蛋白-1，具有催化肌動蛋白單體耦合二磷腺苷與三磷腺苷的轉(zhuǎn)換，從而激活G-肌動蛋白的活力［17-18］。抑制蛋白-1在信號轉(zhuǎn)導通路及微絲動力學方面都有著重要的作用，它也可以結(jié)合單體肌動蛋白，從而抑制或促進微絲組裝，與絲切蛋白-1具有協(xié)同作用［19］。

本實驗對IFN-β影響AS骨架蛋白進行研究，即GFAP、β-肌動蛋白、波形蛋白、絲切蛋白-1、抑制蛋白-1，實驗結(jié)果顯示，IFN-β可使AS中上述蛋白表達增加，表明IFN-β對AS細胞彈性及韌性的增強都具有重要的作用［20-21］。國外研究顯示，實驗性變態(tài)反應性腦脊髓炎模型中可見AS中肌動蛋白受損、細胞骨架破壞、細胞彈性下降［22］。因此，考慮IFN-β可能通過對AS的細胞彈性及細胞結(jié)構(gòu)方面的影響，進而對MS起到治療作用。

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·臨床研究·

The impact of interferon-β on morphology and protein expression of astrocytes

YAN Xiaobo1，LI Chenye2，WANG Shuang1，XUAN Mingwen3
（1. Department of Neurology，the Second Affiliated Hospital，Harbin Medical University，Harbin Heilongjiang 150086，China；2. Department of Cadre Ward，the Second Affiliated Hospital，Harbin Medical University，Harbin Heilongjiang 150086，China；3. Department of Neurology，the Fourth Affiliated Hospital，Harbin Medical University，Harbin Heilongjiang 150086，China）

［Abstract］Objective To investigate the role of interferon-beta（IFN-β）at different times，impact the astrocytes（AS）cultured in vitro on cell growth state，cell morphology，cell connections and cell cytoskeleton-elasticity associated with protein expression. Methods To divide the cultured AS in vitro into control and experimental groups，and the experimental groups were divided into six groups according to different content of IFN-β（102U/ mL and 103U/ mL）at different times for 24 h，48 h，and 72 h. To identify AS and observe the changes in cell morphology by immune of luorescence，the cell morphology was using by atomicforce microscope，the cell junction by electron microscopy and the cell growth was assayed by MTT and analyse the expression of cytoskeletonelasticity associated with protein，including glial fibrillary acidic protein（GFAP），β-actin，cofilin-1，Profilin-1，vimentin，by western blot. Results On the effect of different content IFN-β at different times，there’s little significant changes of the shape and the number of AS，but there is a obvious increase in the cell content sand the expression cytoskeleton-elasticity associated protein. Conclusion IFN-β can enhance the flexibility and toughness of AS，and make the connections of AS more closely. That is important in the central nervous system（CNS）to maintain the blood-brain barrier permeability and prevent the CNS from demyelination. At the same time，IFN-β doesn’t make the number of AS increase，but the expression of GFAP increased，which suggests the proliferation of AS，sothat it is may form the glial scar to reduce the effect of IFN-β on MS.

［Key words］Multiple sclerosis；Interferon-β（IFN-β）；Astrocytes（AS）；Associated protein；Central nervous system（CNS）

［中圖分類號］R730. 264

［文獻標志碼］A

［文章編號］2095-3097（2016）02-0081-07

doi：10. 3969/ j. issn. 2095-3097. 2016. 02. 005

［基金項目］黑龍江省自然基金（D201213）

收稿日期：（2016-01-29 本文編輯：馮 博）