王月囡

（鞍山師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，遼寧鞍山　114007）

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保加利亞乳桿菌增殖培養(yǎng)基的優(yōu)化研究

王月囡

（鞍山師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，遼寧鞍山114007）

摘要：通過研究保加利亞乳桿菌在優(yōu)化MRS培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基的增菌效果，進(jìn)一步采用正交試驗(yàn)優(yōu)化篩選保加利亞乳桿菌L.b- 1.1480的增殖培養(yǎng)基。試驗(yàn)結(jié)果表明，在MRS培養(yǎng)基中添加0.6%果糖、0.4%蛋白胨、0.08%ZnSO4時(shí)，保加利亞乳桿菌菌體數(shù)為4.05×108CFU/mL；在優(yōu)化MRS液體培養(yǎng)基中添加7.5%番茄汁、2.5%平菇汁、1.0%綠豆芽汁、4.0%啤酒時(shí)，保加利亞乳桿菌菌體數(shù)達(dá)到最高為7.82×108CFU/mL，較優(yōu)化前的1.16×108CFU/mL提高了6.74倍，終點(diǎn)pH值為4.03。

關(guān)鍵詞：保加利亞乳桿菌；促生長(zhǎng)物質(zhì)；增殖培養(yǎng)基

保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）是一種乳酸菌類益生菌，是人體腸道中的重要微生物［1-2］。乳酸菌能賦予食品柔和的酸味和香氣，改進(jìn)食品的品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)，還具有維持微生態(tài)環(huán)境、抗突變、抗腫瘤、降血脂和提高免疫力等重要功能［3］，因此一直是食品界、醫(yī)藥界和微生態(tài)學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)。

近年來，隨著人民生活水平的提高和健康意識(shí)的增強(qiáng)，我國(guó)發(fā)酵乳制品工業(yè)迅猛發(fā)展［4］。牛乳是國(guó)際公認(rèn)幾乎全價(jià)的理想食品，酸奶以其獨(dú)特的風(fēng)味和特有的保健功能越來越受到人們的喜愛，酸奶產(chǎn)量正以每年25%的速度遞增［5］，這對(duì)酸奶發(fā)酵劑的品質(zhì)、特性、種類提出了新的要求。目前，一些企業(yè)已開始使用國(guó)外進(jìn)口的凍干酸奶發(fā)酵劑，但凍干菌種價(jià)格昂貴，國(guó)產(chǎn)凍干菌活菌含量較低。要提高凍干菌活菌數(shù)，必須提高凍干菌懸液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，培養(yǎng)基中生長(zhǎng)因子的選擇添加是其基礎(chǔ)和關(guān)鍵［6-7］。因此，根據(jù)我國(guó)國(guó)情和資源優(yōu)勢(shì)，積極尋求來源廣泛、經(jīng)濟(jì)易得的廉價(jià)原料，優(yōu)化篩選適合乳酸菌大量生長(zhǎng)的增殖培養(yǎng)基，是實(shí)現(xiàn)我國(guó)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)濃縮型乳酸菌發(fā)酵劑的重要研究課題之一。

本研究以保加利亞乳桿菌為研究對(duì)象，根據(jù)乳酸菌生長(zhǎng)增殖的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)需要，對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基成分中的氮源、碳源、無機(jī)鹽及增殖因子進(jìn)行選擇，并運(yùn)用正交分析方法對(duì)各成分的配比進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳培養(yǎng)基，為保加利亞乳桿菌活菌制劑產(chǎn)品的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1材料與儀器

1.1.1菌種

保加利亞乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）L.b- 1.1480，購(gòu)于中科院微生物研究所。

1.1.2培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基采用10%脫脂乳，種子和傳代培養(yǎng)基采用MRS液體培養(yǎng)基。

酪蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，牛肉膏10 g，葡萄糖5 g，乙酸鈉5 g，吐溫80 1 g，檸檬酸氫二胺2 g，磷酸氫二鉀0.2 g，七水硫酸鎂0.2 g，一水硫酸錳0.05 g，蒸餾水1 000 mL，pH值6.2～6.4，于121℃條件下滅菌20 min；計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加1.8%瓊脂。

1.1.3生長(zhǎng)因子的制備

（1）番茄汁的制備［8］。將新鮮番茄洗凈，用組織搗碎機(jī)搗碎榨汁，加1倍的水浸泡洗滌1次，經(jīng)過濾，將2次濾液混合，置于冰箱備用。

（2）平菇汁的制備［9］。取鮮平菇200 g，切碎后加400 mL蒸餾水煮沸5 min，移入組織搗碎機(jī)搗碎，用3層紗布過濾，濾液即為平菇汁，備用。

（3）綠豆芽汁的制備［8］。將新鮮綠豆芽去根后洗凈，加等量水煮沸30 min，用組織搗碎機(jī)搗碎，過濾后離心10 min，分裝于瓶中，置于冰箱中備用。

（4）啤酒。啤酒放氣后置于冰箱中備用。

1.1.4主要儀器設(shè)備

PB- 10型數(shù)字酸度計(jì)，DHP- 120型恒溫培養(yǎng)箱，PHX- 150H型智能生化培養(yǎng)箱，T6新世紀(jì)型普析紫外分光光度計(jì)，YXQ- LS- 30SII型全自動(dòng)立式電熱壓力蒸汽滅菌器，CJ- 1S型潔凈工作臺(tái)，PL2002型電子天平。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1斜面種子活化

取斜面貯藏菌株接種于新鮮斜面，于37℃條件下培養(yǎng)。

1.2.2種子培養(yǎng)

取1～2環(huán)活化的斜面種子接入裝有100 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于37℃條件下靜置培養(yǎng)24 h。

1.2.3增殖培養(yǎng)

以1%的接種量將種子液接入裝有100 mL增殖培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于37℃條件下培養(yǎng)16 h。

1.2.4乳酸菌活菌計(jì)數(shù)

取1 mL增殖培養(yǎng)液加入到9 mL無菌生理鹽水中，依次做10倍系列稀釋，選取3個(gè)適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)，吸取1 mL稀釋液注入無菌培養(yǎng)皿中，傾注法加入15 mL左右的計(jì)數(shù)培養(yǎng)基混勻，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行培養(yǎng)皿。待培養(yǎng)基凝固后，于30℃條件下倒置培養(yǎng)24 h。選取菌落數(shù)在30～300 CFU/mL的培養(yǎng)皿進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.2.5菌體質(zhì)量分?jǐn)?shù)（OD600）測(cè)定

采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定，波長(zhǎng)600 nm，增殖培養(yǎng)液稀釋至合適倍數(shù)，以相應(yīng)增殖培養(yǎng)基為空白。

1.2.6pH值的測(cè)定

采用PB- 10型數(shù)字酸度計(jì)直接檢測(cè)。

1.2.7生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

菌種經(jīng)活化擴(kuò)培后，按1%接種量接種于優(yōu)化的增菌培養(yǎng)基中，于37℃條件下培養(yǎng)，每2 h進(jìn)行1次活菌計(jì)數(shù)，同時(shí)測(cè)定發(fā)酵液的pH值及OD600值，以便更準(zhǔn)確地掌握其生長(zhǎng)情況。

以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、相應(yīng)的活菌數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線，同時(shí)測(cè)定增菌培養(yǎng)基中pH值的變化。

1.3不同碳源、氮源、無機(jī)鹽的選擇

依據(jù)基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加0.5%蔗糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖作為碳源；添加1%蛋白胨、氯化銨、硫酸銨作為氮源；分別添加0.1%硫酸鋅作為無機(jī)鹽，其他組分均相同。在培養(yǎng)基中接入保加利亞乳桿菌，于37℃條件下靜置培養(yǎng)16 h，平板計(jì)數(shù)測(cè)定菌體質(zhì)量分?jǐn)?shù)，比較其對(duì)保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)的影響。

1.4增殖因子對(duì)保加利亞乳桿菌的影響

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入增殖因子（番茄汁、平菇汁、綠豆芽汁、啤酒），并依次按1%，2.5%，4.0%，5.5%，7.0%進(jìn)行添加，培養(yǎng)16 h后測(cè)定培養(yǎng)液pH值、OD600值和活菌總數(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)曲線的確定

了解L.b- 1.1480在MRS優(yōu)化培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)過程，從而掌握發(fā)酵最適收獲期，并進(jìn)行生長(zhǎng)曲線測(cè)定。以2%的接種量，于37℃條件下恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，間隔2 h測(cè)定菌液的OD600值及pH值，間隔4 h測(cè)定菌液的活菌數(shù)，可得結(jié)果繪制生長(zhǎng)曲線和pH值變化曲線。

保加利亞乳桿菌L.b- 1.1480菌株在MRS優(yōu)化培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基中OD600值的變化曲線見圖1，保加利亞乳桿菌L.b- 1.1480在MRS優(yōu)化培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線見圖2。

圖1　保加利亞乳桿菌L.b- 1.1480菌株在MRS優(yōu)化培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基中OD600值的變化曲線

由圖1和圖2可知，在MRS優(yōu)化培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基中，保加利亞乳桿菌L.b- 1.1480延遲期較短，迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體生長(zhǎng)速率和酸度上升速率同時(shí)加快，培養(yǎng)至16 h，基質(zhì)OD600值和活菌數(shù)均達(dá)到最高，活菌數(shù)分別為1.16×108CFU/mL和7.46×108CFU/mL，之后進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，OD600值和活菌數(shù)趨于平穩(wěn)。因此，L.b- 1.1480的最適收獲期應(yīng)為16 h。

圖2　保加利亞乳桿菌L.b- 1.1480在MRS優(yōu)化培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線

2.2添加不同的生長(zhǎng)因子對(duì)L.b- 1.1480的影響

MRS培養(yǎng)基中添加不同生長(zhǎng)因子對(duì)保加利亞乳桿菌L.b- 1.1480生長(zhǎng)的影響見表1。

表1　MRS培養(yǎng)基中添加不同生長(zhǎng)因子對(duì)保加利亞乳桿菌L.b- 1.1480生長(zhǎng)的影響

由表1可知，果糖、蛋白胨、硫酸鋅對(duì)保加利亞乳桿菌的增菌效果最佳，根據(jù)進(jìn)一步試驗(yàn)確定果糖、蛋白胨、硫酸鋅的最佳添加量。

MRS培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的生長(zhǎng)因子對(duì)L.b- 1.1480生長(zhǎng)的影響見表2。

表2　MRS培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的生長(zhǎng)因子對(duì)L.b- 1.1480生長(zhǎng)的影響

由表2可知，L.b- 1.1480在以0.5%～0.6%果糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為碳源、0.4%～0.6%的蛋白胨為氮源、0.08% ～0.10%的硫酸鋅為無機(jī)鹽時(shí)生長(zhǎng)較好，更好地被L.b- 1.1480利用，因此確定L.b- 1.1480最佳碳源為0.5%～0.6%果糖，最佳氮源為0.4%～0.6%的蛋白胨，最佳無機(jī)鹽為0.08%～0.10%的硫酸鋅。

2.3增殖因子最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定

不同增殖因子對(duì)保加利亞乳桿菌L.b- 1.1480生長(zhǎng)的影響見表3。

表3　不同增殖因子對(duì)保加利亞乳桿菌L.b- 1.1480生長(zhǎng)的影響

由表3可知，番茄汁、平菇汁、綠豆芽汁和啤酒對(duì)L.b- 1.1480的生長(zhǎng)均具有促進(jìn)作用。平菇汁的促生長(zhǎng)作用較為明顯，活菌數(shù)達(dá)5.30×108CFU/mL，較對(duì)照組MRS培養(yǎng)基活菌數(shù)提高了3.31倍，而加入其余3種生長(zhǎng)因子的活菌數(shù)，也較對(duì)照組活菌數(shù)分別提高了3.04倍和2.96倍。根據(jù)進(jìn)一步試驗(yàn)，確定平菇汁、綠豆芽汁、番茄汁和啤酒的最佳添加量。

2.4增殖因子保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)L.b- 1.1480的影響

2.4.1番茄汁的添加量

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的番茄汁對(duì)保加利亞乳桿菌L.b-1.1480生長(zhǎng)的影響見表4。

表4　不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的番茄汁對(duì)保加利亞乳桿菌L.b- 1.1480生長(zhǎng)的影響

由表4可知，當(dāng)加入番茄汁的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%時(shí)，OD600值最大，平板計(jì)數(shù)測(cè)得的活菌數(shù)為5.18× 108CFU/mL。

2.4.2平菇汁添加量

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的平菇汁對(duì)保加利亞乳桿菌L.b-1.1480生長(zhǎng)的影響見表5。

表5　不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的平菇汁對(duì)保加利亞乳桿菌L.b- 1.1480生長(zhǎng)的影響

由表5可知，當(dāng)加入平菇汁的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.0%時(shí)，吸光度最大，平板計(jì)數(shù)測(cè)得的活菌數(shù)為5.35×108CFU/mL。

2.4.3綠豆芽汁的添加量

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的綠豆芽汁對(duì)保加利亞乳桿菌L.b- 1.1480生長(zhǎng)的影響見表6。

表6　不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的綠豆芽汁對(duì)保加利亞乳桿菌L.b- 1.1480生長(zhǎng)的影響

由表6可知，當(dāng)加入綠豆芽汁的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%時(shí)，吸光度最大，平板計(jì)數(shù)測(cè)得的活菌數(shù)為5.70×108CFU/mL。

2.4.4啤酒的添加量

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的啤酒對(duì)保加利亞乳桿菌L.b-1.1480生長(zhǎng)的影響見表7。

表7　不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的啤酒對(duì)保加利亞乳桿菌L.b- 1.1480生長(zhǎng)的影響

由表7可知，當(dāng)加入啤酒的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%時(shí)，吸光度最大，平板計(jì)數(shù)測(cè)得的活菌數(shù)為5.81× 108CFU/mL。

2.4.5增殖培養(yǎng)基的正交優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以在改良MRS液體培養(yǎng)基中添加番茄汁（A）、平菇汁（B）、綠豆芽汁（C）、啤酒（D）為4個(gè)因素，每個(gè)因素3個(gè)水平為A（%）：1（5），2（7.5），3（10）；B（%）：1（2.5），2（5），3（7.5）；C（%）：1（1），2（2.5），3（4）；D（%）：1（1），2（2.5），3（4），采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)配制9種培養(yǎng)基，優(yōu)化L.b- 1.1480增殖培養(yǎng)基。將活化后的L.b- 1.1480按1%的接種量加入上述生長(zhǎng)培養(yǎng)基，于37℃左右條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

保加利亞乳桿菌L.b- 1.1480增殖培養(yǎng)基正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理見表8。

由表8極差R大小可知，影響菌液活菌數(shù)的主要因素主次順序?yàn)锳＞C＞B＞D，即番茄汁添加量的增菌效果最顯著，其余因素的影響大小依次為綠豆芽汁、平菇汁和啤酒的添加量。通過對(duì)表8的直觀分析，可得出增殖因子的最優(yōu)組合為A2B1C1D3。因此，確定增殖因子的最佳組合為7.5%番茄汁+ 2.5%平菇汁+ 1.0%綠豆芽汁+ 4.0%啤酒，以此作為增殖因子的添加量。

表8　保加利亞乳桿菌L.b- 1.1480增殖培養(yǎng)基正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理

3　結(jié)論

本試驗(yàn)確定了保加利亞乳桿菌L.b- 1.1480 MRS優(yōu)化培養(yǎng)基的主要營(yíng)養(yǎng)組分為蔗糖、蛋白胨和ZnSO4，添加量分別為0.6%蔗糖，0.4%蛋白胨和0.08%ZnSO4。同時(shí)考察了增殖因子對(duì)保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)的影響，影響菌液活菌數(shù)的主要因素主次順序?yàn)锳＞C＞B＞D，即番茄汁、綠豆芽汁、平菇汁和啤酒的添加量，L.b- 1.1480最佳增殖因子為7.5%番茄汁、2.5%平菇汁、1.0%綠豆芽汁和4.0%啤酒。同時(shí)，測(cè)定其最佳培養(yǎng)時(shí)間分別為16 h，保加利亞乳桿菌活菌數(shù)達(dá)到7.82×108CFU/mL，是基礎(chǔ)培養(yǎng)基的6.74倍，培養(yǎng)液的終點(diǎn)pH值為4.03，基本達(dá)到了保加利亞乳桿菌高密度培養(yǎng)的要求，為保加利亞乳桿菌產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)提供了理論和實(shí)踐依據(jù)。

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Research on the Enhance of Lactobacillus bulgaricus Enrichment Culture Medium

WANG Yuenan
（School of Chemistry and Life Science，Anshan Normal University，Anshan，Liaoning 114007，China）

Abstract：Studies on the growth of Lactobacillus bulgaricus cultured in improving MRS and enrichment culture medium. Furthermore，the optimum enrichment medium of L.b- 1.1480 are screened by orthogonality test. The results show when adding fructose 0.6%，peptone 0.4%，ZnSO40.08%，the cell density of L.b- 1.1480 is 4.05×108CFU/mL. When adding tomato juice 7.5%，mushroom juice 2.5%，mungbean sprout juice 1.0%，beer 4.0%in improving MRS，the cell density of L.b- 1. 1480 is 6.74 times increased from 1.16×108CFU/mL to 7.82×108CFU/mL，and the destination pH is 4.03.

Key words：Lactobacillus bulgaricus；growth- stimulated substance；enrichment culture medium

中圖分類號(hào)：TS201.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

doi：10.16693/j.cnki.1671- 9646（X）.2016.05.003

文章編號(hào)：1671- 9646（2016）05a- 0007- 04

收稿日期：2016- 04- 22

作者簡(jiǎn)介：王月囡（1981—），女，碩士，助教，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與食品生物技術(shù)。